植物基因組大小測量方法課件

1、 植物基因組大小及其測定方法植物基因組大小及其測定方法 報告人：張麗 目錄目錄 1.植物基因組大小 2.決定其大小的因素 3. 測量方法l細胞是不停地進行著維持植物生存所必須的基本代謝活動的生命小宇宙,小宇宙當中的大部分代謝活動受制于細胞核.細胞核是生命賴以維持的基本裝置, 細胞核是攜帶絕大部分遺傳物質（DNA）的主要載體。 植物基因組大小植物基因組大小l估計細胞核內的DNA 含量常用C 值(C-value)描述, DNA C-值指的是一個物種配子核中沒有復制時的DNA 含量，而一個物種的單個染色體組的DNA含量稱為基因組大小。該值對每種生物而言是一個常數(shù)(constont)，且具有種的特征(

2、characteristic)。由于這兩個詞都是以 C 開頭，所以傳統(tǒng)地基因組大小又稱 DNA C-值。l迄今為止, 已建立起含有5150 種植物的DNA C 值數(shù)據(jù)庫包括被子植物、裸子植物、羊齒類、苔蘚類以及藻類等。在被子植物中, 已知最小的基因組發(fā)現(xiàn)于螺旋貍藻(Genlisea maragretae Hutch.), 基因組大小為63 Mb; 最大的基因組為百合科的四倍體貝母(Fritillaria assyriaca Baker.),基因組大小為127Gb , 兩者相差約2000倍。l由此可知，在真核生物中，不同種類的生物的基因組的大小變化范圍非常大。由于真核生物的基因位于 DNA 上，

3、所以人們很自然地就會認為，進化地位越高、結構越復雜的生物需要的基因就越多，因此其基因組中應該含有更多的DNA，即它的基因組就應該越大。l然而，越來越多的觀察表明，這個假定是不成立的。例如百合基因組的大小是重要的糧食作物水稻的 200多倍。所以一種生物的基因組大小同該種生物的結構復雜性或其在進化上所處的地位高低無關，這種現(xiàn)象被稱為 C 值佯謬。 決定因素決定因素lC 值佯謬現(xiàn)象困擾了人們半個多世紀。隨著越來越多的真核生物基因組的測序完成，人們發(fā)現(xiàn)基因組的絕大部分 DNA 序列不是用來編碼蛋白質的，而是以重復序列(主要是轉座元件)為主的非編碼序列。這一發(fā)現(xiàn)在一定程度上解釋了 C 值佯謬現(xiàn)象，l既然

4、重復序列決定了真核生物基因組的大小，那么是什么因素決定了重復序列的產(chǎn)生和積累呢?目前有兩個主要的假說來解釋真核生物基因組中重復序列的積累。l第一個假說是“突變 漂變”模型 (mutation drift models)。這個假說認為基因組中的重復序列是沒有任何用處的，這些 DNA 序列是在隨機的遺傳漂變過程中固定下來，而基因組只是被動地攜帶它們。最終一種生物的基因組大小就是其所能忍受的最大限度。l第二個假說是“適應性(adaptive)”理論，這個假說認為基因組中的重復序列盡管不能編碼蛋白質，但是它們可以直接或者間接地對表型產(chǎn)生影響，進而產(chǎn)生適應性。l根據(jù)這個理論，基因組大小的差異反映的是不同

5、種生物的不同的適應性需求，或者說是作用在不同種生物上的自然選擇效力的差別。l作為以上兩個假說的補充，還有兩個假說也解釋真核生物基因組中非編碼序列的積累，其中之一認為真核生物基因組的大小是由該基因組刪除非編碼DNA 序列的能力決定的。l另外一個假說則把目光集中到了真核生物基因組的主要成分轉座元件身上。由于基因組利用小 RNA 來調控轉座元件擴增的機制被揭示，這個假說認為:轉座元件的轉座(擴增)效率決定著基因組的大小。l盡管至今還沒有任何一種假說能夠完美地解釋基因組中重復序列的積累，但很可能是以上各種假說中所提到的機制綜合作用的結果，決定了真核生物基因組的大小。 意義意義l研究物種的基因組大小(C

6、 值)為以下幾個方面提供理論依據(jù): (1)作為AFLP 引物中選擇性堿基個數(shù)確定的依據(jù), 若基因組較大, 則選擇性堿基相應地增加;l(2)與微衛(wèi)星的擴增效率相關, 主要是由于大的基因組稀釋了靶位點在基因組中所占的比例, 致使引物與靶位點結合的幾率降低; (3)作為細胞核大小、花粉粒直徑等表型的預示值, 基因組大小與細胞核大小、花粉直徑等表型性狀成正相關。 l(4)作為生態(tài)與環(huán)境的預示值, C 值與植物的生活史、地理分布、物候期、單位面積生物量、對生長環(huán)境的敏感度(如溫度和濕度的變化)等緊密相關,還能預測長期的變化(諸如全球變暖)所引起的植被改變; l (5)利用推斷的C 值來揭示古生物學的趨勢

7、,例如, 根據(jù)化石細胞的大小, 可以推斷化石的DNA含量。在植物化石中, 氣孔保衛(wèi)細胞的大小也可以用來估計DNA 含量, 進而尋求C 值的進化趨勢;l(6)C 值對物種保育具有重要的意義, 大基因組的物種往往存在更大的滅絕風險。雖然物種滅絕與基因組大小的關系是否存在還不明確, 但這種關系還是可能存在的。 檢測方法檢測方法l因此，測定植物的基因組大小不僅對于物種本身的細胞遺傳學等研究具有重要意義，而且也為植物的基因組測序、基因組文庫建立以及基因組學及其進化研究提供了不可或缺的基礎資料。目前DNA C 值的檢測方法最常用的主要有流式細胞術和實時熒光定量PCR等兩種方法。l流式細胞術，是利用流式細胞

8、儀對處在快速直線流動狀態(tài)中的單細胞分析技術。是20世紀70年代發(fā)展起來的一項技術，綜合了激光技術、計算機技術、半導體技術、流體力學、細胞化學等各學科知識，它是一種自動分析技術。 功能功能 原理原理l流式細胞儀可在高速液流中對DNA 含量進行測定分析，檢測器捕捉單細胞懸浮液中經(jīng)DNA 特異性染料染色的細胞核被激發(fā)后所發(fā)射的熒光信號，熒光強弱與DNA 含量成正比，熒光信號經(jīng)光電倍增管接受轉換為電信號和可被計算機識別的數(shù)字信號接收，用直方圖進行量化分析，通過與內參比較相對熒光強度從而估測出生物的基因組大小。 過程過程l取材清洗機械破壁離心（1500r/m 5min）棄上清避光4染色(20min) 上

9、機測試軟件分析倍性鑒定及數(shù)據(jù)分析。 注意事項注意事項l用流式細胞儀測定基因組大小，當測定方法和試材差異未被充分考慮時，經(jīng)常會出現(xiàn)同一物種測定的結果不同，甚至同一實驗室使用同一臺儀器對不同批次試材的測定結果也會有所不同。我們在前人工作的基礎上，更加注重材料的內標的選擇及染色時間和系統(tǒng)穩(wěn)定性等影響流式細胞儀測定結果精確性等因素的確定。l但目前國際上還沒有一個統(tǒng)一的測量DNA含量的標準參照物，要進行DNA絕對含量測定，采用不同內標時結果存在誤差，為避免非線性誤差，理想的內標應該選用與待測物種基因組大小相近，但又能夠相互區(qū)分、遺傳穩(wěn)定、基因組大小數(shù)據(jù)可靠且容易獲得足夠樣品的物種。l再次就是取用相同苗齡

10、和相同部位的新鮮幼嫩葉片，不經(jīng)過冷凍和貯藏等環(huán)節(jié)，取材后立即制樣，保證了樣品活性，獲得較完美的峰形圖。此外，需要進行多次重復實驗，始終把變異系數(shù)控制在小范圍之間，最大限度地避免誤差。l實時熒光定量PCR 是在PCR 定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。它是一種在PCR 反應體系中加入熒光基團, 利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 進程, 最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 重要概念重要概念l在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。l基線 是指在PCR擴增反

11、應的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線，l光域值threshold的設定 一般講PCR反應前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，熒光域值設定在PCR擴增的指數(shù)期。lCt值與起始模板的關系 研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。l熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光染料和熒光探針。 S

12、YBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 1.SYBR Green I能結合到雙鏈DNA的小溝部位2.SYBR Green I只有和雙鏈結合后才發(fā)熒光。3.變性時，DNA雙鏈分開，無熒光4.復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBR Green I發(fā)熒光，在此階段來采集熒光信號。 lTaq man熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時同時加入一個特異性熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基因發(fā)出的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，Taq酶的5- 3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)熒光信號的積累與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 優(yōu)點優(yōu)點l實時熒光定量PCR無需內標，實時熒光定量PCR技