酶的高度純化之正負(fù)電荷法

1、酶的高度純化之正負(fù)電荷法第三組 組長(zhǎng)：靳丹彤組員：郭曉麗、彭夢(mèng)、樊立平、劉超、呂莫然 酶的高度純化之正負(fù)電荷法知識(shí)點(diǎn) 1、利用正負(fù)電荷純化的原理 2、按電荷正負(fù)差異法分離的方法 3、各個(gè)技術(shù)的原理及操作（重點(diǎn)）（重點(diǎn)） 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 原理 利用酶分子與雜蛋白所帶正負(fù)電荷多少的不同，在一定條件下，如通電加電極、加有極性的薄膜等，又有同性相斥，異性相吸的原理，于是，酶分子與雜蛋白在介質(zhì)中就會(huì)向不同的方向移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法電場(chǎng)膜分離電場(chǎng)膜分離電滲析離子交換膜電滲析電泳分離電泳分離紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳層析分離層析分離：層析聚焦

2、（按介質(zhì)） 酶的高度純化之正負(fù)電荷法電場(chǎng)膜分離原理 在電場(chǎng)作用下，小分子的帶電物質(zhì)或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)，透過半透膜，從而達(dá)到分離的目的。在半透膜兩側(cè)分別裝上正、負(fù)極。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法電滲析離子交換膜電滲析電場(chǎng)膜分離。酶的高度純化之正負(fù)電荷法 電解（Electrolysis） 是將電流通過電解質(zhì)溶液或熔融態(tài)物質(zhì)，（又稱電解液），在陰極和陽極上引起氧化還原反應(yīng)的過程，電化學(xué)電池在外加電壓時(shí)可發(fā)生電解過程。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法陽膜：只允許陽離子通過陰膜：只允許陰離子通過結(jié)果：陰極室溶液呈？性，陽極室溶液呈？性電滲析電滲析（electrodialysis【ED】）

3、酶的高度純化之正負(fù)電荷法升升 級(jí)級(jí) 版版 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 電滲析與電解不同之處在于：電滲析的電壓雖高，電流并不大，維持不了連續(xù)的氧化還原反應(yīng)所需；電解卻正好相反。思考：電滲析與電解的區(qū)別？思考：電滲析與電解的區(qū)別？ 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 電 滲 析 主 要 用 于 酶 液 或 其 他 帶電 荷 小 分 子 的 分 離，也 可 以 將 凝膠 電 泳 后 的 含 蛋 白 質(zhì) 或 核 酸 等 的 凝 膠 切 開，置 于 中 心 室，經(jīng) 過 電 滲 析，使 帶 電 荷 的 大 分 子 從 凝 膠 中 分 離 出 來 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 電滲析技術(shù)在生活中有著重要應(yīng)用，如化工脫鹽，海

4、水淡化，食品醫(yī)藥，廢水處理，在某些地區(qū)成為飲用水的重要生產(chǎn)方法。 優(yōu)點(diǎn)：具有能量消耗少，經(jīng)濟(jì)效益顯著，裝置和系統(tǒng)應(yīng)用靈活方便，操作簡(jiǎn)便，不污染環(huán)境，裝置使用時(shí)間長(zhǎng)，原水回收率高等優(yōu)點(diǎn)。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 電泳分離定義：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過程稱為電泳（electrophoresis）。利用帶電粒子在電場(chǎng)中泳動(dòng)的方向和泳動(dòng)速率的不同，而使組分分離的技術(shù)過程就是電泳分離。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法電泳分離紙層電泳薄膜電泳薄層電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳區(qū)帶電泳移界電泳穩(wěn)態(tài)電泳按介質(zhì)按原理等速電泳等電聚焦電泳 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 區(qū)帶電泳： 是在一定

5、的支持物上，于均一的載體電解質(zhì)中，將樣品加在中部位置，在電場(chǎng)作用下，樣品中帶正或負(fù)電荷的離子分別向負(fù)或正極以不同速度移動(dòng)，分離成一個(gè)個(gè)彼此隔開的區(qū)帶。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、粉末電泳、凝膠電泳與絲線電泳。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 移動(dòng)界面電泳： 是將被分離的離子（如陰離子）混合物置于電泳槽的一端（如負(fù)極），在電泳開始前，樣品與載體電解質(zhì)有清晰的界面。電泳開始后，帶電粒子向另一極（正極）移動(dòng)，泳動(dòng)速度最快的離子走在最前面，其他離子依電極速度快慢順序排列，形成不同的區(qū)帶。只有第一個(gè)區(qū)帶的界面是清晰的，達(dá)到完全分離，其中含有電泳速度最快

6、的離子，其他大部分區(qū)帶重疊。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 等速電泳： 是在樣品中加有領(lǐng)先離子（其遷移率比所有被分離離子的大）和終末離子（其遷移率比所有被分離離子的?。?，樣品加在領(lǐng)先離子和終末離子之間，在外電場(chǎng)作用下，各離子進(jìn)行移動(dòng)，經(jīng)過一段時(shí)間電泳后，達(dá)到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領(lǐng)先離子與終末離子的區(qū)帶之間。由于沒有加入適當(dāng)?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流，所得到的區(qū)帶是相互連接的（圖d），且因“ 自身校正”效應(yīng)，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法等電聚焦電泳： 等電點(diǎn)？在某一PH的溶液中，氨基酸或蛋白質(zhì)解離成陽離子和陰離

7、子的趨勢(shì)或程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時(shí)溶液的pH成為該氨基酸或蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 等電聚焦電泳： 是將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當(dāng)待分離的酶或其他蛋白溶液泳動(dòng)到其自身特有的等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，泳動(dòng)速度下降到零，具有不同等電點(diǎn)的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點(diǎn)位置，形成一個(gè)個(gè)清晰的區(qū)帶，分辨率極高。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法區(qū)帶電泳移界電泳等速電泳等電聚焦思考思考：PAGE屬于上述哪個(gè)？屬于上述哪個(gè)？ 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 層析聚焦 聚焦層析是將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的技術(shù)。 酶的高度純化之正負(fù)電荷

8、法 層析聚焦 聚焦層析是利用層析過程中固定相偶聯(lián)具有兩性解離功能的有機(jī)分子為配基，與流動(dòng)相中某些具有兩性粒子發(fā)生等電聚焦反應(yīng)而進(jìn)行分離的一種方法。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法 聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動(dòng)相，其流動(dòng)相為 多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法步驟：。（1）加有兩性電解質(zhì)載體的多緩沖溶液流經(jīng)多緩沖離子交換劑形成穩(wěn)定pH梯度。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法步驟： 酶的高度純化之正負(fù)電荷法制作pH69的梯度： （1）使用時(shí)，將多元緩沖劑pH值調(diào)到9（初始pH） （2）將多元緩沖液(pH6-9)調(diào)到7(極限pH) ( 3 )用（2）的溶液淋洗（1）的溶液 酶的高度純化之正負(fù)電荷法步驟：。（2）欲分離的酶液中各個(gè)組分在此系統(tǒng)中會(huì)移動(dòng)聚焦在于其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而是不同等電點(diǎn)的組分分離（1）加有兩性電解質(zhì)載體的多緩沖溶液流經(jīng)多緩沖離子交換劑形成穩(wěn)定pH梯度。 酶的高度純化之正負(fù)電荷法步驟： 酶的高度純化之正負(fù)電荷法制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是：在梯度儀的混合室（這里為層析柱）中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然后打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續(xù)不斷地流過柱體。這時(shí)從柱的上部到下部溶液的PH值