菌種鑒定方法大全

1、菌種鑒定方法大全一、金開瑞菌種鑒定服務(wù)簡介 在細(xì)菌/真菌的16/18SrDNA中有多個(gè)區(qū)段保守性，根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌/真菌通用引物，擴(kuò)增出細(xì)菌/真菌的16/18SrDNA片。因此，16/18SrDNA可以作為細(xì)菌/真菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。該鑒定手段試用于單種鑒定或者少量混雜菌種鑒定。 金開瑞擁有多種配套的通用菌種鑒定引物，實(shí)驗(yàn)周期短，可以幫您快速實(shí)現(xiàn)菌種鑒定。服務(wù)流程引物設(shè)計(jì)合成PCR擴(kuò)增16/18S rDNA/ITSPCR產(chǎn)物純化測序，序列比對分析客戶提供基因組DNA：要求基因組DNA的濃度100 ng/l，總體積20 l，且無明顯降解；平板或斜面：經(jīng)菌種分離后帶

2、有單菌落的新鮮平板或斜面。最終交付測序結(jié)果，BLAST比對得到細(xì)菌種屬名稱服務(wù)內(nèi)容及說明服務(wù)名稱 服務(wù)周期（工作日）原核生物/16SrDNA5-7真核生物/18SrDNA5-7真菌ITS序列分析 5-7二、菌種鑒定方法介紹（1）常規(guī)鑒定常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和生理生化特征。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)等。（2）BIOLOG碳源自動(dòng)分析鑒定BIOLOG鑒定系統(tǒng)以微生物對不同碳源的利用情況為基礎(chǔ)，檢測微生物的特征指紋圖譜，建立與微生物種類相對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。通過軟件將待測微生物與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結(jié)果。該系統(tǒng)已獲美國FDA認(rèn)可，已逐步應(yīng)用

3、于食品和飲品企業(yè)、環(huán)保、海洋生物/水產(chǎn)品、制藥、農(nóng)業(yè)微生物、生物治理、化妝品、臨床等領(lǐng)域的微生物鑒定試驗(yàn)中。BIOLOG是一種微生物菌種快速鑒定系統(tǒng)，涉及革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、厭氧菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)近2000種微生物。（3）分子生物學(xué)鑒定應(yīng)用分子生物學(xué)方法從遺傳進(jìn)化角度闡明微生物種群之間的分類學(xué)關(guān)系，是目前微生物分類學(xué)研究普遍采用的鑒定方法。CICC擁有微生物菌種分類鑒定的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，配有PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、HPLC、凝膠成像系統(tǒng)、紫外控溫分析系統(tǒng)等先進(jìn)儀器設(shè)備，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析軟件。目前CICC可采用

4、核酸序列分析法分析細(xì)菌16S rDNA/16S-23S rDNA區(qū)間序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及絲狀真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科學(xué)的鑒定結(jié)果。（4）API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)API鑒定系統(tǒng)涵蓋15個(gè)鑒定系列，約有1000種生化反應(yīng)，目前已可鑒定超過600種的細(xì)菌。鑒定過程中，可根據(jù)細(xì)菌所屬類群選擇適當(dāng)?shù)纳砩b定系列，通過軟件將待測細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結(jié)果。CICC目前可應(yīng)用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列對乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）和相關(guān)細(xì)菌、芽孢桿菌（Baci

5、llus sp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）、微球菌屬（Micrococcus sp.）和庫克菌屬（Locuria sp.）進(jìn)行鑒定。（5）功能性分析及功能基因CICC不斷致力于工業(yè)微生物資源的功能及其功能基因研究，目前通過木聚糖酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、-甘露聚糖酶等功能基因的克隆進(jìn)行菌種產(chǎn)酶的功能性分析。應(yīng)用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌種鑒定，在某些種、亞種、株間有較好的分辨效果。（6）RAPD、SSCP技術(shù)隨著微生物菌種應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展，在食品安全管理、生物產(chǎn)品出口認(rèn)證、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等行業(yè)需求日益增加，微生物菌種株水平的鑒別技術(shù)成為一個(gè)迫切

6、需要解決的問題。CICC采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技術(shù)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技術(shù)對微生物菌株進(jìn)行鑒別。如采用RAPD技術(shù)能夠?qū)ν痪N原始菌株與誘變菌株進(jìn)行鑒別，對誘變菌株知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義；采用SSCP技術(shù)進(jìn)行工業(yè)酒精酵母菌株的鑒別，此技術(shù)結(jié)合菌株發(fā)酵特性，在酒類生產(chǎn)的質(zhì)量控制方面起到積極作用。（7）TLC薄層層析CICC將TLC薄層層析技術(shù)應(yīng)用于微生物菌種鑒定，進(jìn)行細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁化學(xué)組分分析（氨基酸、糖），作為劃分

7、屬特征的重要鑒定技術(shù)手段，起到了良好的輔助作用。（8）全細(xì)胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng)采用Sherlock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，通過對不同菌株的脂肪酸圖譜進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，來鑒定細(xì)菌及酵母。該技術(shù)是細(xì)菌或酵母種水平鑒定的有效手段之一。（9）（GC）mol及DNA/DNA雜交CICC通過采用DU800核酸蛋白分析儀測定Tm值，從而得到微生物菌株的（GC）mol，并與模式菌株進(jìn)行DNA/DNA同源性分析，該鑒定技術(shù)手段是多相鑒定的重要組成部分。（10）細(xì)菌呼吸醌組分測定細(xì)菌細(xì)胞膜上的呼吸醌有甲基萘醌（menaquinone，MK）和泛醌（ubiquinone，輔酶Q）。對革蘭氏陽性的放線菌而

8、言，通常只含有甲基萘醌。常用來分析呼吸醌的方法有薄板層析法和高壓液相色譜法等。醌分子中的多烯側(cè)鏈長度及氫飽和度對于細(xì)菌具有重要的分類學(xué)意義。（11）微生物菌群分析（DGGE）DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即變性梯度凝膠電泳，是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。DGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢種類信息并同時(shí)分析多個(gè)樣品，具有可重復(fù)和操作簡單等特點(diǎn)，適合于調(diào)查種

9、群的時(shí)空變化，并且可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。（12）微生物菌群分析（克隆文庫構(gòu)建）當(dāng)微生物菌群中含有不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)菌種，且其豐度較低時(shí)，要全面解析菌群結(jié)構(gòu)及多樣性，只采用傳統(tǒng)的平板分離或PCR-DGGE分析難以達(dá)到理想結(jié)果，這時(shí)可以結(jié)合構(gòu)建16S rDNA 克隆文庫的方法。細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在UV下顯現(xiàn)，從膠上切取DNA條帶，經(jīng)純化后，鏈接到pGEM®-T Easy 載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（Escherichia coli）。待長出白色菌落后，挑選白色菌落進(jìn)行菌落PCR-DGGE（16S rDNA V3）

10、輔助篩選，得到特定菌群中的所有克隆菌，再經(jīng)質(zhì)粒提取，基因測序后，便可得到特定微生物菌群信息。（13）細(xì)菌磷酸類脂分析磷酸類脂（phospholipioides）屬極性脂（polar lipid），與蛋白質(zhì)、糖等構(gòu)成細(xì)胞膜，對于物質(zhì)運(yùn)輸、代謝及維持正常的滲透壓都有重要作用。不同屬菌的磷酸類脂組分是不同的，它是鑒別屬的重要特征之一，是化學(xué)分類項(xiàng)目中不可缺少的分類指征。磷脂種類很多，對于放線菌而言，具有分類學(xué)意義的磷酸類脂有5種：磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline，PC）、磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidylmethyl ethanolamine，PME）、磷脂酰甘油（phosphatidy glycerol，PG）及GluNU（含葡萄糖胺未知結(jié)構(gòu)的磷脂，phospholipid of unknown structure containing glucosamine）。（14）實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是特異性靶基因檢測與定量的一體化系統(tǒng)，其將PCR熱循環(huán)、熒光檢測和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可以動(dòng)態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增加的情況。根據(jù)熒光強(qiáng)度確定PCR產(chǎn)物的定量法主要有熒光染料（SYBR Gre