bio-coures-2

1、蛋白質(zhì)（多肽）的合成蛋白質(zhì)（多肽）的合成蛋白質(zhì)的合成化學(xué)合成生物合成由不同氨基酸按一定順序的控制合成蛋白質(zhì)（多肽）的化學(xué)合成由一種或幾種氨基酸聚合或共聚合液相合成法：液相合成法：在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的均相反應(yīng)固相合成法：固相合成法：以不溶性高聚物為載體，盡可能以統(tǒng)一的自動(dòng)化方法在短時(shí)間內(nèi)合成意義和基本步驟意義和基本步驟 多肽的全合成可驗(yàn)證新的多肽結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 為多肽生物合成反應(yīng)機(jī)理提供重要信息 建立模型酶 合成新的多肽藥物 氨基、羧基和側(cè)鏈基團(tuán)的保護(hù) 羧基的活化和形成酰胺鍵的縮合反應(yīng) 重復(fù)上述反應(yīng)以形成更多的酰胺鍵 脫除保護(hù)基團(tuán)，得到最終產(chǎn)物目標(biāo)多肽氨基酸之間反應(yīng)的復(fù)

2、雜性氨基酸之間反應(yīng)的復(fù)雜性DCC：N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（N,N-dicyclohexylcarbodiimide）對(duì)暫時(shí)勿需參與反應(yīng)的活性基團(tuán)的保護(hù)和對(duì)參與形成酰胺鍵的羧基進(jìn)行活化，是成功合成具有特定氨基酸順序的多肽的兩個(gè)基本條件。保護(hù)基團(tuán)的原則保護(hù)基團(tuán)的原則能與被保護(hù)基團(tuán)結(jié)合除去時(shí)不影響肽鏈氨基的保護(hù)氨基的保護(hù)氨基的親核性很強(qiáng)，其經(jīng)?；?，親核性消失。因此對(duì)游離氨基實(shí)施?；潜Ｗo(hù)氨基的基本方法1. 叔丁氧基羰基(tert-butoxycarbonyl group, 簡(jiǎn)稱t-Boc)t-Boc基團(tuán)可以在溫和的酸性條件下被除去，產(chǎn)物容易分離氨基的保護(hù)氨基的保護(hù)2. 芐氧羰基(carbob

3、enzoxy group, 簡(jiǎn)稱CBz)CBz基在弱酸性條件下比較穩(wěn)定，在催化氫解時(shí)可被除去，產(chǎn)物也容易分離常用的氨基保護(hù)基團(tuán)常用的氨基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)基保護(hù)基縮寫名稱縮寫名稱在以下條件穩(wěn)定在以下條件穩(wěn)定除去條件除去條件t-BocH2/Pd 或堿或堿HBr+CH3COOH 或或CF3COOHCBzCF3COOH 或堿或堿HBr+CH3COOH或或 H2/PdBPoc堿堿CH3COOH+HCOOH,CF3COOH 或或 HBrNa-NH3, H2/Pd, HCl或或 HBr+CH3COOHNH2NH2-H2O常用的氨基保護(hù)基團(tuán)常用的氨基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)基保護(hù)基縮寫名稱縮寫名稱在以下條件穩(wěn)定在以下條件穩(wěn)定

4、除去條件除去條件TosylHBr+CH3COOH 或堿或堿Na-NH3Trityl堿堿H2/Pd 或或CH3COOH(80%)H2/Pd 或或 Na-NH3NH2NH2+醇醇+酸酸溫和堿性條件溫和堿性條件羧基的保護(hù)羧基的保護(hù)氨基酸中的羧基一般是以成鹽（鉀鹽、鈉鹽、三乙胺鹽等，臨時(shí)性）或成酯的方式被保護(hù)。氨基酸甲酯和乙酯是將氨基酸與甲醇或乙醇在鹽酸存在下反應(yīng)制得。氨基酸苯甲醇酯（benzyl ester, 芐酯）：先生成氯亞硫酸酯羧基的保護(hù)羧基的保護(hù)叔丁醇酯（t-butyl ester）的制備一般采用酯交換法保保護(hù)護(hù)基基縮縮寫寫名名稱稱在在以以下下條條件件穩(wěn)穩(wěn)定定除除去去條條件件BzlCF3CO

5、OHH2/Pd或或堿堿（有有副副反反應(yīng)應(yīng)）t-BuH2/PdCF3COOHH2/Pd或或酸酸NH2NH2-H2O或或堿堿（有有副副反反應(yīng)應(yīng)，易易消消旋旋和和肽肽鍵鍵斷斷裂裂）側(cè)基的保護(hù)側(cè)基的保護(hù),-COOH of Glu, AspGlu(OMe)Glu(OBut)Glu(OBzl), Asp(OBzl)-OH of Ser, ThrSer(Bzl)Ser(But)Thr(Bzl)His的咪唑基：His(CBz), His(Tos, 對(duì)甲苯磺酸基)保護(hù)至最后-NH2 of Lys：Tos；在Na-NH3中除去，在催化氫化或HBr/HAc除-NH2的保護(hù)基CBz時(shí)不受影響-SH of Cys：Bz

6、l (Na-NH3中除去); MBzl(對(duì)甲氧芐基，HF、0C、30min除去); Trt(三苯甲基) 羧基的活化羧基的活化正常條件下，氨基酸的羧基和氨基之間不會(huì)自發(fā)形成肽鍵，故兩者必須有一轉(zhuǎn)變?yōu)楦顫姷男问?。由于活化氨基的反?yīng)激烈，且常常產(chǎn)生消旋化，通常將羧基活化。其共同的驅(qū)動(dòng)力為碳原子親電性的加強(qiáng)：由于活化取代基X的負(fù)誘導(dǎo)效應(yīng)，被活化基團(tuán)中原來(lái)的低電子密度進(jìn)一步降低，形成的親電中心允許親核的非離子化氨基對(duì)它進(jìn)行攻擊。合成肽的常規(guī)方法是從C端向N端進(jìn)行肽鍵的形成肽鍵的形成1. 羧基活化法酰氯法實(shí)際中很少應(yīng)用，因?yàn)槿菀滓鸢被嵯狒ㄓ捎谟袃蓚€(gè)親電中心，形成肽鍵時(shí)有等量的副產(chǎn)物解決方法：

7、仍有氨基酸消旋化的問(wèn)題酰基疊氮法優(yōu)點(diǎn)是不易引起氨基酸的消旋化?；B氮在使用和儲(chǔ)存時(shí)易分解活性酯法另一種重要的活性酯活性酯與氨基反應(yīng)形成的酰胺鍵偶聯(lián)劑和肽鍵的形成偶聯(lián)劑和肽鍵的形成偶聯(lián)劑：偶聯(lián)劑：一種能幫助羧基和氨基之間脫水和縮合的試劑碳二亞胺(carbodiimides)：一類偶聯(lián)劑的總稱，結(jié)構(gòu)通式為分子的中心碳原子具有親電性，容易受親核試劑進(jìn)攻，因而碳二亞胺可與各種弱酸加成類似酸酐結(jié)構(gòu)類似酸酐結(jié)構(gòu)碳二亞胺與羧基反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的類酸酐中間產(chǎn)物，可進(jìn)一步發(fā)生三種類型的反應(yīng)碳二亞胺與羧基反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的類酸酐中間產(chǎn)物，可進(jìn)一步發(fā)生三種類型的反應(yīng)由第二分子酸由第二分子酸進(jìn)攻形成酸酐進(jìn)攻形成酸酐（

8、脲）與胺直接反應(yīng)形成酰胺鍵與胺直接反應(yīng)形成酰胺鍵最常用的是N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC):DCC作為偶聯(lián)劑合成二肽的反應(yīng)過(guò)程在溫和反應(yīng)條件在溫和反應(yīng)條件(0 C)下，第二分子氨基酸下，第二分子氨基酸(羧基已被保護(hù)羧基已被保護(hù))與與DCC不發(fā)生作用，但可以不發(fā)生作用，但可以與類酸酐中間產(chǎn)物反應(yīng)，生成肽鍵。與類酸酐中間產(chǎn)物反應(yīng)，生成肽鍵。DCU不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，易與多肽產(chǎn)物分離。不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，易與多肽產(chǎn)物分離。Woodward試劑：本身是一種脫水劑。先在堿的作用下開(kāi)環(huán)，形成一類似于碳二亞胺的活性碳原子：Woodward 試劑的應(yīng)用范圍比DCC小。優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)率高；缺點(diǎn)是容易產(chǎn)

9、生消旋化。多肽合成的策略多肽合成的策略 肽肽鏈鏈逐逐漸漸增增加加法法 片片段段組組合合法法 g-h a-b c-d e-f g-h f-g-h a-b-c-d e-f-g-h e-f-g-h, , a-b-c-d-e-f-g-h a-b-c-d-e-f-g-h 產(chǎn)產(chǎn)率率： 7（81） （8 為多肽中氨基酸殘基數(shù)； 為偶聯(lián)反應(yīng)的平均產(chǎn)率） 3（log28） 保保護(hù)護(hù)基基團(tuán)團(tuán)去去除除 每加入一個(gè)新氨基酸殘基前須除去一個(gè)氨基保護(hù)基 兩個(gè)肽段縮合前，須除去一個(gè)肽段的氨基和另一肽段的羧基保護(hù)基 消消旋旋化化 可能性較小，可用各種偶聯(lián)劑 可能性較大，必須選擇 DCC 等不易引起消旋化的偶聯(lián)劑 對(duì)對(duì)偶偶聯(lián)聯(lián)

10、反反應(yīng)應(yīng)的的要要求求 每一步偶聯(lián)反應(yīng)較易進(jìn)行，但要求高產(chǎn)率 片段多肽之間偶聯(lián)較難進(jìn)行，但對(duì)每一步反應(yīng)產(chǎn)率要求不高 對(duì)合成相對(duì)分子質(zhì)量不大的多肽，兩種方法均可采用；而若合成相對(duì)分子質(zhì)量大的多肽，一般采用片段組合法：合成含有32個(gè)氨基酸殘基的多肽，若要求總產(chǎn)率為30%，對(duì)于片段組合法和逐步增長(zhǎng)法，其每一步的產(chǎn)率分別要求為78%和96%左右。多肽固相合成法多肽固相合成法Merrifield合成法：合成法：所要合成的目標(biāo)多肽的C端氨基酸的羧基（氨基被保護(hù)）以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連；脫除氨基保護(hù)基后，以此氨基酸的氨基為多肽合成的起點(diǎn)，同其它氨基酸（氨基被保護(hù)）已活化的羧基作用形成肽鍵。不

11、斷重復(fù)此過(guò)程，即可得目標(biāo)多肽產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間短易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化蛋白質(zhì)自動(dòng)合成儀無(wú)需溶解（選擇溶劑）和精制中間體缺點(diǎn)適合于合成1520肽；當(dāng)合成肽較大時(shí)，純度不高。常選擇PS為載體，在樹脂的苯基上引入氯甲基，將目標(biāo)多肽的C端羧基與芐氯作用形成芐酯，第二個(gè)氨基酸的氨基用叔丁氧羰基保護(hù)后，以DCC為縮合劑而形成肽鍵。重復(fù)此程序。合成的最后一步，是將樹脂懸浮在無(wú)水三氟乙酸中，通入干燥HBr，即可將多肽從樹脂上解脫，同時(shí)殘存的保護(hù)基也被去掉。多肽固相合成和液相合成的比較多肽固相合成和液相合成的比較羧基遞增方式羧基遞增方式：把氨基酸N端的氨基以共價(jià)鍵連于固相載體，活化其羧基與下一個(gè)氨基酸的氨基縮合。將側(cè)鏈功

12、能基團(tuán)連于固相載體：將側(cè)鏈功能基團(tuán)連于固相載體：i.e.二硝基苯為橋?qū)⒔M氨酸的咪唑基連于固相載體。此法既可以雙向伸長(zhǎng)肽鏈，又有利于肽的環(huán)化（二硫鍵的生成），同時(shí)也可在溫和條件下從載體上裂下肽段。組合合成法合成多肽組合合成法合成多肽組合合成法：組合合成法：由于多肽及蛋白質(zhì)在生命過(guò)程中的特殊作用，特別是在藥物化學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究中，需要獲得大量的不同結(jié)構(gòu)的多肽，以便進(jìn)行結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究和生物活性的篩選。因此，合成單一產(chǎn)物的傳統(tǒng)合成方法已經(jīng)不能滿足要求。近十年來(lái)，化學(xué)家們?cè)诙嚯墓滔嗪铣煞ɑA(chǔ)上，發(fā)展成一種新的多膚組合合成法建立肽庫(kù)。組合合成法合成多肽主要有兩條途徑：并行合成法并行合成法(p

13、arallel synthesis)和均分合成法均分合成法(split synthesis)。前者合成速度較慢，合成容量小，現(xiàn)在已經(jīng)很少應(yīng)用。均分合成法的基本原理基本原理是：每一個(gè)合成步驟分別合成出x組中間體，混合均勻后再平均分成x份，分別延長(zhǎng)一個(gè)結(jié)構(gòu)單元。反應(yīng)產(chǎn)物再混合均分成x份，再延長(zhǎng)一個(gè)結(jié)構(gòu)單元，直至完成全部合成。合成目標(biāo)：合成目標(biāo)：C-端為Ala，其他三個(gè)氨基酸組成為G1u，Phe和Lys的四肽。這種類型的四肽庫(kù)共有異構(gòu)體數(shù)目應(yīng)為3327個(gè)。近年來(lái)，均分法合成多肽的技術(shù)發(fā)展很快?，F(xiàn)在已經(jīng)可以應(yīng)用該技術(shù)同步合成上百萬(wàn)個(gè)多肽分子，并同時(shí)進(jìn)行生物活性篩選。例如應(yīng)用改進(jìn)的均分法成功地合成了五肽庫(kù)。首先將19種氨基酸(由于Cys容易氧化形成交聯(lián)二硫鍵，在該合成中未采用)分別連接在樹脂上，得到19個(gè)樹脂-氨基酸。將其混合均勻并脫除保護(hù)基后，均分成19份，分別與19種氨基酸(氨基和側(cè)鏈必須保護(hù))進(jìn)行縮合反應(yīng)，可以得到1919=361個(gè)樹脂-二肽。重復(fù)上述步驟三次(混合、脫保護(hù)基、均分和與19種氨基酸縮合)，即可合成出195=2,476,099個(gè)樹脂-五肽。在脫除保護(hù)基后，多肽不必從樹脂上分離，即可直接進(jìn)行生物活性篩選與受體分子反應(yīng)。其中與受體分子作用的樹脂-