病毒轉基因技術原理概述

1、課程背景課程背景l(fā)1980s,1980s, 轉基因技術隨分子克隆技術出現(xiàn)l2003年，我國SFDA批準了全球第一種基因治療藥物“今又生”上市。（State Food and Drug Administration）l2005年，我國SFDA批準了全球第二種基因治療藥物HB101上市。（國家食品藥品監(jiān)督管理局）l2009年12月18日出版的Science雜志將”return of gene therapy”作為年度重大的科學突破之一。l2012年12月歐盟批準地全球第三種基因治療藥物上市。l迄今，多達1900種基因治療臨床試驗方案并正在進行臨床試驗。轉基因技術正成為分子醫(yī)學的一種革命性的技術手段

2、，并已成為治療許多遺傳性和獲得性疾病的潛在希望所在。問題問題l社會公眾對健康需求的增加l生命科學和醫(yī)學研究的推動l對轉基因技術的安全和倫理關注持續(xù)增加。課程內容課程內容l分為理論課與實踐課l轉基因技術概述l病毒轉基因技術原理、純化制備技術和醫(yī)學應用l生物安全l醫(yī)學倫理問題l表達外源基因的復制缺陷型重組腺病毒的構建和鑒定DNA病毒RNA病毒雜合病毒第一章 轉基因技術概述 范雄林范雄林86-27-華中科技大學同濟醫(yī)學院病原生物學系華中科技大學同濟醫(yī)學院病原生物學系研究生高水平課程病毒轉基因技術原理主要內容主要內容l基因轉移方式基因轉移方式l真核細胞的轉基因技術真核細胞的轉基因技術l外源基因表達讀框

3、的構建原理外源基因表達讀框的構建原理 1. 定定 義義l基因轉移基因轉移（gene transfer）: 自然發(fā)生自然發(fā)生l轉基因技術轉基因技術(transgene technology):(transgene technology): 人工利用人工利用2. 常見的基因轉移方式常見的基因轉移方式l轉化轉化(transformation)(transformation)l轉導轉導(transduction )(transduction )l轉染轉染 (transfection)(transfection)現(xiàn)象定義分類用途l轉化轉化 （transformation transformation ）

4、u現(xiàn)象: 肺炎鏈球菌的轉化試驗肺炎鏈球菌的轉化試驗u定義:u分類和應用:自然轉化自然轉化: :感受態(tài)感受態(tài), ,宿主菌種類宿主菌種類 人工轉化人工轉化: : 低溫低溫CaCl2CaCl2、電穿孔、電穿孔小鼠的肺炎鏈球菌的轉化試驗小鼠的肺炎鏈球菌的轉化試驗l轉導轉導(transduction )(transduction )u現(xiàn)象:“U”“U”型管實驗型管實驗 u定義:u分類和應用:普遍性轉導普遍性轉導 局限性轉導局限性轉導局限性轉導l轉染轉染 (transfection)(transfection)u現(xiàn)象: 感染感染(infection)(infection)、病毒感染、病毒感染u定義: 廣義

5、和狹義廣義和狹義u分類和應用:物理化學方法物理化學方法 生物學方法生物學方法( (病毒載體病毒載體) ) 野生型病毒的自然感染、病毒載體轉染和質粒經化學法介導的轉染3. 基因轉移入真核細胞的方法基因轉移入真核細胞的方法l基因轉移入真核細胞的影響因素基因轉移入真核細胞的影響因素 l外源基因轉移入真核細胞的類型外源基因轉移入真核細胞的類型和方法和方法 l構建外源基因的基本要素構建外源基因的基本要素 轉移入原核細胞的影響因素:u限制限制- -修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng)u質粒宿主范圍和相容性質粒宿主范圍和相容性u同源重組與非同源重組同源重組與非同源重組l基因轉移入真核細胞的影響因素基因轉移入真核細胞的影響因素

6、真核與原核細胞具有顯著區(qū)別;外源基因要進入真核細胞，要突破三大障礙; 理想的轉基因技術方法質粒型載體:l物理方法l化學方法l外源基因轉移入真核細胞的類型和方法外源基因轉移入真核細胞的類型和方法l傳統(tǒng)的針頭注射l顯微注射l粒子轟擊l電穿孔l流體動力學l包裹微球l超聲l磷酸鈣法l脂質體法lDEAE-Dxtran法常用的物理方法介導基因轉移物理方法原理材料DNA用量優(yōu)點缺點傳統(tǒng)的針頭注射外力注射器高便宜、簡單、便于應用于臨床效率比較低顯微注射細胞內注射DNA顯微鏡和顯微注射針低適用于細胞水平的研究，不易降解步驟繁瑣，不適用于臨床，專業(yè)技術要求高粒子轟擊高壓氣體使微小的載體加速不同的加速裝置低對靶組織

7、有很高的效率需要很多的設備和步驟電穿孔電脈沖電穿孔儀低高轉染效率未得到廣泛認可流體動力學流體動力學的力量特殊的注射器中等簡單易于使用、轉染效率高組織局限性包裹微球膠囊化的微球包裹DNA中等控制下投遞和釋放制備的質量控制超聲超聲儀超聲超聲儀中等偏低安全、組織損傷小技術不斷發(fā)展、經驗有限l外源基因轉移入真核細胞的類型和方法外源基因轉移入真核細胞的類型和方法病毒顆粒型載體(病毒介導的轉基因技術) u假型病毒載體（復制缺陷性病毒載體）：具有感染性u重組型病毒載體：具有感染性lDNA病毒載體：AdV, AAV,HSV-1,etc.lRNA病毒載體: HIV, etc.l雜合型病毒載體 分類分類DNA病毒

8、載體病毒載體RNA病毒載體病毒載體腺病毒載體腺相關病毒載體單純皰疹病毒載體痘苗病毒載體桿狀病毒載體鼠白血病病毒載體慢病毒載體甲病毒載體仙臺病毒載體優(yōu)點優(yōu)點外源基因容量大(6-36kb);不整合到宿主染色體中，安全性高；宿主范圍廣泛，可感染包括分裂期和靜止期細胞在內的不同類型的人和多種哺乳動物細胞；易于制備和純化,病毒滴度高達 109 pfu/ml外源基因可整合到人細胞基因組中實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達；可感染包括非分裂期細胞在內的多種細胞；載體的免疫原性和毒性低，無致病性，安全性好；病毒滴度高達10 10pfuml，易于制備和純化載體容量大(30kb 50kb),并可同時表達多基因；不能整合到細胞基因組

9、中；宿主范圍廣，包括大量哺乳動物和鳥類的分裂細胞和非分裂細胞，對神經系統(tǒng)有天然的親嗜性，并能在神經元細胞中建立長期穩(wěn)定的隱性感染載體容量大（25kb40kb），并可同時表達多基因；宿主范圍廣，能感染幾乎所有哺乳動物細胞；不會整合到宿主細胞基因組中，安全性好載體容量大(38 kb)，并可同時表達多基因；只能感染昆蟲宿主，在人體細胞內不能復制，生物安全性高且無細胞毒性；外源蛋白的表達水平高達到細胞總蛋白的50插入外源基因的容量相對較大(10kb)；能夠有效整合到靶細胞的基因組中；感染細胞種類廣泛，效率高；病毒滴度較高(106-107pfuml)可將外源基因有效地整合人宿主細胞染色體上；長期穩(wěn)定的表

10、達；可有效地感染受精卵、神經元細胞、干細胞等多種類型的細胞；對分裂期和非分裂期細胞均能感染；不易誘發(fā)宿主免疫反應不易與宿主基因組整合；宿主范圍廣譜，感染哺乳動物及非哺乳動物的細胞系、原代細胞培養(yǎng)物、嗜神經元特性；機體對甲病毒載體自身的免疫反應較低不會與宿主DNA發(fā)生整合，安全性高；宿主細胞廣；可在多種細胞內獲得較強的基因表達缺點缺點潛在產生復制能力的腺病毒；缺乏靶向性；基因表達時間短； 宿主對載體的免疫反應較強載體的容量相對較小(4.5kb)；與宿主染色的整合是一種隨機整合僅能瞬時表達；細胞毒性免疫反應弱；病毒用量大；制備病毒的滴度低表達產物的純化困難隨機性的整合會造成表達的不確定性和潛在致瘤

11、危險性潛在的生物安全性和遺傳毒性轉染效率比較低、甲病毒RNA載體的穩(wěn)定性差、細胞毒性、僅能在體內瞬時表達包裝容量小(3.4kb)；細胞融合毒性；宿主對載體的免疫反應較強不同類型轉基因技術方法的優(yōu)缺點比較轉基因技術方法 優(yōu)點缺點生物學方法（病毒載體介導法）轉染效率高復雜的生產程序適合全身應用 產品的高質量控制具有靶向組織細胞能力高成本機體預存在的免疫力可以干擾載體低溫保存安全問題化學方法易轉染培養(yǎng)細胞難以生產穩(wěn)定產品生產簡單臨床應用少易保存基因大小不受限物理方法基因大小不受限需要特殊設備常ex vivo應用，局部應用高效非特定細胞型l構建外源基因的基本要素構建外源基因的基本要素 u轉錄控制元件u

12、翻譯控制元件u病毒復制包裝信號 復習思考題復習思考題l 影響外源基因進入真核細胞的因素。l 物理、化學和病毒載體轉基因技術的優(yōu)缺點比較。l 不同病毒載體轉基因技術的優(yōu)缺點比較。l 外源基因表達讀框的構建原理。 主要內容主要內容l基因轉移方式基因轉移方式l真核細胞的轉基因技術真核細胞的轉基因技術l外源基因表達讀框的構建原理外源基因表達讀框的構建原理 1. 定定 義義l基因轉移基因轉移（gene transfer）: 自然發(fā)生自然發(fā)生l轉基因技術轉基因技術(transgene technology):(transgene technology): 人工利用人工利用l轉導轉導(transduction )(transduction )u現(xiàn)象:“U”“U”型管實驗型管實驗 u定義:u分類和應用:普遍性轉導普遍性轉導 局限性轉導局限性轉導l轉染轉染 (transfection)(transfection)u現(xiàn)象: 感染感染(infection)(infection)、病毒感染、病毒感染u定義: 廣義和狹義廣義和狹義u分類和應用:物理化學方法物理化學方法 生物學方法生物學方法( (病毒載體病毒載體