分解纖維素的微生物的分離 (2)

1、關(guān)于分解纖維素的微生物的分離 (2)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共31頁一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共31頁 纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過物每年產(chǎn)生的纖維素超過7070億噸，其中億噸，其中40%-60%40%-60%能被能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會(huì)大量積土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會(huì)大量積累。累。 在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生有分共生有分解纖維素的微生物解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖

2、維素，而人沒有分解纖維素的能力。分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共31頁纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共31頁CX酶：酶：內(nèi)切酶，使纖維素?cái)嗔殉善瑪?。?nèi)切酶，使纖維素?cái)嗔殉善瑪?。C1酶：酶：外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個(gè)葡萄糖外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個(gè)葡萄糖 分子，產(chǎn)生纖維二糖分子，產(chǎn)生纖維二糖葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：將纖維二糖分解成葡萄糖。將纖維二糖分解成葡萄糖?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共31頁取二支取二支20mL20mL的試管的試管實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維

3、素的實(shí)驗(yàn) 濾紙崩潰法濾紙崩潰法各加入一張濾紙條各加入一張濾紙條各加入各加入pH4.8pH4.8，物質(zhì)量為，物質(zhì)量為0.1mol/L0.1mol/L的醋的醋酸醋酸鈉緩沖液酸醋酸鈉緩沖液1111mlml和和1010mlml甲甲 乙乙在乙試管中加入在乙試管中加入1 1mLmL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min140r/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h1h結(jié)果：乙試管的濾紙條消失結(jié)果：乙試管的濾紙條消失 討論討論：乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失？甲試管的作用是什：乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失？甲試管的作用是什么？么？現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共31頁提示：提

4、示： 本實(shí)驗(yàn)的本實(shí)驗(yàn)的自變量是纖維素酶的有無自變量是纖維素酶的有無，自變，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會(huì)影響溶液的否則會(huì)影響溶液的pHpH。實(shí)驗(yàn)分析：實(shí)驗(yàn)分析：P P2727的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對照的？的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對照的？現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共31頁 剛果紅剛果紅能與能與纖維素形成紅色復(fù)合物纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種

5、反應(yīng)。解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。 （二）纖維素分解菌的篩選（二）纖維素分解菌的篩選 當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物。當(dāng)。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅- -纖維素的復(fù)纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分以纖維素分解菌為中心的透明圈解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌生透明圈來篩選纖維素分解菌?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共

6、31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共31頁二、實(shí)二、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 設(shè)設(shè) 計(jì)計(jì) 請你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及請你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及“操作提示操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋 將樣品涂布在鑒別纖將樣品涂布在鑒別纖 維素分解菌的培養(yǎng)基上維素分解菌的培養(yǎng)基上 篩選產(chǎn)生透篩選產(chǎn)生透 明圈的菌落明圈的菌落現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共31頁 生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中中纖維素分解菌的含量相對提高纖維素分解菌的

7、含量相對提高，因此從這種土壤，因此從這種土壤中中獲得獲得目的微生物的目的微生物的幾率要高幾率要高于普通環(huán)境。于普通環(huán)境。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共31頁將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm10cm左右的土壤中。左右的土壤中。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共31頁 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁，共31頁培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基成分分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁，共31頁提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，

8、即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照,或者將纖維素或者將纖維素改為葡萄糖。改為葡萄糖。有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。分解纖維素的微生物可以大量繁殖?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁，共31頁將細(xì)菌涂布在只有將細(xì)菌涂布在只有尿素尿素做氮源的選擇做氮源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將細(xì)菌涂布在只有將細(xì)菌涂布在只有纖維素粉纖維素粉做碳源的做碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選

9、菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁，共31頁思考：本實(shí)驗(yàn)的流程與課題思考：本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2 2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？ 本實(shí)驗(yàn)流程與課題本實(shí)驗(yàn)流程與課題2 2的流程的區(qū)別如下。課的流程的區(qū)別如下。課題題2 2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。得到菌落。本課題通過本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。一致。

10、現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁，共31頁101102103104105106現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁，共31頁鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁，共31頁在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，的堿性增強(qiáng)，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入養(yǎng)基中加入酚紅指示劑酚紅指示劑，如，如果果pHpH升高指示劑會(huì)升高指示劑會(huì)變

11、紅變紅剛果紅剛果紅可以與纖維素形成可以與纖維素形成紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的菌為中心的透明圈透明圈觀察菌落周圍是否有觀察菌落周圍是否有著色的著色的環(huán)帶環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈透明圈來篩選纖維素分解菌來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁，共31頁方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗

12、去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能

13、就強(qiáng)！透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！ 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁，共31頁四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。分解纖維素的微生物。 2.2.分離的結(jié)果是否一致分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。結(jié)果。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁，共31頁 為了確定分離得到的是纖維素分解菌，為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行還需要