cn6包含無花果屬植物樹液級分的生物活性組合物和用于減少皮膚色素沉著過度出現(xiàn)方法

1、(19)中民*CCNN110033220000992299AA*(12)發(fā)明專利申請(10)申請公布號(43)申請公布日CN 1032009292013.07.10A(21)申請?zhí)?01180054046.6A61Q19/02 (2006.01)(22)申請日2011.09.09(30)優(yōu)先權數(shù)據(jù)61/381,442 2010.09.10US(85)PCT申請進入2013.05.09階段日(86)PCT申請的申請數(shù)據(jù)PCT/US2011/051066 2011.09.09(87)PCT申請的公布數(shù)據(jù)WO2012/034060 EN 2012.03.15(71)申請人 阿克佐化學國際公司地址 荷

2、蘭阿默斯福特(72)發(fā)明人M克格諾夫(74)專利機構 北京市中咨11247張朔黃革生人(51)Int.Cl.A61K 8/97 (2006.01)權利要求書2頁 說明書42頁附圖10頁(54) 發(fā)明名稱包含無花果屬植物樹液級分的生物活性組合物和用于減少皮膚色素沉著過度的出現(xiàn)的方法(57) 摘要本發(fā)明提供了包含來源于新鮮無花果屬植物葉子的無花果屬植物細胞汁液的無花果屬植物樹液級分的生物活性組合物以及無花果屬植物樹液級分的方法。所述組合物具有能夠減少皮膚色素沉著過度的生物活性。CN 103200929 A權利要求書CN 103200929 A1/2 頁1. 來源于新鮮無花果屬植物葉子汁液的組合物，

3、其中所述組合物是無花果屬植物樹液級分 (Ficus Serum Fraction)。2. 權利要求 1 的組合物，其中所述無花果屬植物細胞樹液級分通過包括下述步驟的方備 ：a. 從干凈新鮮的未萎蔫的無花果屬植物葉子中分離出無花果屬植物細胞汁液，得到新鮮的無花果屬植物細胞汁液，其中在所述分離之前或期間沒有加入外來液體 ；b. 過濾所述新鮮的無花果屬植物細胞汁液，得到不含的細胞汁液 ；和c. 使所述不含包括 ：(1) 從所述不含的細胞汁液進行分級，得到無花果屬植物樹液級分，其中所述分級的細胞汁液中除去葉綠素，得到上清液 I ；(2) 從上清液 I 中除去色素和蛋白質，形成無花果屬植物樹液級分 ；和

4、(3) 任選地向所述無花果屬植物樹液級分中加入穩(wěn)定劑。3. 權利要求 2 的組合物，其中所述的從上清液 I 中除去色素和蛋白質包括 ：i. 調節(jié)上清液 I 的 pH 至約 7.5，形成 pH 被調節(jié)的上清液 I ；ii. 將 pH 被調節(jié)的上清液 I 分離成沉淀物 II 和上清液 II ；iii. 調節(jié)上清液 II 的 pH 至約 3.6，形成 pH 被調節(jié)的上清液 II ；iv. 將 pH 被調節(jié)的上清液 II 分離成沉淀物 III 和無花果屬植物樹液級分。4. 權利要求 3 的組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自抗氧化劑、螯合劑、防腐劑及其混合物。5. 權利要求 4 的組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自焦亞

5、硫酸鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、尼泊金甲酯鈉、戊二醇及其混合物。6. 權利要求 3 的組合物，其中所述組合物在室溫下穩(wěn)定至少 67. 權利要求 6 的組合物，其中所述組合物在室溫下穩(wěn)定至少 128. 權利要求 7 的組合物，其中所述組合物在室溫下穩(wěn)定至少 24。9. 權 利 要 求 3 的 組 合 物，其 中 所 述 無 花 果 屬 植 物 葉 子 選 自 由 孟 加 拉 榕(F.benghalensis)、無 花果 (F.carica)、榕 (F.elastica)、榕 樹 (F.microcarpa)、F.trigonata 及其組合組成的無花果屬植物種類。10. 權利要求 9 的組合物，其中

6、所述無花果屬植物樹液級分基本上不含脫鎂葉綠酸。11. 權利要求 3 的組合物，其中，當通過凱氏法測定時，所述無花果屬植物樹液級分基本上不含蛋白質。12. 權利要求 3 的組合物，其中所述無花果屬植物樹液級分為水溶性的。13. 權利要求 3 的組合物，其中所述無花果屬植物樹液級分具有的加德納顏色值小于8。14. 權利要求 13 的組合物，其中所述加德納顏色值小于 7.5。15. 權利要求 1 的組合物，其中所述無花果屬植物樹液級分具有能夠減少皮膚色素沉著過度的生物活性。16. 權利要求 15 的組合物，其中所述生物活性足以破壞黑素生成 ( 黑色素一個或多個步驟。17. 權利要求 16 的組合物，

7、其中所述生物活性足以抑制黑素生成酶活性。) 中的18. 權利要求 17 的組合物，其中所述酶活性是胰蛋白酶活性、酪氨酸酶活性或兩者。2權利要求書CN 103200929 A2/2 頁19. 權利要求 16 的組合物，其中所述生物活性足以抑制彈性蛋白酶活性。20. 權利要求 16 的組合物，其中所述生物活性足以抑制 COX-2 活性。21. 權利要求 16 的組合物，其中所述生物活性足以提高抗氧化劑活性、自由基清除活性或兩者。22.無花果屬植物細胞樹液級分組合物的方法，所述方法包括 ：a. 從干凈新鮮的未萎蔫的無花果屬植物葉子中分離出無花果屬植物細胞汁液，得到新鮮的無花果屬植物細胞汁液，其中在所

8、述分離之前或期間沒有加入外來液體 ；b. 過濾所述新鮮的無花果屬植物細胞汁液，得到不含的細胞汁液 ；和c. 使所述不含包括 ：(1) 從所述不含的細胞汁液進行分級，得到無花果屬植物樹液級分，其中所述分級的細胞汁液中除去葉綠素，得到上清液 I ；(2) 從上清液 I 中除去色素和蛋白質，形成無花果屬植物樹液級分 ；和(3) 任選地向所述無花果屬植物樹液級分中加入穩(wěn)定劑。23. 權利要求 22 的方法，其中所述的從上清液 I 中除去色素和蛋白質包括 ：i. 調節(jié)上清液 I 的 pH 至約 7.5，形成 pH 被調節(jié)的上清液 I ；ii. 將 pH 被調節(jié)的上清液 I 分離成沉淀物 II 和上清液

9、II ；iii. 調節(jié)上清液 II 的 pH 至約 3.6，形成 pH 被調節(jié)的上清液 II ；iv. 將 pH 被調節(jié)的上清液 II 分離成沉淀物 III 和無花果屬植物樹液級分。24. 權利要求 23 的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自抗氧化劑、螯合劑、防腐劑及其混合物。25. 權利要求 24 的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自焦亞硫酸鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、尼泊金甲酯鈉、戊二醇及其混合物。26. 權利要求 25 的方法，其中所述組合物在室溫下穩(wěn)定至少 627. 權利要求 26 的方法，其中所述組合物在室溫下穩(wěn)定至少 1228. 權利要求 27 的方法，其中所述組合物在室溫下穩(wěn)定至少 24。29. 權 利

10、 要 求 22 的 方 法，其 中 所 述 無 花 果 屬 植 物 葉 子 選 自 由 孟 加 拉 榕(F.benghalensis)、無 花果 (F.carica)、榕 (F.elastica)、榕 樹 (F.microcarpa)、F.trigonata 及其組合組成的無花果屬植物種類。30. 權利要求 22 的方法，其中所述組合物基本上不含脫鎂葉綠酸。31. 權利要求 22 的方法，其中，當通過凱氏法測定時，所述組合物基本上不含蛋白質。32. 權利要求 22 的方法，其中所述組合物為水溶性的。33. 權利要求 22 的方法，其中所述組合物具有的加德納顏色值小于 8。34. 權利要求 22

11、 的方法，其中所述組合物具有的加德納顏色值小于 7.5。3說明書CN 103200929 A1/42 頁包含無花果屬植物樹液級分的生物活性組合物和用于減少皮膚色素沉著過度的出現(xiàn)的方法0001相關申請的交叉0002本申請要求于 2010 年 9 月 10 日提交的美國臨時專利申請序列號 61/381,442 的優(yōu)先權利益，該臨時專利申請的公開內容在此整體引入本文作為參考。發(fā)明領域0003 本發(fā)明涉及通過給皮膚局部應用美容化妝用組合物來亮膚(skin lightening) 的領域。本發(fā)明還涉及包含無花果屬植物樹液級分 (ficus serum fraction) 的局部用亮膚組合物。本發(fā)明還涉及

12、通過給色素沉著過度區(qū)域局部應用美容化妝用組合物以破壞黑色素中的一個或多個步驟來減少皮膚色素沉著過度的出現(xiàn)的方法。0004發(fā)明背景0005人類皮膚包括三個主要層 ：表皮、真皮和皮下脂肪層。表皮包括四層( 自上而下) ： 角質層、顆粒層、棘層 (spiny layer) 和基底層。單獨的第五層透明層可以存在于 角質層和顆粒層之間?；讓赢a(chǎn)生逐漸向上遷移形成其它表皮層的細胞。隨著這些細胞向上遷移，它們失核并開始產(chǎn)生皮膚蛋白質 ( 角蛋白 ) 和脂肪 ( 脂質 )。這些細胞當存在于表皮的較上層時被確定為角質形成細胞。黑素細胞是位于表皮基底層中的另一類細胞。黑素細胞負責產(chǎn)生黑色素，黑色素是皮膚色素沉著的

13、主要因素。0006黑色素是由黑素細胞內的一組復雜反應產(chǎn)生的，該反應在基礎水平上涉及作為酶的酪氨酸酶和作為底物的 L- 酪氨酸。酪氨酸酶催化 L- 酪氨酸向 DOPA(L-3，4- 二羥苯丙氨酸) 的轉化和DOPA 向多巴醌(dopaquinone) 的轉化。多巴醌進行進一步轉化，形成黑色素。黑色素在稱為黑素體的細胞器中，黑素體沿著稱為樹突的黑素細胞的細長纖絲被轉移至角質形成細胞。在黑素體中表達了約 1500 個產(chǎn)物，其中有 600 個在任意給定的時間表達并且有 100 個被認為對黑素體而言是唯一的。另外，在黑素體在黑素細胞內的轉運和在黑素體向角質形成細胞的轉移中，有多種調節(jié)元件參與信號傳導。0

14、007黑色素的產(chǎn)生可以由多種外源性和內源性。例如，當皮膚接受紫外照射時，黑素細胞產(chǎn)生額外的黑色素。然后，黑色素經(jīng)由黑素體被轉運至角質形成細胞，其然后使皮膚呈現(xiàn)“曬黑”的外觀。一旦移除紫外光，黑素細胞恢復至黑色素產(chǎn)生的正常水平。炎癥可以通過經(jīng)由介質如IL-1、內皮素-1 和/ 或干細胞因子直接剌激黑素細胞而色素沉著過度。在受損皮膚中產(chǎn)生的或由炎癥細胞作為副產(chǎn)物化氮可以是黑素細胞的刺激劑。的活性氧簇如過氧化物和一氧0008隨時間推移，長期 UV細胞和 / 或黑素細胞中出現(xiàn)道，一些黑素生成相關性和其它內源性和外源性衰老因素可以導致在角質形成性表達變化，導致相關的色素沉著過度斑。據(jù)報( 例如酪氨酸酶、

15、TYRP1) 的 mRNA 水平增加光化學斑 ( 老年斑)。也可能存在表皮內皮素級聯(lián)的增強和干細胞因子在色素沉著過度中的作用。這些變化可導致黑色素過量生成，繼而導致即使當避免了刺激如 UV時仍然存在的色素沉著過度斑。即使在色素沉著過度斑之外，長期 UV和其它內源性和外源性衰老因素可使膚4說明書CN 103200929 A2/42 頁色產(chǎn)生更微小的變化。通常，這些變化被描述為膚色不均或斑狀外觀。至少有一項研究提示 ：老年斑有時可使人的知覺(perceived age) 增加 10 至 12 歲，并且黑色素分布可驅使膚色依賴性衰老知覺。因此，期望提供可物和處置方法。色素沉著過度皮膚如老年斑的出現(xiàn)的

16、組合0009近年來，消費者日益需要“天然”的美容化妝用。因此，美容化妝品制造商已經(jīng)向它們的美容化妝用配制物中引入了的基于植物的物質。盡管多種植物已經(jīng)數(shù)百年乃至數(shù)千年用于各種聲稱的適應癥，但是直到近來仍然不能臨床驗證所聲稱的功效或基于植物生物活性的基礎科學來識別新的潛在用途。隨著科學的最新發(fā)展，研究現(xiàn)在能夠較好地評價直到最近僅僅被民俗所支持的植物的功效和/ 或潛在的新用途。由于科學是新的，并且由于可潛在地用作美容化妝用生物活性物質的植物的數(shù)量如此龐大，非常多的植物尚未進行充分的研究。0010很多用于從植物中提取植物性組分的方法涉及對植物組織組成和 / 或該組織中所含的感的生物活性組分有害的技術。

17、因此，常規(guī)提取方法通常不能獲得植物細胞內存在的全范圍的活性物，因而不能實現(xiàn)基于植物的美容化妝用配制物的所有潛能。另外，很多常規(guī)提取方法使用苛刻 (harsh) 的化學溶劑，它們不是“天然的”，因而是消費者想要避免應用于他們的皮膚上的物質。而且，這些基于溶劑的方法產(chǎn)生了的化學廢棄物，它們如果未作為廢棄物進行適當處理和處置的話可危害環(huán)境。0011然而，僅僅因為物質是“天然的”并未確保其不含不希望的物質，不含不希望的物質將使得物質適合用于皮膚。例如，很多植物含有光敏劑如脫鎂葉綠酸和 / 或接觸性變應原如蛋白質。脫鎂葉綠酸和 / 或蛋白質處于在很多常見植物中天然發(fā)現(xiàn)的水引起大多數(shù)人的關注。然而，當植物

18、材料被濃縮成高濃縮形式 ( 例如通過提取) 時，這些物質可以以引起皮膚刺激和過敏性反應 ( 包括皮疹 ) 的水平存在。然而，即使當這些物質以其天然水平存在時，仍然有許多敏感0012而且，隨著對天然經(jīng)歷負性皮膚反應。的需求增大，就會產(chǎn)生對保護地球天然的關注。消費者期望的“天然”成分有很多來源于當被采收用于消費者時被耗竭和 / 或破壞的生物資源。因此，消費者對天然的、對地球更友好的的期望可令人啼笑皆非地導致他們所致力于保護的生物被破壞。0013因此，需要有這樣一種天然的、具有生物活性的植物性組合物 ：其保持了它們的預期生物活性譜，適于局部皮膚應用，并且沒有使用苛刻的化學溶劑來進行。而且，需要含有有

19、效減少皮膚色素沉著過度區(qū)域的這類生物活性物質的美容化妝用組合物。另外，需要可以以學上合理的、可持續(xù)的方式采收和的這類生物活性物質。0014根據(jù)下述公開內容，本發(fā)明的這些和其它目的將變得顯而易見。0015發(fā)明簡述0016本發(fā)明提供了來源于新鮮的無花果屬植物 (Ficus) 葉子細胞汁液的無花果屬植物樹液級分(Ficus serum fraction)。本發(fā)明還提供了包含無花果屬植物樹液級分的美容化妝用組合物。無花果屬植物樹液級分以有效獲得預期亮膚結果的量存在于組合物中。0017本發(fā)明還涉及通過給色素沉著過度區(qū)域局部應用美容化妝用組合物以破壞黑色素生成中的一個或多個步驟來減少皮膚色素沉著過度的出現(xiàn)

20、的方法。0018附圖簡述5說明書CN 103200929 A3/42 頁0019相信本發(fā)明由以下說明結合附圖將更好地被理解。所制本發(fā)明的范圍。的附圖不意欲被看作限0020圖 1 是由新鮮無花果屬植物葉子具有生物活性的樹液級分的方法的示意圖。0021圖 2 是疊加在無花果屬植物樹液級分的 LC/UV 色譜圖上的常規(guī)無花果屬植物提取物的 LC/UV 色譜圖，其顯示常規(guī)提取物含有較高水平的在無花果屬植物樹液級分中未檢測到的遲洗脫 ( 更疏水性 ) 的化合物。0022圖 3 是常規(guī)無花果屬植物提取物的較遲洗脫的化合物的 LC/UV 色譜圖和它們相應的提取的離子色譜圖，它們被鑒定為脫鎂葉綠酸，即作為葉綠

21、素降解產(chǎn)物的色素化合物。0023圖 4 是疊加在無花果屬植物樹液級分的 LC/UV 色譜圖上的常規(guī)無花果屬植物提取物的 LC/UV 色譜圖，其顯示常規(guī)提取物含有較高水平的黃酮醇糖苷。0024 圖 5 是疊加在無花果屬植物樹液級分的那些上的常規(guī)無花果屬植物提取物 LC/UV 色譜圖及相應的提取的離子色譜圖的一部分，其顯示無花果屬植物樹液級分含有的兒茶素和相關的縮合鞣質的水平是常規(guī)無花果屬植物提取物中的約 10 倍 (10x)。0025 圖 6 是疊加在無花果屬植物樹液級分的那些上的常規(guī)無花果屬植物提取物 LC/UV 色譜圖和相應的提取的離子色譜圖的一部分，其顯示三種氯原酸異構體的水平在兩種樣品之

22、間未顯示出實質上不同。0026圖 7 是疊加在無花果屬植物樹液級分的那些上的常規(guī)無花果屬植物提取物 LC/MS色譜圖的一部分，其顯示在無花果屬植物樹液級分中游離酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的水平較高。0027圖 8 是來自老化研究的兩份彩色，其顯示了干燥葉子無花果屬植物提取物相對于 FSF( 包含不同水平的無花果屬植物樹液級分和不同防腐劑的兩種不同的美容化妝用組合物 ) 的顏色穩(wěn)定性。0028圖 9 是圖 8 的0029圖10 是來自防腐劑的載體。0030發(fā)明詳述老化研究的校準曲線。老化研究的彩色，其中比較了含有0.55 FSF 和不同濃度的0031本文使用的所有百分數(shù)和比例是基于總組合物的重量計

23、算的，所有測定在 25進行，另有指示除外。0032本發(fā)明的組合物可以包含本文所述的主要組分以及任選的成分，或者基本上由它們組成，或者由它們組成。如本文所用的“基本上由組成”指組合物或組分可以包括另外的成分，但是只有當另外的成分不顯著改變所要求的組合物或方法的基本特性和新特性時才如此。0033如如表皮上。組合物所用的術語“應用”指將本發(fā)明的組合物應用或涂敷在人皮膚表面0034如本文所用的術語“皮膚學可接受的”指所述組合物或組分適用于與人皮膚組織接觸而沒有過度毒性、不相容、不穩(wěn)定反應等。0035如本文所用的術語“安全有效量”指足以顯著引起積極益處的化合物或組合物的量。0036如本文所用的術語“炎癥

24、后色素沉著過度”指色素沉著響應于暫時性炎性而6說明書CN 103200929 A4/42 頁急性增加至長期增加。炎癥后色素沉著過度在深色皮膚中是特別普遍的，但不限于此。一旦暫時性炎性消失，則炎癥后色素沉著過度通常會減退。暫時性炎性的實例包括但不限于痤瘡損傷、向內生毛、抓傷、蟲咬、表面活性劑損傷和短期 UV。0037如本文所用的“色素沉著過度斑”指其中色素沉著由于黑色素局部的和長期的或者全身性的超量產(chǎn)生而大于皮膚區(qū)域的色素沉著的限定皮膚區(qū)域。色素沉著過度斑的直徑通常為約 2mm 至約 10mm，但是更小或更大的斑是可能的。色素沉著過度斑可以包括老年斑、曬斑、日光斑、黑素減少性損傷 (hypome

25、lanotic lesions)、雀斑和黃褐斑中的一種或多種。0038 如本文所用的術語“老年斑”指其中色素沉著歸因于由內源性或外源性衰老因素引起的黑色素局部和長期超量產(chǎn)生的色素沉著過度斑。0039 如本文所用的術語“調膚色劑”(skin tone agent) 指調節(jié)黑色素產(chǎn)生信號、黑色素、黑色素在黑素細胞和角質形成細胞之間的系統(tǒng)性轉移和 / 或黑色素降解的物質。調膚色劑可以通過充當亮膚或減少色素沉著的美容化妝用物質來不均勻膚色的出現(xiàn)。0040如本文所用的術語“膚色”(skin tone) 指由黑色素的系統(tǒng)性而非短暫性引起的皮膚中黑色素的總體外觀。膚色通常在較大的皮膚面積上表征。所述面積理論

26、上可以大于 100mm2，但是可以設想更大的面積，例如整個面部皮膚或面部皮膚表面的任意部分。膚色可以通過圖像分析來測定。例如，總體亮度可以通過 L a b 顏色空間 (InternationalCommission on Illumination) 中的L坐標進定?？梢允褂冒l(fā)色團作圖如黑色素作圖和黑色素濃度作為整體膚色的指示物?？梢杂砂l(fā)色團作圖數(shù)據(jù)計算黑色素平均值。另外， 可以通過黑色素均勻度確定膚色均勻度，黑色素均勻度也可以由發(fā)色團作圖數(shù)據(jù)計算。下文實施例中討論了適宜的發(fā)色團作圖技術。0041如本文所用的術語“面部皮膚表面”指額、眶周、頰、口周圍、頦和鼻皮膚表面中的一者或多者。0042 如本

27、文所用的術語“常規(guī)提取物”指通過從植物材料中用溶劑提取化合物所產(chǎn)生的那些提取物 ；植物材料可以是脫水 ( 即，干燥的 ) 和 / 或未脫水 ( 例如，新鮮的或僅僅部分脫水的 ) 的植物材料。0043 I. 組合物0044 本發(fā)明涉及多種組合物，更具體而言，涉及應用于皮膚表面的組合物。組合物可以是多種形式，包括但不限于溶液、混懸液、乳液 (lotions)、霜劑、凝膠劑、調色劑(toners)、棒狀物、筆、噴霧劑、氣溶膠、軟膏、清潔用液體洗滌劑和固體桿狀物、洗發(fā)香波和頭發(fā)調理劑、糊劑黏附繃帶、水凝膠、成膜、粉末、摩絲、剃須膏、擦拭物、條狀物、貼劑、電動貼劑、傷口敷料和、面膜和皮膚膜 ( 有和無不

28、溶性片材 )、化妝品如粉底膏和眼影等。組合物形式可以根據(jù)所選擇的具體的皮膚學可接受的載體 ( 如果在組合物中存在的話 ) 而定。0045本發(fā)明的組合物可用于減少與黑色素相關的皮膚色素沉著過度的出現(xiàn)。如本文所用的“減少皮膚色素沉著過度的可見出現(xiàn)”包括皮膚增亮。皮膚增亮包括減少皮膚中存在的黑色素和/ 或使之最少化和/ 或消除( 治療性) 和/ 或延遲在皮膚中形成黑色素和/ 或使之最小化和/ 或在皮膚中形成黑色素( 預防性)，包括皮膚的色素沉著過度區(qū)域。如本文所用的“色素沉著過度區(qū)域”指具有高的黑色素含量的局部區(qū)域，包括老年斑、肝痣、斑7說明書CN 103200929 A5/42 頁點 (blotc

29、hiness)、色斑、黃褐斑、黑斑 (chloasma)、雀斑、炎癥后色素沉著過度或日光誘導的色素沉著瑕疵。0046A. 無花果屬植物樹液級分0047無花果屬 (Ficus) 由很多種類組成，并且發(fā)現(xiàn)于全世界。無花果屬不應當與無花果種類刺梨仙人掌 (prickly pear cactus，Opuntia ficus-indica(L.)Mill，仙人掌科 (Cactaceae) 相(Barbera 等人，PAST AND PRESENT ROLE OF THE INDIAN-FIGPRICKLY-PEAR(OPUNTIA FICUS-INDICA(L.)MILLER，CACTACEAE)IN

30、THE AGRICULTURE OFSICILY.Economic Botany46(1) ：10-20.1992.)。無花果屬中著名的種類包括無花果(Ficus carica，一種常見的無花果 )、菩提樹 (Ficus religiosa，當佛“真理”時保護佛的菩提樹 )behghalensis)(榕 (Ficus elastica Roxb.exHorneum.，橡膠樹 )、孟加拉榕 (Ficus榕樹 ) 和聚果榕 (Ficus racemosa，異名 glomerata，巨大簇狀樹 )。0048在果實的一般種類內，無花果是隱頭花序的實例，隱頭花序是具有特征性的“翻轉”結構的聚合果 (mu

31、ltiple fruits)。這些包括 druplets 的聚合，druplets 是肉質中空花托，各自在頂端具有稱為空口 (ostiole) 的小開口。微小的花見。在壁內，從外部看不0049作為最古老的已知人類之一，無花果屬 (Ficus spp.)( 無花果 ) 具有長期確立的安全特性。有史以來，無花果的新鮮或干燥果實、樹皮、葉子、小枝、膠乳和嫩枝已經(jīng)被用于各種目的。這些歷史用途中的一些包括治療瘡、潰瘍、癌性生長、腫瘤、膿腫、痛風、久咳、肺部問題、慢性腹瀉、便秘、風濕病、痔、嘔吐、濕疹 (excema)、麻風和疣。0050 本發(fā)明的無花果屬植物樹液級分 ( 下文稱為“FSF”) 來源于新鮮

32、無花果屬植物葉子的細胞汁液。將從新鮮葉子經(jīng)機械分離的細胞汁液采用 pH 調節(jié)、聚焦微波照射、離心分離和滅菌過濾進行分級，得到不含脫鎂葉綠酸和不含蛋白質的無花果屬植物樹液級 分。所得的無花果屬植物樹液級分基本上由無花果屬植物葉子細胞的細胞質組成。在特定的實施方案中，無花果屬植物細胞汁液來源于選自如下的無花果屬植物種類 ：孟加拉榕 (F.benghalensis)、無花果 (F.carica)F.trigonata 及其組合。榕 (F.elastica)、榕樹 (F.microcarpa)、0051 本發(fā)明的組合物包含安全有效量的無花果屬植物樹液級分。該組合物可以含有基于組合物重量計 0.01至

33、50、在一項實施方案中 0.05至 20、在另一項實施方案中 0.2至 10的量的 FSF。在另一項實施方案中，組合物包含基于總組合物重量計 1至5、在另一項實施方案中 1至 3的 FSF。0052本發(fā)明的研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部應用于皮膚時，無花果屬植物樹液級分與常規(guī)無花果屬植物提取物相比產(chǎn)生了優(yōu)良的亮膚作用，包括使哺乳動物皮膚中的色素沉著過度區(qū)域增亮。本發(fā)明不受縛于理論，但是相信它通過抑制參與黑色素產(chǎn)生 ( 黑素生成 ) 的過程起作用，包括黑素細胞的活性氧/ 氧自由基刺激( 氧化應激)，該刺激導致黑素細胞內的黑色素產(chǎn)生途徑 ( 例如，其可隨著 UV0053無花果屬植物樹液級分的或日光而發(fā)生 )。0

34、054用于從植物材料中分離化合物的方法( 例如通過用溶劑提取) 決定了分離哪些化合物。與“相似相溶”的一般原理一致，提取溶劑的選擇很大程度上決定了由任意特定提取技術得到的化合物的類型和數(shù)量。例如，采用極性溶劑提取出極性化合物，而采用非極性溶8說明書CN 103200929 A6/42 頁劑則提取出非極性化合物。這導致從可能存在的化合物的總范圍中僅僅分離出窄范圍的化合物。下表 1x 概括了使用不同極性范圍內的常用溶劑所通常提取出的不同化合物類型。0055 表 1x0056 常規(guī)溶劑提取00570058本發(fā)明的無花果屬植物樹液級分不是通過溶劑提取的，而是通過將在植物葉子中發(fā)現(xiàn)的新鮮細胞汁液與植物材

35、料的其余部分分離來的。這種細胞汁液因為沒有進行提取過程而含有在新鮮無花果屬植物葉子中發(fā)現(xiàn)的全范圍的化合物。相反，提取物僅含有采用特定溶劑可以分離的窄范圍的化合物。因此，與提取物相比，所得的無花果屬植物樹液級分含有寬得多的范圍的潛在具有活性的化合物。0059而且，很多提取物不是從新鮮葉子的，而是從干燥植物材料的，干燥植物材料由于脫水而進行了降解。在脫水期間，細胞壁被破壞，導致化合物經(jīng)由諸如水解、氧化、聚合、美拉德反應和異構化的機理而被降解。當干燥葉子進行提取時，如此所得的提取物含有最初在新鮮植物材料中不存在的這些降解產(chǎn)物 ；而且，該提取物僅含有通過特定溶劑可以分離的化合物范圍。因此，所得干燥葉子

36、提取物的組成極大地不同于無花果屬植物樹液級分的組成。無花果屬植物樹液級分組合物的方法包括如下步驟 ：(a) 從干凈新鮮的未萎0060蔫的無花果屬植物葉子中分離出無花果屬植物細胞汁液，得到新鮮的無花果屬植物細胞汁液，其中在所述分離之前或期間沒有加入外來液體 ；(b) 過濾所述新鮮的無花果屬植物細胞汁液，得到不含的細胞汁液 ；和 (c) 使所述不含的細胞汁液進行分級，得到無花果屬植物樹液級分。分級步驟包括如下步驟 ：(1) 從所述不含的細胞汁液中除去葉綠素，得到上清液 I ；(2) 從上清液 I 中除去色素和蛋白質，形成無花果屬植物樹液級分 ；和(3) 任選地向所述無花果屬植物樹液級分中加入穩(wěn)定劑

37、。0061在一些實施方案中，穩(wěn)定劑選自抗氧化劑、螯合劑、防腐劑及其混合物。在特定實9說明書CN 103200929 A7/42 頁施方案中，穩(wěn)定劑選自焦亞硫酸鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、尼泊金甲酯鈉、戊二醇及其混合物。0062在特定實施方案中，從不含的細胞汁液中除去葉綠素的步驟包括 ：(i) 調節(jié)所述不含的細胞汁液的 pH 至約 3，得到 pH 被調節(jié)的不含的細胞汁液 ；(ii) 將所述pH 被調節(jié)的不含的細胞汁液加熱至約 90達約 1 分鐘 ；(iii) 將所述 pH 被調節(jié)的不含的細胞汁液冷卻至約 30 ；和 (iv) 將所述 pH 被調節(jié)的不含的細胞汁液分離成沉淀物 I 和上清液 I。006

38、3 在特定實施方案中，從上清液 I 中除去色素和蛋白質包括 ：(i) 調節(jié)上清液I 的 pH至 7.5，形成 pH 被調節(jié)的上清液 I ；(ii) 將 pH 被調節(jié)的上清液 I 分離成沉淀物 II 和上清液 II ；(iii) 調節(jié)上清液 II 的 pH 至 3.6，形成 pH 被調節(jié)的上清液 II ；和 (iv) 將 pH 被調節(jié)的上清液 II 分離成沉淀物 III 和無花果屬植物樹液級分。0064使用新鮮的無花果屬植物葉子無花果屬植物樹液級分。本文的方法保持了無花果屬植物葉子中固有存在的生物活性組分的完整性，產(chǎn)生了具有優(yōu)良活性的無花果屬植物樹液級分。在采收和期間注意保護葉子的完整性，以便使

39、環(huán)境因素如水分損失和生物降解最小化。所有步驟在最短的可能時間段內完成，以使新鮮葉子與日光、高溫和其它不利環(huán)境因素的接觸最小化。0065在特定實施方案中，無花果屬植物葉子選自由孟加拉榕 (F.benghalensis)、無花果 (F.carica)榕 (F.elastica)、榕樹 (F.microcarpa)、F.trigonata 及其組合組成的無花果屬植物種類。0066采收( 例如通過手或機械切割進行采收) 以避免使葉子切碎、搗碎、壓碎或其它類型損傷的方式或使之最小化的方式進行。采收和應當以避免由于水分損失而萎蔫的方式進行。在一項實施方案中，用于無花果屬植物樹液級分的新鮮無花果屬植物葉子含

40、有至少 90的其原始水分含量、在另一項實施方案中含有至少 95、在另一項實施方案中至少 98的在采收時存在的原始水分含量。0067因為一次可以采收至多 30的無花果屬植物葉子而不利地影響該植物的生存力，所以對同一株植物而言葉子再生長以供將來采收可以發(fā)生多次。因此，在其整個自然內，無花果屬植物可以繼續(xù)生長并且是周圍系統(tǒng)的一部分，同時提供重復的葉子采收用于具有生物活性的美容化妝用組合物。該采收方法是優(yōu)選的，因為它促進了自然的可持續(xù)性。0068雖然不是優(yōu)選的，但是也可以使用可持續(xù)性較差的收集方法，例如采用大規(guī)模機械采收，其除去了植物的主體并且沒有留下可存活的部分以供再生長。但是，即使采用這種更具有性

41、的采收方法，也應當注意使無花果屬植物葉子的損傷最小化，無花果屬植物葉子的損傷可在所收集的葉子中導致微生物生長、水分損失、氧化增強、聚合、異構化和水解過程( 例如不想要的分解代謝過程)。例如，在本發(fā)明的一項實施方案中，無花果屬植物作為整株植物被手工切割和收集。在另一項實施方案中，采用采收裝置切割植物葉子。將切割的植物材料至設備的時間和葉子在日光、高溫和其它不利環(huán)境因0069素中的應當被最小化，以防止如上文所述的不想要的分解過程的影響。例如，在本發(fā)明的一項實施方案中植物用于進一步的時間從切割時開始計算不超過 30 分鐘。在另一項實施方案中，對進行長距離的植物進行切割后操作，所述切割后操作包括立即1

42、0說明書CN 103200929 A8/42 頁將無花果屬植物葉子放入含有冷凍凝膠包袋的聚苯乙烯(Styrofoam) 冷卻器中以幫助在至設備的夜晚期間維持新鮮度和天然水分含量。也可以使用可以獲得上述結果的其它切割后操作。0070然后將無花果屬葉子進行溫和洗滌以在之前除去污染顆粒和其它碎屑。在一項實施方案中，在防止引起細胞汁液從葉子中、引起損傷或除去有價值的組分的條件下采用低壓沖洗短的時間完成洗滌。例如，在本發(fā)明的一項實施方案中，用低于或等于1kg/cm2 的水壓在少于或等于 5 分鐘的時間完成無花果屬植物葉子的洗滌。殘留的水洗滌液應當不含有任何綠色或黃素 ；不存在這類色素表明不存在后來的損害

43、。然后，從經(jīng)洗滌的葉子中除去過量的水以保持干物質含量盡可能地與天然水平接近。0071然后，將經(jīng)洗滌的新鮮無花果屬植物葉子進行機械分離以從富含的材料 ( 其主要含有細胞壁) 中出細胞汁液( 其含有實質細胞的大多數(shù)細胞內物質)。重要的是，在分離過程期間未加入外來溶劑 ( 例如水、己烷、乙醇 )。如本文所用的“外來溶劑”指不是固有地存在于植物材料中、而是為了從植物材料中分離 ( 例如提取 ) 化合物的目的而被放置與植物材料接觸的任意溶劑。0072從經(jīng)洗滌的葉子中( 即細胞汁液) 和將其與富含出細胞汁液包括研磨、浸漬和施壓以獲得液體細胞內物質的材料分離。在一項實施方案中，使用具有 5HP 發(fā)和一套篩的

44、錘磨機 (MVS35，Vincent Corporation，Tampa，F(xiàn)L) 來研磨葉子以在最短的時間內和不顯著增加生物質溫度的情況下產(chǎn)生具有適宜小的的葉子組織顆粒。在該實施方案中，錘磨機被設置成在 10 秒的處理期間產(chǎn)生 2.0 厘米的經(jīng)浸漬葉子顆粒的最大，其中經(jīng)浸漬新鮮葉子的溫度增加低于或等于僅 2。0073如上文所述，使經(jīng)研磨和浸漬的無花果屬植物葉子的最小化以不想要的分解代謝過程的影響。無花果屬植物葉子在短時間和不顯著增加溫度的情況下進行加工。在研磨和浸漬后，立即對無花果屬植物葉子施壓以獲得來自經(jīng)浸漬的新鮮葉子的細胞汁液。在一項實施方案中，這采用裝配有通過壓縮空氣支持的錐的臥式連續(xù)螺

45、桿機(Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，Tampa，F(xiàn)L) 來實現(xiàn)。在該實施方案中，錐上的維持在高于或等于15kg/cm2 的水平，螺桿速度為12rpm，細胞汁液溫度增加少于或等于 5。0074該處理產(chǎn)生了富含的物質和細胞汁液。然后，從細胞汁液沖除去殘留的小纖維顆粒，因為它們可吸收有價值的細胞汁液組分以及可阻塞裝置軟管和泵。例如，這些顆粒可以通過過濾或低速離心來除去。在一項實施方案中，這些顆粒通過采用具有全自動排出部件的連續(xù)離心機 (M12-413V，AML Industries，Inc.，Hatboro，PA) 進行澄清來除去。在 2 升/ 分鐘

46、的流速，在 2,250g 的細胞汁液澄清的保留時間為 100 秒。該方案產(chǎn)生了不含的細胞汁液。收集含有小顆粒的沉淀物，與在壓榨新鮮葉子后產(chǎn)生的富含0075來的的物質的其余部分合并。在此時如果希望的話，可以將細胞汁液冷凍在氣密的非反應性容器中保存以供后。在一項實施方案中，將細胞汁液迅速放置入密閉的 15 升長方形 HDPE 容器中并于 -30冷凍。將固態(tài)冷凍細胞汁液保持在該低溫下供進一步使用。0076然后，將冷凍的細胞汁液轉化回液態(tài)，優(yōu)選通過液化歷經(jīng)短時間 ( 例如小于或等于 2 分鐘) 和在液化期間細胞汁液溫度增加最小( 例如小于或等于 20 ) 的情況下進行。11說明書CN 10320092

47、9 A9/42 頁短的液化時間和低的溫度增加使得對細胞汁液的變性和氧化損傷都最小化。這使得細胞汁液具有與冷凍之前測量的那些基本上相同的生理化學和生物化學性質。0077細胞汁液包括三種主要的組分類型 ：(i) 膜結合的葉綠體、線粒體、內質網(wǎng)、細胞核、溶酶體、過氧化物酶體、液泡、高爾基體 ；和 (ii) 非膜結合的核糖體、微管 ；和 (iii) 與上述無關的組分，如細胞質。由于在細胞汁液中存在細胞器及其片段以及不想要的色素和蛋白質，需要進行分級來產(chǎn)生具有功能性質 ( 包括但不限于顏色、溶解性和體外活性 ) 的預期組合的個人護理成分。、穩(wěn)定性0078采用各種處置、包括 pH 調節(jié)、聚焦微波照射、離心

48、分離和真空過濾對細胞汁液進行分級。然后，將所得的分離的細胞汁液樹液級分用防腐劑和抗氧化劑穩(wěn)定，得到最終的無花果屬植物樹液級分。0079 將細胞汁液的 pH 調節(jié)至 3.0(pH 調節(jié) 1)。在一項實施方案中，利用滴定法、采用5.0N 鹽酸 (HCl) 調節(jié)細胞汁液 pH( 接近于中性 (7.0) 以降低細胞汁液的 pH 至 3.0(pH 調節(jié) 1)。0080然后，從經(jīng)調節(jié)的細胞汁液中除去葉綠素。除了在美容化妝用成分中不希望存在該色素外，葉綠素可以轉化為脫鎂葉綠酸，脫鎂葉綠酸被認為是毒性化合物(Bergstrom，L.C.，Vucenik，I.，Hagen，I.K.，Chernomorsky S

49、.A.，Poretz R.D，In-vitro photocytotoxicity of lysosomotropic immunoliposomes containing pheophorbide a with human bladder carcinoma cells.-J.Photochem.Photobiol.，24，1，17-23， 1994)，并且引起皮膚刺激 (Kato T.，Yamada K.Relationship between appearance of photosensitization and total pheophorbide level in spirulin

50、a powder.-J.Food Hyg.Soc.Japan，36，632-634，1995)。0081在一項實施方案中，通過加熱、然后冷卻經(jīng)調節(jié)的細胞汁液、接著分離沉淀物和上清液來完成葉綠素除去。在特定實施方案中，通過頻率為 2,450MHz 的聚焦微波照射迅速地處理經(jīng)調節(jié)的細胞汁液。在該聚焦微波(FMP) 期間，細胞汁液溫度暫時升高至 90，在此溫度保持 1 分鐘，然后細胞汁液溫度立即降低至 30。然后，采用連續(xù)離心機CEPA LE(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，德國 ) 在 15,000rpm 和 30 秒的保留時間下快速分離經(jīng)處理的細胞汁液。對經(jīng)處理

51、的細胞汁液的分離產(chǎn)生了綠色糊狀沉淀物 (“沉淀物 I”) 和淺褐色略微有乳光的液體上清液 (“上清液 I”)。該上清液 I 用于進行進一步分級。0082將上清液 I 進行進一步處理以顯著除去褐素和其它不想要的化合物、包括殘余的蛋白質。該處理包括 pH 調節(jié)和分離。調節(jié)上清液I 的 pH 以使 pH 增加至約 7.5(pH 調節(jié) 2)。在一項實施方案中，pH 調節(jié) 2 是經(jīng)由滴定法、采用 50氫氧化鈉 (NaOH) 以使細胞汁液上清液I 的 pH 由 3.0 提高至 7.5(pH 調節(jié) 2) 來完成的。pH 調節(jié) 2 使物質產(chǎn)生較深顏色，并且呈現(xiàn)出乳光，然后經(jīng)由分離使之凈化。在一項實施方案中，凈

52、化是使用連續(xù)流動離心機CEPA LE(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，德國) 在15,000rpm 和 30 秒的保留時間下完成的。該分離產(chǎn)生了褐色糊狀沉淀物 ( 沉淀物 II) 和褐色略微有乳光的上清液 ( 上清液 II)。0083 然后，將上清液 II 進行 pH 調節(jié) (pH 調節(jié) 3) 和過濾。調節(jié)上清液 II 的 pH 以降低pH 至約 3.6(pH 調節(jié) 3)。在一項實施方案中，采用 5.0N 鹽酸 (HCl) 對上清液 II 進行滴定12說明書CN 103200929 A10/42 頁以降低 pH 值至 pH 3.6(pH 調節(jié) 3)。該處理產(chǎn)生

53、了較淺顏色的經(jīng)滴定上清液 II，雖然其乳光略微增加。將 pH 經(jīng)調節(jié)的上清液 II 通過經(jīng)由孔為 0.2 微米的膜進行的滅菌過濾進行處理。所得濾液是淺色透明的無花果屬植物樹液級分 (FSF)。FSF 基本上由無花果屬植物葉子細胞的細胞質組成。0084 可以通過加入抗氧化劑、穩(wěn)定劑、螯合劑和防腐劑獲得樹液級分的進一步穩(wěn)定。在一項實施方案中，將下述添加劑加入到無花果屬植物樹液級分中 ：0.2焦亞硫酸鈉、0.1山梨酸鉀、0.1苯甲酸鈉和0.1尼泊金甲酯鈉。在該實施方案中，將混合物培育直至添加劑完全溶解 ( 30 分鐘 )。然后，向混合物中加入 1.9戊二醇。0085 FSF 的性質0086 所得的

54、FSF 表現(xiàn)出使其對于用作美容化妝用成分而言更期望的性質。這些性質包括穩(wěn)定性、水溶性、沒有不期望的物質如脫鎂葉綠酸和蛋白質、較淺顏色、較高固體含量和存在較高水平的期望化合物如苯丙氨酸。穩(wěn)定性研究表明，由來自這些方法的 FSF 產(chǎn)生的美容化妝用成分在室溫下穩(wěn)定至0087少 6。如本文所用的“穩(wěn)定”表示組合物在 STP( 標準溫度和：25，1atm) 下在黑暗干燥區(qū)域中貯存時其物理或化學性質歷經(jīng)指定的時間期限沒有顯著變化。這些性質包括顏色和化學組成。在一些實施方案中，F(xiàn)SF 和包含它的組合物穩(wěn)定至少 6，在其它一些實施方案中穩(wěn)定至少 12組合物穩(wěn)定 6 至 240088水溶性，在另一些實施方案中穩(wěn)定至少 24。在特定實施方案中，、12 至 24或 6 至 12。0089本發(fā)明的 FSF 也是水溶性的。如本文所用的“水溶性”指 FSF 以任意比例與水互溶( 在 STP 下)。因為 FSF 是水溶性的，所以在配制包含無花果屬植物的組合物中有更大的靈活性。例如，水基配制物由于它們的不油膩感、有利的鋪展性、亮膚感和易于從皮膚表面除去 ( 例如沖洗 ) 而通常是消費者所希望的。0090然而，采用