第四組SDS-PAGE測定酶ppt課件

1、SDS-PAGE測定酶 目錄一、實訓目的二、實訓原理三、實訓資料四、實訓步驟 一、實訓目的掌握SDS-PAGE電泳技術(shù)的原理、凝膠配制等知識可以熟練進展加樣可以正確運用電泳儀二、實訓原理1.SDS-PAGE分別樣品的主要根據(jù)是各種物質(zhì)分子量的差別性。當SDS與各種酶分子結(jié)合后，酶分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超越了其原來的電荷。因此在電泳時，電泳遷移僅取決于分子量大小而與其所帶的電荷無關(guān)。 三、實訓資料1.試劑30丙烯酰胺溶液(Acrylamide-Bis) 配置100mL:29克丙烯酰胺，1克甲叉雙丙烯酰胺，置于250mL燒杯中，向燒杯中參與約80mL的去離子水，充分攪拌溶解，最后定溶100

2、mL，置于棕色瓶4保管。0.5moL/L濃縮膠緩沖液 配置100mL ：6.0克Tris，置于100mL燒杯中，加80mL去離子水攪拌溶解；用HCl調(diào)理pH值到6.8，加水混勻定容至100mL。1.5moL/L分別膠緩沖液 配置100mL :18.2克Tris、置于100mL燒杯中，加80mL去離子水攪拌溶解；用HCl調(diào)理pH值到8.8，加水混勻定容至100mL。5xTris-甘氨酸電極緩沖液 組分濃度0.125moL/L Tris，1.25moL/L Glycine,0.5%(m/v)SDS； 配置1L：15.1克Tris，94克甘氨酸、5克SDS，加水混勻定容至1L，室溫保管10m/v過硫

3、酸銨 配置10mL：1克過硫酸銨溶于l0ml蒸餾水中，臨用前配制。10m/vSDS 配置配置10mL:配置方法同過硫酸銨配置方法同過硫酸銨2x樣品處置液樣品處置液 組分組分100mmol/L Tris-HClPh6.8，4%m/vSDS, 0.2 m/v溴酚蘭溴酚蘭,20%體積倍數(shù)甘油，體積倍數(shù)甘油，2%m/v-巰基乙醇；巰基乙醇； 配置量配置量5mL：?。喝?mol/L Tris-HCl Ph6.80.5mL，SDS 0.2g，溴，溴酚藍酚藍10mg，甘油，甘油1mL，加水溶解定溶至，加水溶解定溶至5mL。小份分裝，。小份分裝，0.5mL一一管，室溫保管。運用前將管，室溫保管。運用前將25L

4、的的-巰基乙醇參與混勻巰基乙醇參與混勻考馬斯亮藍染色液考馬斯亮藍染色液 配置量配置量1000mL：稱取：稱取0.125%考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭R-250 1.25g，250mL甲醇甲醇或乙醇，或乙醇，80mL乙酸，加蒸餾水補足乙酸，加蒸餾水補足1000mL。充分混勻后進展過濾，。充分混勻后進展過濾，搜集濾液備用。搜集濾液備用。脫色液脫色液 7醋酸醋酸蛋白質(zhì)樣品蛋白質(zhì)樣品 46kda的酶的酶其他試劑其他試劑15g/L瓊脂糖溶液封膠用用瓊脂糖溶液封膠用用1x Tris-甘氨酸電極緩沖液配置甘氨酸電極緩沖液配置2.儀器1.電泳儀2.電泳槽及灌膠模具3.電爐4.微量移液器5.燒杯、量筒、搖床等四、實訓步

5、驟1.預(yù)備任務(wù) 將垂直板型電泳安裝的玻璃片洗干凈，晾干，嵌入凹槽中，夾好。將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳安裝，垂直放置在程度臺面上。2.分別膠的制備 按比例取試劑立刻混勻，將混合液，迅速在電泳槽的兩玻璃板之間灌注，留出灌注濃縮膠所需空間梳子的齒長再加0.51cm。用滴管小心地在溶液上覆蓋一層蒸餾水，以隔絕空氣中的氧氣，并使膠面平整。將電泳槽垂直靜置于室溫約1h或更長，待分別膠聚合完全后水封層和凝膠面之間會出現(xiàn)明顯的水膠分界限，傾出覆蓋的水，再用濾紙吸凈殘留水留意勿將濾紙碰到膠面。預(yù)備灌注濃縮膠。3.濃縮膠的制備 在聚合的分別膠上直接灌注濃縮膠，立刻在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子，梳底間

6、隔分別膠至少有0.51cm。 4.樣品的處置 在待測酶樣品中按1:1體積比參與2倍樣品處置液，在100沸水中加熱35min以使酶變性。另外選擇相對分子量大小適宜的規(guī)范蛋白質(zhì)作為參照，并做同樣處置。 5.加樣 待濃縮膠完全聚合后，小心移出梳齒，用電極緩沖液洗滌加樣孔數(shù)次，然后將凝膠固定于電泳安裝上，槽中參與Tris-甘氨酸電極緩沖溶液。必需設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。用微量注射器向凝膠梳孔內(nèi)加樣，動作輕緩、準確、迅速，防止竄孔。 6.電泳 接上電泳儀，上電極接電源的負極，下電極接電源的正極。電泳時，調(diào)理電流至2030mA并堅持電流強度恒定。待藍色的溴酚藍條帶遷移至間隔凝膠下端約1cm時，

7、封鎖電源停頓電泳。 7.剝膠 電泳終了后小心從電泳安裝上卸下玻璃板，將膠取出，留意凝膠的完好性。8.染色和脫色 經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分別的酶樣品可用考馬斯亮藍R250染色。將凝膠完全浸入固定染色液中放搖床上，悄然搖動使染色均勻，染色12h或過夜，至顯出條帶。染液收回，用水洗去凝膠外表染液，加脫色液脫色，需310小時，期間改換多次洗色液至背景無色。9.凝膠保管 可用7%醋酸或20%甘油保管，也可拍照、掃描或脫水制成干膠保管。10、相對分子質(zhì)量的計算 10、相對分子質(zhì)量的計算1電泳相對遷移率的計算 用直尺分別量出規(guī)范蛋白質(zhì)、待測酶區(qū)帶中心以及溴酚藍距分別膠頂端的間隔，按以下公式計算相對遷移率：2規(guī)范曲線繪制 以各規(guī)范蛋白樣品的相對遷移率為橫坐標，其相對分子質(zhì)量Mr的對數(shù)值為縱坐標，在坐標紙上作圖，可擬合繪制一條規(guī)范曲線。3待測酶樣品相對分子質(zhì)量的計算 根據(jù)待測酶樣品的相對遷移率，從規(guī)范曲線上查出其相對分子質(zhì)量的對數(shù)值，再進一步算出酶樣品的相對分子質(zhì)量。分別膠分別膠單位kD150以上：6%；100150：8%；50100：10%；2050：12%；20以下：16%。普通為這個范圍，也可有些許的差別。分別膠制備 12% 10ml)H2O 3.35ml1.5M Tris(PH8.8) 2.5ml10% SDS 0.1mlAcr/Bis 4.0ml10% 過硫酸銨 0.05