實驗三_單向瓊脂擴散實驗

1、臨床免疫學實驗指導臨床免疫學實驗指導 檢驗醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院 免疫學教研室免疫學教研室吳榮泉吳榮泉1303609532613036095326 實驗二、實驗二、 單向瓊脂擴散試驗單向瓊脂擴散試驗【實驗原理實驗原理】 將適量的抗體加入瓊脂內制成免疫瓊脂板，打孔，在孔中將適量的抗體加入瓊脂內制成免疫瓊脂板，打孔，在孔中加入待測抗原，抗原可向四周呈輻射狀擴散，當抗原，抗體在加入待測抗原，抗原可向四周呈輻射狀擴散，當抗原，抗體在比例適宜時形成白色沉淀環(huán)比例適宜時形成白色沉淀環(huán). 沉淀環(huán)直徑與抗原含量成正比沉淀環(huán)直徑與抗原含量成正比。用標準抗血清和已知濃度的抗原（或國際參考品）制成標準用標準抗血清和已知濃

2、度的抗原（或國際參考品）制成標準曲線。通過測定樣品沉淀環(huán)直徑大小，可從標準曲線中讀出抗曲線。通過測定樣品沉淀環(huán)直徑大小，可從標準曲線中讀出抗原的含量。原的含量。本試驗主要用于檢測標本中各種本試驗主要用于檢測標本中各種Ig、補體的含量等，具有高靈、補體的含量等，具有高靈敏性，高特異性特點。敏性，高特異性特點。 【實驗目的與要求實驗目的與要求】 掌握單向瓊脂擴散試驗的原理、操作方法、掌握單向瓊脂擴散試驗的原理、操作方法、 結果分析及臨床應用結果分析及臨床應用 【試劑與器材試劑與器材】 1. 1. 羊抗人羊抗人IgGIgG血清（兔抗人血清，購買）血清（兔抗人血清，購買） 2. 2. 標準參考血清標準

3、參考血清( (標準標準IgGIgG質控物，購買質控物，購買) ) 3. 3. 待檢人血清（待檢人血清（IgGIgG抗原）抗原） 4. pH7.4 0.01M PBS 4. pH7.4 0.01M PBS緩沖液（或緩沖液（或NSNS） 5. 5. 瓊脂粉（制備瓊脂粉（制備1%1%免疫鹽水瓊脂液）免疫鹽水瓊脂液） 6. 6. 載玻片、打孔器、載玻片、打孔器、 3737恒溫箱、濕盒、恒溫箱、濕盒、 可調微量加樣器等可調微量加樣器等用于制作用于制作標準曲線標準曲線【操作注意事項操作注意事項】1. 1. 制備抗體瓊脂板制備抗體瓊脂板 瓊脂溫度必須嚴格控制，溫度瓊脂溫度必須嚴格控制，溫度 太低瓊脂會凝固，

4、太高則會影響抗體的活性太低瓊脂會凝固，太高則會影響抗體的活性2. 2. 加樣孔內的瓊脂應挑干凈加樣孔內的瓊脂應挑干凈，切不可損壞孔的邊，切不可損壞孔的邊 緣，確保每孔的液面基本一致緣，確保每孔的液面基本一致3. 3. 加樣精確加樣精確，不能逸出孔外，否則結果不好觀察，不能逸出孔外，否則結果不好觀察4. 4. 加樣加樣吸取不同每份標本均應更換塑料吸頭吸取不同每份標本均應更換塑料吸頭5. 5. 檢測過程中，標準曲線必須與樣品同步操作檢測過程中，標準曲線必須與樣品同步操作6. 6. 孵育時間應控制在孵育時間應控制在3737，24-4824-48小時，小時，時間太短時間太短 或時間太長會影響沉淀線的形

5、成和清晰度?；驎r間太長會影響沉淀線的形成和清晰度。 【標準曲線的制備標準曲線的制備】由實驗教師由實驗教師 1. 1. 購買標準已知濃度的購買標準已知濃度的 人血清（人血清（IgGIgG抗原）抗原） 購買標準羊抗人（兔抗人）購買標準羊抗人（兔抗人） 抗人抗人IgG-IgG-抗體（抗血清）抗體（抗血清） 2. 2. 制備制備1%1%鹽水免疫瓊脂凝膠板（在反面一角做好標記）鹽水免疫瓊脂凝膠板（在反面一角做好標記） 取瓊脂粉取瓊脂粉1.0g1.0g，加，加NSNS，100ml.100ml.混勻加熱溶解成透明液體，混勻加熱溶解成透明液體， 放放5656，加入標準抗血清，加入標準抗血清1.01.5ml1.

6、01.5ml，混勻，制板，混勻，制板 3. 3. 制板，打孔，孔徑制板，打孔，孔徑3mm3mm，孔距，孔距1.2-1.5cm1.2-1.5cm，打，打5 5個孔。個孔。 4. 4. 加樣：在各孔分別加不同濃度稀釋度人標準血清加樣：在各孔分別加不同濃度稀釋度人標準血清10L10L 110110， 120120， 140140，180180， 1 :160.1 :160. 稀釋稀釋 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg ，6.25mg. 6.25mg. 濃度濃度 5. 5. 保溫反應：將凝膠板放濕盒內，保溫反應：將凝

7、膠板放濕盒內，3737反應反應24h,24h,觀察結果觀察結果. . 6. 6. 用坐標紙制作標準曲線用坐標紙制作標準曲線: :以沉淀環(huán)直徑以沉淀環(huán)直徑（m mm m）為縱坐標為縱坐標; ; 以標準濃度的對數(shù)值（以標準濃度的對數(shù)值（LgLg）為橫坐標繪制標準曲線）為橫坐標繪制標準曲線. .標準曲線與樣品測定結果（實物實拍）標準曲線與樣品測定結果（實物實拍） 測定樣本：測定樣本： 病人血清（病人血清（ 標本標本 1. 25mm， 標本標本 2. 20mm ） 標準曲線制備：標準抗原稀釋標準曲線制備：標準抗原稀釋4 4鐘濃度，預溫鐘濃度，預溫24h24h，沉淀環(huán)直徑數(shù)據(jù)，沉淀環(huán)直徑數(shù)據(jù) 30 m

8、m 30 m m 25 m m 25 m m 20 m m 20 m m 15 m m 15 m m 以沉淀環(huán)直徑為縱坐標，以抗原標準濃度的對數(shù)值（以沉淀環(huán)直徑為縱坐標，以抗原標準濃度的對數(shù)值（Lg） 為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣本測得直徑，查出結果。為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣本測得直徑，查出結果。 沉沉 淀淀 環(huán)環(huán) 直直 徑（毫米）徑（毫米） 4256738 標準抗原稀釋：標準抗原稀釋： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160 相當抗原濃度：相當抗原濃度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L 沉淀環(huán)直徑：沉淀環(huán)直徑： 7mm 6

9、mm 5mm 4mm 3mm Lg值：值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9 【實驗方法實驗方法】 1. 制備制備1.0%免疫鹽水瓊脂液免疫鹽水瓊脂液 取瓊脂粉取瓊脂粉1.0g ，加入，加入100ml. NS，混勻加熱溶解。，混勻加熱溶解。 加熱時用玻棒不斷輕輕攪拌，使成透明液體，放加熱時用玻棒不斷輕輕攪拌，使成透明液體，放56， 加入加入 1 : 2 稀釋的羊（兔）抗人血清稀釋的羊（兔）抗人血清1.25ml，混勻，混勻， 56保溫備用。保溫備用。 2. 制板：制板： 每每2人制作人制作1個凝膠板。個凝膠板。 取清潔玻片

10、一張，在背面一角處標記，用取清潔玻片一張，在背面一角處標記，用5ml或或10ml 刻度吸管刻度吸管 ，每片緩慢滴加，每片緩慢滴加3.5 - 4.0ml瓊脂液，待凝。瓊脂液，待凝。 3. 打孔：打孔： 每玻片打孔兩個，孔徑每玻片打孔兩個，孔徑3mm，孔距，孔距1.0-1.2cm， 用竹簽尖將孔內瓊脂挑出。用竹簽尖將孔內瓊脂挑出。 4. 加樣：加樣： 用用NS將血清稀釋）將血清稀釋）10l血清血清+190l,NS= 1:20 混勻混勻3次，吸出次，吸出10l + 10l NS= 1;40 向瓊脂孔內分別加入向瓊脂孔內分別加入:20:20， 1 : 401 : 40 稀釋血清各稀釋血清各10l 5.

11、 保溫反應：將瓊脂板放濕盒內，保溫反應：將瓊脂板放濕盒內，37溫育溫育24-48h。 6. 測量沉淀環(huán)最大直徑，查標準曲線。測量沉淀環(huán)最大直徑，查標準曲線。 計算：計算：血清血清 IgG (mg/L) =對應的血清對應的血清IgG含量含量（稀釋倍數(shù)）（稀釋倍數(shù)） 以沉淀環(huán)直徑為縱坐標，以抗原標準濃度的對數(shù)值（以沉淀環(huán)直徑為縱坐標，以抗原標準濃度的對數(shù)值（Lg） 為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣本測得直徑，查出結果。為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣本測得直徑，查出結果。 沉沉 淀淀 環(huán)環(huán) 直直 徑（毫米）徑（毫米） 4256738 標準抗原稀釋：標準抗原稀釋： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40，

12、 1 ：80 ， 1 ：160 相當抗原濃度：相當抗原濃度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L 沉淀環(huán)直徑：沉淀環(huán)直徑： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm Lg值：值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9AgAgAgAg【結果計算結果計算】n分別量取各孔樣品沉淀環(huán)的直徑，在標準分別量取各孔樣品沉淀環(huán)的直徑，在標準曲線上查出對應的曲線上查出對應的IgGIgG含量。含量。n待測血清待測血清IgGIgG含量含量(mg/L)(mg/L) IgG mg/L = IgG mg/L = 標準曲線對應結果標準曲線對應結果4 4（稀釋倍數(shù)）（稀釋倍數(shù)）n參考值參考值: : 成人血清成人血清 IgG:IgG: 700-1660