膿汁和糞便標本中病原菌的檢測-3

1、斜面斜面4 4支，空氣、手指皮膚、細菌分離培養(yǎng)物（上次實驗平板）支，空氣、手指皮膚、細菌分離培養(yǎng)物（上次實驗平板）器材準備器材準備空氣細菌檢查結果分析空氣細菌檢查結果分析 v細菌菌落直徑13mm，有光滑型、粗糙型、黏液型。v霉菌菌落比較大，呈棉絮狀、絨毛狀。霉菌和酵母菌最適培養(yǎng)溫度為2528。v計數(shù)菌落形成單位（CFU）,報告結果。3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時小時 室溫放置室溫放置4848小時小時 7272小時小時組號采樣時間(min)采樣地點菌落形成單位(CFU)1152153154155156157158159151015CFU /m3 50,000NAT 86N、66N、52N(直徑7c

2、m、8cm、9cm平板）N:平板菌落數(shù) A:平板面積(厘米） T:采樣時間(分鐘) CFU:colony forming unit空氣的細菌學檢查（結果錄入）空氣的細菌學檢查（結果錄入）WHO推薦的醫(yī)院各部門空氣細菌標準級別cfu/m3適用范圍級區(qū)10器官移植、心血管、矯形等外科手術室，保護性隔離室等，灌注或配制注射液實驗室級區(qū)200無菌室、手術室、供應室、嬰兒室、中心滅菌單位、術后恢復室、早產兒及產房、重癥監(jiān)護病房級區(qū)200500一般病房、治療室、放射室、衣帽室、按摩室、盥洗室、小手術室浴室級區(qū)傳染病科、同位素室級區(qū)衛(wèi)生間、貯藏室、太平間等我國公共場所空氣衛(wèi)生細菌學標準（GB96639673

3、-1996，GB16153-1996,平皿直徑9cm）撞擊法cfu/m3沉降法個/皿適用范圍1000 1035星級賓館、飯店1500 202星級以下賓館和非星級帶空調賓館、飯店2500 30普通飯店、招待所、酒吧、茶座、咖啡廳、圖書館、博物館、美術館、飛機客艙4000 40音樂廳、影劇院、游藝廳、舞廳、理發(fā)店、美容院（店）、游泳館、體育館、醫(yī)院候診室、候機室、旅客列車車廂、輪船客艙、飯館（餐廳）7000 75展覽館、商場（店）、書店、候車室、候船室手指皮膚的細菌學檢查甲和乙、丙和丁共用甲和乙、丙和丁共用1 1個平板個平板上:甲、丙常規(guī)洗手下:乙、丁標準洗手第1格為洗手前，第2格為洗手后，第3格

4、為消毒后，第4格空白對照。 三個手指分別在培養(yǎng)基表面觸摸觸摸23厘米丙丁1 2 3 4丙丁1 2 3 4手指皮膚細菌檢查結果分析手指皮膚細菌檢查結果分析 v比較洗手前后細菌的（顏色）種類洗前細菌種類多。洗后細菌種類少。洗手能洗掉大多數(shù)暫住菌。 v比較常規(guī)和標準洗手的細菌數(shù)量常規(guī)（簡單）洗手，平板上細菌數(shù)量少。標準洗手，平板上細菌數(shù)量多。常住菌數(shù)量大，牢固附著在皮膚上，常洗不掉， 可洗松動，經摩擦接種、脫落到培養(yǎng)基上，顯示細菌更多？外科手術人員洗手？ v碘酒和酒精棉球消毒以后，有沒有細菌生長？v空白對照有沒有細菌生長？v洗手前沒有細菌生長？Isolation and identification

5、 of bacteria from clinical specimens (Pus & Stool) - workflow culture media preparation isolated culture of bacteria pure culture of bacteria morphological examination of bacteria biochemisty, mobility, SCT & AST of bacteria serologic test, results analysis paper writing菌落特征 Bacterial Colony

6、 Characteristicsv大?。捍?直徑約3mm以上)，中(直徑約13mm)，小(直徑約1mm以下)。v形狀：圓形，卵圓形、假根形、絲狀、不規(guī)則等。v邊緣：整齊，鋸齒狀，波浪狀，羽毛狀。v表面：隆起、平坦、中心凸起、臍形凹陷；光滑或粗糙、濕潤或干燥。v色素：一般為無色或灰白色，特殊色素有兩類：脂溶性色素(菌落本身著色)和水溶性色素(菌落及培基均著色)。v溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周圍呈草綠色、不透明)，溶血(菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán))。金黃色葡萄球菌菌落特征X-SA 瓊脂培養(yǎng)基添加了顯色酶基質，金黃色葡萄球菌形成淡藍色菌落 。血瓊脂菌落直徑約2mm、圓形、隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊

7、，菌落周圍有透明的溶血環(huán)，溶血菌株大多有致病性。 Baird-Parker瓊脂菌落黑色，奶油狀，表面光滑，濕潤，圓形，凸起，有光澤，邊緣整齊，周圍繞以不透明圈 ( 沉淀 ), 其外常有一清晰帶 ( 卵磷脂環(huán) ) 。鏈球菌菌落特征血瓊脂甲型溶血性鏈球菌，菌落周圍有12mm寬的草綠色溶血環(huán)，稱甲型溶血或溶血。血瓊脂乙型溶血性鏈球菌，菌落周圍有24mm寬、紅細胞完全溶解、透明的溶血環(huán)，稱乙型溶血或溶血。血瓊脂丙型鏈球菌，不產生溶血素，菌落周圍無溶血環(huán)，稱不溶血性鏈球菌或溶血。甲型乙型丙型傷寒沙門菌菌落特征HE瓊脂Hektoen Enteric Agar沙門菌產生藍綠色、黑色中心菌落 XLD瓊脂Xyl

8、ose Lysine Desoxycholate Agar沙門菌產生較小黑色菌落SS瓊脂Salmonella Shigella Agar沙門菌產生較小黑色菌落志賀菌菌落特征HE瓊脂Hektoen Enteric Agar形成不發(fā)酵乳糖的深綠色菌落。麥康凱瓊脂MacConkey Agar 形成較小的，無色半透明不發(fā)酵乳糖的菌落。SS瓊脂Salmonella Shigella Agar 菌落圓形、液滴狀、邊緣整齊，濕潤，無色半透明。大腸埃希菌菌落特征麥康凱瓊脂MacConkey Agar含乳糖及中性紅指示劑，菌落呈紅色。伊紅美藍瓊脂eosin methylene blue Agar分解乳糖產酸，使

9、伊紅與美藍結合而形成紫黑色菌落，具有金屬光澤。SS瓊脂Salmonella Shigella Agar分解乳糖產酸，使膽鹽呈膽酸析出，形成中心渾濁的深紅色菌落（中性紅指示劑） 。細菌的純培養(yǎng) Pure Culturesv膿汁標本在普通平板上有金黃色、白色兩種菌落，菌落的色素是脂溶性的，是細菌本身的顏色。菌落直徑2mm左右、圓形、隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、不透明。37培養(yǎng)24小時 v糞便標本在伊紅美藍平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落，菌落色素是水溶性的，不是細菌本身的顏色，顏色的產生是因為大腸埃希菌分解乳糖產酸，酸使伊紅與美藍結合，形成紫黑色具有金屬光澤、大而隆起、不透明的菌落，菌落直徑

10、23mm。致病菌不分解乳糖，菌落呈伊紅的顏色，淡粉紅色，半透明，直徑12mm。37培養(yǎng)24小時 v若培養(yǎng)、放置時間過長或者平板上某個部位細菌比較多、菌落比較密集，大腸桿菌菌落顏色可能會發(fā)生改變。因為大腸桿菌利用完乳糖以后，就要利用蛋白質，蛋白質分解大多產生堿性物質，中和了乳糖分解時產生的酸。大腸桿菌菌落可能會由原來的紫黑色變成粉紅色，或者菌落中心黑色，邊緣粉紅色。由紫黑色變成粉紅色菌落中心黑色，邊緣粉紅色。大腸埃希菌菌落特征菌落特征改變劃線分離失敗！沒有典型單菌落劃線分離失敗！沒有典型單菌落菌落分布稀疏的區(qū)域單菌落較多。菌落分布密集的平板CFU(不同種屬)較多。紫黑色1/3,粉紅色2/3。紫黑

11、色1/2,粉紅色1/2。單菌落？菌落形成單位？單菌落？菌落形成單位？ 在菌落分布最稀疏的區(qū)域，選擇平板上相同的菌落數(shù)多的、典型的、容易挑取的單菌落。單菌落與菌落形成單位辨認比較困難單菌落？菌落形成單位？單菌落？菌落形成單位？斜面接種分工（小組）v甲普通平板金黃色金黃色菌落(auratusauratus，golden yellow)1支斜面 空氣污染的雜菌：微球菌（黃色、白色）、黃色小球菌，不能挑選。v乙普通平板白色白色菌落(albusalbus，white)1支斜面 v丙 EMB平板紫黑色紫黑色菌落(atropurpureus)1支斜面 v丁 EMB平板粉紅色粉紅色菌落(pink) 1支斜面戊

12、 EMB平板粉紅色粉紅色菌落(pink)1支斜面斜面正面上正面上2/32/3作標記： 組號 + 金黃、白色、紫黑、粉紅。 在平皿底部玻璃上，畫個大圈大圈選取菌落。得到同組一致認可，才能挑取。單菌落的挑選單菌落的挑選接種環(huán)接種環(huán)套住菌落套住菌落輕刮取菌輕刮取菌甲金黃色乙白色丙紫黑色丁戊粉紅色甲金黃, 乙白色。丙紫黑, 丁、戊粉紅。標記：組號，顏色 接 種 環(huán) 取菌 后 ， 伸 入斜 面 底 部 ，自 下 向 上 先拉 一 條 細 菌接種線。再伸入底部，自下向上，作蜿蜒劃線。細菌涂布接種在斜面培養(yǎng)基的表面。斜面接種法 Inoculation on agar slant*接種時，接種桿連接部不能碰到

13、斜面培養(yǎng)基。v接種環(huán)接種斜面一次，可產生幾十個微生物氣溶膠顆粒。v氣溶膠粒徑100um沉降很快,50um在0.4s內擴散開,5um通過呼吸道直接到達肺泡。vPike博士對實驗室感染統(tǒng)計分析結果發(fā)現(xiàn)，不明原因的感染高達82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴散引起的。v實驗時應坐穩(wěn)，很專注，不分心，在火焰周圍1020厘米內操作，保持安靜、有序，盡量少說話，以免感染病原菌。生物安全警告BIOHAZARD滅菌 收集平板 滅菌桶內（平板底部朝下，蓋朝上放置） 速送滅菌室 高壓蒸汽滅菌 洗刷。奧林巴斯 CX21型 生物顯微鏡顯微鏡的搬運A.請按圖所示，以雙手抓住鏡臂孔的兩側，小心搬運。B.搬運時，不得拿住載物臺

14、和鏡筒，以免造成損壞。開關與調整光強A.開或關之前，必須將亮度調整旋鈕按箭頭相反方向轉動到最小位置，以免損壞燈泡。B.電源開關撥到側為開，撥到側為關閉。C.按箭頭方向轉動亮度調整旋鈕變亮，相反方向轉動則變暗。調整聚光鏡位置和孔徑光闌A.用聚光鏡上下移動旋鈕，將聚光鏡轉到最上面。B.觀察時，將孔徑光闌環(huán)的10或100放到正面，與使用物鏡相對應的倍率一致。轉換物鏡A.旋轉物鏡轉盤，將希望使用的物鏡（10、100）轉到標本的上方。聚焦注：10倍物鏡的工作距離為10.5mm。油鏡的WD為0.13mm。A.從顯微鏡側面觀察，按箭頭方向轉動粗調旋鈕，使載物臺載物臺上的標本盡可能接近物鏡。B.一邊看目鏡，一

15、邊慢慢逆箭頭方向轉動粗調旋鈕， 使載物臺載物臺下降。C.看到標本以后，用微調旋鈕來正確對焦。100倍浸油物鏡使用方法A.油鏡放入光路之前，一定要在標本的觀察部位上加一滴浸油。B.旋轉物鏡轉盤，使油鏡進入光路，用微調旋鈕對好焦距。C.如果浸油內有氣泡，會影響觀察，可稍微旋轉物鏡轉盤，使油鏡來回通過12次浸油，排除油內氣泡。香柏油折射率香柏油折射率n=1.515n=1.515空氣的折射率空氣的折射率n=1.000n=1.000玻璃的折射率玻璃的折射率n=1.520n=1.520油浸鏡的原理光線光線 滴加香柏油可使滴加香柏油可使光線更多進入物鏡光線更多進入物鏡, ,避避免光線通過折射率低免光線通過折

16、射率低的空氣而散失的空氣而散失, ,以提高以提高物鏡的分辨率物鏡的分辨率, ,使物象使物象明亮清晰。明亮清晰。 放大倍數(shù)：目鏡放大倍數(shù)：目鏡1010倍倍物鏡物鏡9090或或100100倍倍。奧林巴斯奧林巴斯 CX21CX21型型 生物顯微鏡生物顯微鏡（實驗柜內，每人一臺）（實驗柜內，每人一臺）注意：只能橫放，不得豎放。注意：只能橫放，不得豎放。顯微鏡油鏡的使用v將標本放置、移動到光路上，用“黃色圈”的1010物鏡物鏡找到、看清楚標本。v將聚光器調到最高處。v調整孔徑光闌,將與物鏡相對應倍率調到正面（10100）v在標本觀察部位上滴加一滴香柏油。v將“白色圈”100100物鏡放入光路，浸泡于香柏

17、油中，可看到可看到模糊物象。v調整亮度及微調微調旋鈕，直到物象清晰為止觀察物象，記錄結果關閉電源。v油鏡處理：擦鏡紙拭去香柏油 擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦鏡紙擦拭油鏡。v顯微鏡罩上防塵罩 橫放在實驗柜內。 (順德校區(qū)）實驗臺兩側的電源插座，只能插入一個插頭，請選擇離你最近的電源插座。（校本部）實驗臺中間，三個位的插座，中間那位插孔沒有電，不能使用，只能用兩側的插座。醫(yī)學微生物學實驗綜合性實驗三、一v空氣、手指皮膚的細菌學檢查結果分析v膿汁和糞便標本中病原菌的檢測菌落特征觀察P11細菌純培養(yǎng)P10油鏡使用方法（講解）膿汁標本檢驗 （錄像）腸道致病菌的分離鑒定（錄像）試管用毛刷，試管用毛刷，上下、旋轉刷洗上下、旋轉刷洗內壁和管底。內壁和管底。字跡用濕紗布，字跡用濕紗布，沾去污粉擦拭。沾去污粉擦拭。管口朝向相同，管口朝向相同，流水沖洗流水沖洗1010次。次。洗干凈的試管，洗干凈的試管，倒扣在筐內，晾干。倒扣在筐內，晾干。平皿用紗布，旋轉擦平皿用紗布，旋轉擦拭內外側，字跡用紗拭內外側，字跡用紗布沾去污粉擦拭。布沾去污粉擦拭。流水沖洗流水沖洗1010次。逐個次。逐個倒扣在筐內，晾干。倒扣在筐內，晾干。思考題v在微生物學實驗中,怎樣才能避免雜