武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部 膜片鉗安裝培訓(xùn) V

1、 微電極 神經(jīng)元 Patch of cell membrane with ion channelFBR_+AmplifierTechnicalThe high gain operational amplifier isconnected in the circuit so that the currentflowing through the ion channel is measuredas a voltage drop across the feedback resistor(FBR). The FBR has a resistance of 50 G allowing very smal

2、l currents (10-12 A)to be measured.放大器放大器A/D轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換器示波器示波器刺激器刺激器防震臺防震臺顯微鏡顯微鏡微操微操headstage屏蔽網(wǎng)屏蔽網(wǎng)監(jiān)視器監(jiān)視器headstage微操作器微操作器微機(jī)微機(jī)刺激電極刺激電極MultiClamp700B電阻反饋膜片鉗和高速電流鉗放大器電阻反饋膜片鉗和高速電流鉗放大器計算機(jī)控制的微電極放大器計算機(jī)控制的微電極放大器雙電極探頭雙電極探頭MultiClampCommander液接電位調(diào)零液接電位調(diào)零電極電容補(bǔ)償電極電容補(bǔ)償細(xì)胞膜電容細(xì)胞膜電容膜電阻補(bǔ)償膜電阻補(bǔ)償電極電阻補(bǔ)償電極電阻補(bǔ)償Sutter公司公司 MP-225

3、$6,500電動式微操電動式微操美國美國TMC公司公司 內(nèi)爾內(nèi)爾(Neher) 薩克曼薩克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德國細(xì)胞生理學(xué)家）（德國細(xì)胞生理學(xué)家） （德國細(xì)胞生理學(xué)家）（德國細(xì)胞生理學(xué)家） 貼附式貼附式全細(xì)胞記錄模式全細(xì)胞記錄模式負(fù)壓吸負(fù)壓吸內(nèi)面向外式內(nèi)面向外式外面向外式外面向外式拉拉細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞拉并暴露于空氣中拉并暴露于空氣中四種經(jīng)典記錄模式四種經(jīng)典記錄模式 (Cell-attached or On cell mode)Cell-attached configuration電壓鉗電壓鉗(Voltage Clamp) 當(dāng)細(xì)胞膜上的離子通

4、道開放，產(chǎn)生跨膜電流；但是跨膜電流會引起膜電當(dāng)細(xì)胞膜上的離子通道開放，產(chǎn)生跨膜電流；但是跨膜電流會引起膜電位的改變。膜電位的改變一方面會影響離子通道的開放數(shù)量；同時也會影響位的改變。膜電位的改變一方面會影響離子通道的開放數(shù)量；同時也會影響離子流過通道的驅(qū)動力。這兩個因素反過來又對跨膜電流產(chǎn)生影響。此時記離子流過通道的驅(qū)動力。這兩個因素反過來又對跨膜電流產(chǎn)生影響。此時記錄到的電流受多方面因素的影響，很難進(jìn)行分析。錄到的電流受多方面因素的影響，很難進(jìn)行分析。 電壓鉗電壓鉗是保持細(xì)胞膜電位不變，同時記錄離子跨膜電流的一種方法?？缡潜３旨?xì)胞膜電位不變，同時記錄離子跨膜電流的一種方法。跨膜電流是由膜電流

5、是由Na+, K+, Ca2+, Cl-離子通過細(xì)胞膜上的離子通道所產(chǎn)生的。離子通過細(xì)胞膜上的離子通道所產(chǎn)生的。ImVmVcNaNa雙電極電壓鉗原理圖雙電極電壓鉗原理圖eClAg/AgClVmVceVmVcl 腦片膜片鉗技術(shù)腦片膜片鉗技術(shù)1 1腦片撕裂法（腦片撕裂法（Slice rending methodSlice rending method）（引自：（引自： Stuart et al., 1993）（引自：（引自：Ascher P, 1989） 10M 10Mab（引自：（引自：The Axon Guide，1993。有改動）有改動）2 2表面清潔法表面清潔法（Surface clean

6、ing Surface cleaning 法）法）3. 3. 紅外微分干涉相差顯紅外微分干涉相差顯微鏡法（微鏡法（IR-DICIR-DIC法法 ）4.4.盲法盲法（Blind Blind 法）法）海馬腦片海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的區(qū)錐體神經(jīng)元的IR-DIC影象影象海馬腦片海馬腦片CA1區(qū)中間神經(jīng)元的區(qū)中間神經(jīng)元的IR-DIC影象影象 微電極 神經(jīng)元 -80-70-60-50-40-30-20-10channel current (pA)-60-40-200204060 depolarization potenial (mV)I/V curve離子通道動力學(xué)性質(zhì)的研究離子通道動力學(xué)性質(zhì)的研究（

7、以海馬腦片全細(xì)胞記錄模式為例）（以海馬腦片全細(xì)胞記錄模式為例）IA currents2nA20msNa+ currentsIK currentsVh=- 80mV 40mV-60mV2nA10ms-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh =-90mV2nA20ms-50mVVh= -90mV5ms2nA50ms1nAVh= -70mV70mV-50mV70mV60mV50mV細(xì)胞的胞吐與胞吞功能測定細(xì)胞的胞吐與胞吞功能測定 通過膜電容測定法可觀測細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒通過膜電容測定法可觀測細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒膜與胞質(zhì)膜融合過程。膜電容在細(xì)胞膜不發(fā)生膜與胞質(zhì)膜融合過程。

8、膜電容在細(xì)胞膜不發(fā)生折疊時，與細(xì)胞膜表面積成正比，因而可通過折疊時，與細(xì)胞膜表面積成正比，因而可通過膜電容的變化反映胞吐與胞吞過程及其機(jī)制。膜電容的變化反映胞吐與胞吞過程及其機(jī)制。另外，膜融合產(chǎn)生的一過性電流也可記錄到。另外，膜融合產(chǎn)生的一過性電流也可記錄到。 幾乎所有細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜其電容均為幾乎所有細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜其電容均為1F/cm2l 與與CaCa2+2+通道鄰近的遞通道鄰近的遞質(zhì)囊泡可被單一動作電質(zhì)囊泡可被單一動作電位激活而釋放遞質(zhì)；位激活而釋放遞質(zhì)；l 而遠(yuǎn)隔部位的囊泡則而遠(yuǎn)隔部位的囊泡則需要一串動作電位的發(fā)需要一串動作電位的發(fā)放。說明若要大量的遞放。說明若要大量的遞質(zhì)釋放必須有大

9、量的質(zhì)釋放必須有大量的CaCa2+2+進(jìn)入。進(jìn)入。CaCa2+2+通道通道遞質(zhì)囊泡遞質(zhì)囊泡7.967.927.887.847.80pF321s-100-50050pA10uM forskolincontrol100fF500msflashR=56.2/sAmp=33 fFR=0.505/sAmp=301.3 fFCa2+i=8.2M100fF500msflashR=44.8/sAmp=84.04fFR=4.3/sAmp=119.9fFCa2+i=4.72M 500msflash100fFR=49.3/sAmp=42fFR=2.05/sAmp=316.8fFCa2+i=5.6M細(xì)胞內(nèi)鈣測定與膜片

10、鉗的結(jié)合細(xì)胞內(nèi)鈣測定與膜片鉗的結(jié)合 采用鈣熒光測定技術(shù)和膜片鉗技術(shù)同采用鈣熒光測定技術(shù)和膜片鉗技術(shù)同時進(jìn)行的手段，可實(shí)時地監(jiān)測單一細(xì)胞內(nèi)時進(jìn)行的手段，可實(shí)時地監(jiān)測單一細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的變化與通道電現(xiàn)象變化的對游離鈣濃度的變化與通道電現(xiàn)象變化的對應(yīng)關(guān)系。應(yīng)關(guān)系。今天的膜片鉗電生理學(xué)今天的膜片鉗電生理學(xué)現(xiàn)在現(xiàn)在過去過去平面膜片鉗平面膜片鉗 Precision Range Control HoleGeometryconsistency StabilityRmRa Rm Ra細(xì)胞定位細(xì)胞定位封接測試封接測試穩(wěn)定的全穩(wěn)定的全細(xì)胞記錄細(xì)胞記錄細(xì)胞破膜細(xì)胞破膜封接形成封接形成 Surfaces Chip C

11、ell Solution細(xì)胞外液細(xì)胞外液Vcom細(xì)胞外液細(xì)胞外液細(xì)胞內(nèi)液細(xì)胞內(nèi)液Vcom 高阻封接高阻封接 + + 穩(wěn)定時間穩(wěn)定時間 15 min + + 多功能性多功能性 + +傳統(tǒng)與傳統(tǒng)與SealChip電生理學(xué)比較電生理學(xué)比較細(xì)胞內(nèi)液細(xì)胞內(nèi)液Throughput ScenariosBaseline(min.)Drug(min.)Washout(min.)SuccessRateThroughput(data pts./day) 5 5 5 75% 320 5 5 5 50% 213 1 1 N/A 75% 1152 1 1 N/A 50% 768MEASREFBreatherBreathe

12、rTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwith suction/pressureconnectionWasteCapillary stopRear (intracellular)flow channelFront (extracellular)flow channelMEASREFBreatherBreatherTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwith suction/pressureconnectionWasteCapilla

13、ry stopRear (intracellular)flow channelFront (extracellular)flow channelThe QPlate16 or 48 patch clamp sites with intra- and extracellularflow channelsMEASREFBreatherBreatherTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwith suction/pressureconnectionWasteCapillary stopRear (intracellul

14、ar)flow channelFront (extracellular)flow channelMEASREFBreatherBreatherTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwith suction/pressureconnectionWasteCapillary stopRear (intracellular)flow channelFront (extracellular)flow channelBottomChannelinletTopChannelinletCapillarystopTop channel-extracellularBreatherBottom channel-intracellularRecording PrincipleRecording PrincipleIntracellu