微生物英文文獻及翻譯—翻譯

1、A/O法活性污泥中氨氧化菌群落的動態(tài)與分布摘要：我們研究了在厭氧好氧序批式反應(yīng)器（SBR）中氨氧化菌群落（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌群落（NOB）的結(jié)構(gòu)活性和分布。在研究過程中，分子生物技術(shù)和微型技術(shù)被用于識別和鑒定這些微生物。污泥微粒中的氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)大體上與初始的接種污泥中的結(jié)構(gòu)不同。與顆粒形成一起，由于過程條件中生物選擇的壓力，AOB的多樣性下降了。DGGE測序表明，亞硝化菌依然存在，這是因為它們能迅速的適應(yīng)固定以對抗洗滌行為。DGGE更進一步的分析揭露了較大的微粒對更多的AOB種類在反應(yīng)器中的生存有好處。在SBR反應(yīng)器中有很多大小不一的微粒共存，顆粒的直徑影響這AOB和NOB的分布。中

2、小微粒（直徑<0.6mm）不能限制氧在所有污泥空間的傳輸。大顆粒（直徑>0.9mm）可以使含氧量降低從而限制NOB的生長。所有這些研究提供了未來對AOB微粒系統(tǒng)機制可能性研究的支持。關(guān)鍵詞：氨氧化菌（AOB），污泥微粒，菌落發(fā)展，微粒大小，硝化菌分布，發(fā)育多樣性 簡介在濃度足夠高的條件下，氨在水環(huán)境中對水生生物有毒，并且對富營養(yǎng)化有貢獻。因此，廢水中氨的生物降解和去除是廢水處理工程的基本功能。硝化反應(yīng)，將氨通過硝化轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，是去除氨的一個重要途徑。這是分兩步組成的，由氨氧化和亞硝酸鹽氧化細菌完成。好氧氨氧化一般是第一步，硝化反應(yīng)的限制步驟：然而，這是廢水中氨去除的本質(zhì)。對16S

3、 rRNA的對比分析顯示，大多數(shù)活性污泥里的氨氧化菌系統(tǒng)的跟ß-變形菌有關(guān)聯(lián)。然而，一系列的研究表明，在氨氧化菌的不同代和不同系有生理和生態(tài)區(qū)別，而且環(huán)境因素例如處理常量，溶解氧，鹽度，pH，自由氨例子濃度會影響氨氧化菌的種類。因此，廢水處理中氨氧化菌的生理活動和平衡對廢水處理系統(tǒng)的設(shè)計和運行是至關(guān)重要的。由于這個原因，對氨氧化菌生態(tài)和微生物學(xué)更深一層的了解對加強處理效果是必須的。當(dāng)今，有幾個進階技術(shù)在廢水生物處理系統(tǒng)中被用作鑒別、刻畫微生物種類的有價值的工具。目前，分子生物技術(shù)的應(yīng)用能提供氨氧化菌群落的詳細分類說明。如今，主要由于其細胞固定策略，好氧污泥顆粒處理已經(jīng)成為傳統(tǒng)廢水處理

4、的替代工藝。顆粒有更加徹底的緊密結(jié)構(gòu)和快速適應(yīng)速率。因此，顆粒污泥系統(tǒng)比傳統(tǒng)活性污泥法有更高的混合懸浮固體濃度濃度(MLSS)和更長的污泥齡(SRT)。更長的污泥齡能提供足夠長的時間讓時代時間長的微生物生長(例如氨氧化菌)。有些研究表示，硝化顆?？梢栽诟讳@離子廢水中培養(yǎng)出來，并且顆粒的直徑很小。其他研究報告說，大直徑顆粒已經(jīng)在序批式反應(yīng)器(SBR)中人工合成的有機廢水里培育出來了。污泥顆粒里的大量不同微生物共存，并去除COD和氮磷。然而，對于直徑大于0.6mm的大顆粒來說，由于氧傳遞被限制不能到達顆粒核心，外部好氧殼和內(nèi)部厭氧地帶共存。這些特性表明，大顆粒污泥內(nèi)部環(huán)境不適合氨氧化菌的生長。有些

5、研究表明，顆粒大小和密度導(dǎo)致了氨氧化菌、亞硝酸氧化菌和反硝化菌的分布和優(yōu)勢種群。雖然不少研究力求評估廢水處理系統(tǒng)中氨氧化菌的生態(tài)生理，但是至今仍然被污泥顆?；^程的水力學(xué)、分布、氨氧化菌群落的數(shù)量化限制著。 原理和方法 反應(yīng)器設(shè)置和操作污泥顆粒被接種在有效體積為4L的實驗室規(guī)模的SBR里。反應(yīng)器有效直徑和高度分別為10cm和51cm。水力停留時間設(shè)為8h。來自全尺寸污泥處理設(shè)置(中國天津污水處理廠)的活性污泥被作為反應(yīng)器的種污泥，其MLSS初始濃度為3876mg/L。反應(yīng)器操作6小時為一循環(huán)，由2分鐘的進水時間，90分鐘厭氧混合，240反正拋棄階段和5分鐘出水階段組成。在20天80個SBR循環(huán)

6、后，污泥沉降時間逐漸從10分鐘降到5分鐘，并且只有沉降速度大禹4.5m/h的顆粒才能在反應(yīng)器中停留。入流中的主要化合物包括NaAc(450mg/L)，NH4Cl(100mg/L)，(NH4)2SO4(10mg/L)，KH2PO4(20mg/L)，MgSO4·7H2O(50mg/L)，KCl(20mg/L)，CaCl2(20 mg/L)，F(xiàn)eSO4·7H2O(1mg/L)，and 0.1 mg/L元素示蹤劑。分析方法-TOC、TN、TP、MLSS、SVI都根據(jù)標準方法定期檢測。污泥大小分布由篩法決定。4個干凈的直徑為5cm鋼制篩，篩孔直徑分別0.9,0.6,0.45,和0.2

7、mm，這4個篩子被全程監(jiān)控。用友刻度的圓柱從反應(yīng)器中取100mL的污泥，然后放到0.9mm篩孔的篩子上。隨后用蒸餾水沖洗，直徑小于0.9mm的顆粒通過這個篩子，到達篩孔更小的篩子上。沖洗過程要重復(fù)幾次，以分開污泥團。不同面上收集到的顆?；謴?fù)用蒸餾水反沖洗。每一部分都手機在不同的燒杯里，然后用量化的濾紙過濾來測定TSS。一旦留在各個篩子上TSS的數(shù)量確定了，就可以確定不同大小的顆粒占污泥總重的比例了。 DNA提取和PCR-DGGE來自大約8mg的MLSS種的污泥被轉(zhuǎn)化成1.5mL的Eppendorf管，然后在14000g條件下離心10分鐘。移除上清液，向其中加入1mL磷酸鈉緩沖液，然后在無菌條件

8、下研磨以分離顆粒。使用E.Z.N.A.Soil DNA工具，離心物種DNA染色體被分離。為了放大氨氧化菌特征16s rRNA來進行DGGE，一個巢式PCR被用為先前描述。30µl的巢式PCR放大劑被加載并被在聚丙烯酰胺凝膠上的加了線性分布為35%-55%的變性劑DGGE分開。這個膠體在維持60度、140V、1×TAE緩沖液中(通用突變檢測系統(tǒng))運行6.5h。電泳結(jié)束后，銀染色和膠體的發(fā)展表現(xiàn)正如Sanguinetti所表述。接下來是空氣干燥和用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。凝膠掃描圖像用Quantity One分析，版本號4.31。成對群落相似性的色子指數(shù)是計算評估氨氧化菌群落在D

9、GGE中線路相似性的。這個用Quantity One測出的指數(shù)范圍從0%(無共同頻帶)到100%(頻帶相同)。Shannon多樣性指數(shù)（H）是用來衡量將一個菌群中每個菌種的豐富度和比例加入考慮的微生物多樣性。H用下列等式計算：其中，ni/N表示i菌種占總?cè)郝涞谋壤?i條帶亮度在條帶總亮度中的比例)。微生物系統(tǒng)樹圖模板相似性使用Quantity One不用非加權(quán)配對組算術(shù)平均數(shù)（UPGMA法）算法就能計算出來。突出的DGGE條帶被切除并溶解在30mL Milli-Q水中過夜，溫度維持4攝氏度。在冷凍解凍3次后凝膠中的DNA被回收。目標DNA片段的克隆及測序按照既定的方法（Zhang等，2010）

10、進行。 硝化細菌的分布為了調(diào)查AOB和NOB在顆粒中的空間分布，3種大小(0.2-0.45,0.45-0.6,>0.9 mm)的顆粒在第180天被選定做FISH分析。2mg的污泥樣品被固定在在4攝氏度下的4多聚甲醛溶液16-24 h，然后用磷酸鈉緩沖液沖洗兩次；樣本分別在在50%，80%和100%的乙醇中脫水10分鐘。在室溫下，將顆粒在乙醇二甲苯體積比分別為3:1，1:1，1:3然后100%二甲苯的溶液中連續(xù)浸泡，每次10分鐘后，顆粒中的乙醇然后完全被二甲苯取代。隨后，將顆粒在二甲苯與石蠟體積比為1:1的60度溶液中浸泡30分鐘，接著再在100%石蠟溶液中浸泡30分鐘，顆粒被石蠟嵌入。在

11、石蠟固化后，切為8mm厚的片，放置在涂了明膠的顯微鏡上。將切片在二甲苯和乙醇中各浸泡30分鐘，石蠟被去除，然后將切片干燥。三個寡核苷酸探針被用于雜交：FITC標記為Nso190，指明了大多數(shù)AOB；TRITC標記為NIT3，指明了硝化sp。所有的探針序列，雜交條件，以及洗滌條件都在表1中給出。寡核苷酸的合成以及熒光標記都來自Takara公司。雜交是在包含了各個標記了的探針(5ng µ/L)的46攝氏度度雜交緩沖液(0.9M NaCl,甲酰胺的百分比見表1，20mM Tris/ HCl，pH值8.0，0.01% SDS)下進行了2小時。雜交后，未被結(jié)合的寡核苷酸由一個嚴格的洗滌步驟去除

12、：在48度與洗滌液含有相同化合物的緩沖液中洗滌15分鐘。為了所有DNA的探測，DAPI被用甲醇最終稀釋到濃度為1ng µ/L。將切片用DAP-Iemethanol覆蓋并保持恒溫37度15分鐘。然后將切片用甲醇清洗一次，再用蒸餾水簡單清洗，完了立刻空氣干燥。使用Vectashield(媒介實驗室)以防止照片變白。使用激光共聚焦顯微鏡來抓拍雜交圖像(CLSM,Zeiss 710)。每種顆粒大小的每個探頭都各自一共拍了10張圖像。最后使用Adobe PhotoShop選出代表圖像和最終圖像的評價。表1：用于不同大小顆粒的寡核苷酸探針圖1：生物量和SVI10在整個操作過程中的變化 結(jié)果 SB

13、R性能及顆粒特征在啟動階段，反應(yīng)器能高效去除TOC以及氨氮。98%的氨氮和100%的TOC分別在第3天和第5天從入流中被去除(圖S2，S3)。這一期間總氮和總磷的去除率不高，雖然總磷的去除率逐漸提高，在第33天達到100%(圖S4)。為了確定污泥顆粒的污泥體積指數(shù)，沉淀時間由10分鐘代替30分鐘，因為顆粒污泥在60分鐘和5分鐘后有一個相似的SVI數(shù)值。接種污泥的SVI值是108.2Ml/g。在連續(xù)操作中MLSS和SVI10的變化如圖1所示。污泥沉降性在設(shè)置階段明顯提升。圖2反應(yīng)了污泥顆粒的慢速形成，從流動態(tài)到顆粒狀態(tài)。 DGGE技術(shù)分析：AOB的群落結(jié)構(gòu)在污泥顆?；械淖兓彩絇CR的結(jié)果在圖

14、S1中顯示。在GSBR的操作中，較好顯示的DGGE條帶被在代表性點上得到，那些條帶揭示AOB群落的結(jié)構(gòu)在污泥顆?；头€(wěn)定化過程中是動態(tài)的(圖3)。實驗結(jié)束時的菌群結(jié)構(gòu)與初始接種污泥的菌群結(jié)構(gòu)是不同的。AOB群落在第一天和GSBR操作的最后僅有40%的相似度，指明接種污泥和形成的顆粒污泥中AOB群落有重大變化。通過計算Shannon指數(shù)H分析DGGE模板得出的生物多樣性見圖5.圖2：污泥中顆粒大小分布在操作過程中的變化圖3：AOB群落在污泥顆?；^程中DGGE分析(頂部表示取樣時間)。主要條帶已用數(shù)字標出(條帶1-15)在污泥接種階段(在第38天前)，指數(shù)H由于反應(yīng)器中一些菌種的消失明顯下降。雖

15、然幾種接種污泥中的優(yōu)勢菌種(條帶2,7,10,11)得以保留，但是許多條帶削弱或消失了(條帶3,4,6,8,13,14,15)。在第45天后，多樣性指數(shù)趨于穩(wěn)定，并且顯示流動性變小(從0.72到0.82)。模板條帶相似性利用UPGMA程序分析。UPGMA分析顯示三個組菌落群相似度約為67%-78%，群體內(nèi)部約為44%-62%。一般來說，第一組與污泥接種和沖刷有關(guān)，第二組與污泥顆?；癝VI10值下降有關(guān)，第三組和穩(wěn)定系統(tǒng)及優(yōu)良的生物沉淀性有關(guān)。圖4：AOB菌落DGGE條帶的UPGMA分析樹圖。羅馬數(shù)字顯示主要集群。在圖3中，占優(yōu)條帶被從膠體中切除。這些條帶中的DNA被再次放大，克隆及排序。對這

16、些部分的16S rRNA排序(表2和圖S6)的比較分析揭露了補償了的13序列的系統(tǒng)附屬樹。在接種污泥中，細菌大多由亞硝化菌和亞硝化螺菌組成。隨著污泥顆粒化進行，大多數(shù)亞硝化菌(條帶2,5,7,9,10,11)仍然保留或者最終變?yōu)镚SBR的主導(dǎo)；然而，所有的亞硝化螺菌(條帶6,13,15)都從反應(yīng)器中逐漸消失。 AOB和NOB在不同尺寸顆粒中的分布我們使用FISH來確定AOB和NOB在不同尺寸污泥顆粒中的分布，得出的圖像并沒有進一步分析得出細胞數(shù)量。如圖6所示，在小顆粒(0.2 mm<d<0.45 mm)中，AOB主要分布在顆?？臻g的外部。在中等顆粒(0.45 mm<d<

17、0.6 mm)中，AOB甚至能分布到整個顆?？臻g，而NOB依然只存在于內(nèi)部空間。在大顆粒(d>0.9 mm)中，AOB和NOB大都處于顆粒的表面，更有甚者，NOB開始變得稀有。 討論 污泥顆粒形成與反應(yīng)器性能之間的關(guān)系在第32天后，SVI10穩(wěn)定在20-35mL/g，相對于測得的活性污泥的SVI10(100-150 mL/g)，這是一個非常低的數(shù)值。然而，在第32天測得的顆粒大小分布(圖2)表面僅有22%的生物量是由直徑大于0.2mm的顆粒污泥組成的。這些結(jié)果表面污泥沉降性提升提前于顆粒的形成，并在GSBR操作過程中不受不同污泥顆粒大小的影響。然而我們觀察到，顆粒直徑在較長時間內(nèi)一直波動

18、。大顆粒由于生物內(nèi)部呼吸趨于不穩(wěn)定，并分裂成可以再次形成大顆粒的小種子顆粒。Pochana和Keller報告說，通過物理破碎形成的污泥絮體有助于降低反硝化速率，因為其減少的缺氧空間。所以，在這次試驗過程中，總氮的去除率也是波動的。一些先前研究已經(jīng)證明，更大體積、更大密度的顆粒青睞于富裕的PAO。因此，在第77天后，總磷的去除率變得更高并相對穩(wěn)定，這是由于顆粒的質(zhì)量分數(shù)在90%以上了，并且有更大的顆粒形成了。 AOB群落動態(tài)與污泥顆粒化的關(guān)系為了顆粒形成，我們設(shè)定了小段的沉淀時間，并且僅有沉淀速度大于4.5m/h的顆粒才會在反應(yīng)器中去除。而且正如圖1所示，SVI10值的變化在第41天前很大(從1

19、08.2mL/g-34.1 mL/g)。在這一期間，大量微生物不能再反應(yīng)器中生存。我們觀測到一個明顯的菌數(shù)量增長，與第8天與第18天(表S1)有58%的相似性。在用基于醋酸合成廢水喂養(yǎng)的SBR系統(tǒng)中，非自養(yǎng)菌能比自養(yǎng)菌產(chǎn)生大量更多的胞外多糖。一些研究者發(fā)現(xiàn)，微生物在高剪切力的環(huán)境中會粘附胞外聚合物質(zhì)以抵抗由于環(huán)境壓力導(dǎo)致的懸浮細胞的傷害。而且，已經(jīng)被證明的是，接種污表2：選中的DGGE條帶的微生物種類鑒別泥中的優(yōu)勢異養(yǎng)菌在我們先前的研究中得以保存。眾所周知，AOB是生長緩慢的化能自養(yǎng)菌，因此，大量數(shù)量和密度不能變的足夠大以快速沉淀的群落被從系統(tǒng)中洗出去。作為結(jié)果，AOB在污泥接種階段的變化很明

20、顯，多樣性指數(shù)快速下降。在第45天后，由于污泥穩(wěn)定性的發(fā)展和更多微生物的保留，AOB群落的結(jié)構(gòu)變的穩(wěn)定。這些結(jié)果表明，短沉淀時間(選擇壓力)表面上能給微生物加壓，導(dǎo)致AOB群落處于暴力動態(tài)中。這些結(jié)果更進一步說明，特定數(shù)目的微生物可能歸功于GSBR操作上的成功，而且能得以持續(xù)，不管在群體相似性方面波動有多大。這些細菌群體的不穩(wěn)定性，加上一般可接受的生物反應(yīng)器性能，是符合從處理灰水的MBR所得到的結(jié)果的。亞硝化螺菌屬和亞硝化菌屬是廢水處理系統(tǒng)中AOB群落的主體。一個新先前研究揭露，AOB群落的主導(dǎo)群體十余多種污水處理過程不同的。一些研究者發(fā)現(xiàn)，在MBRs中是亞硝化菌為菌落主體，而在生物濾池中則是

21、亞硝化螺菌屬為菌落主體。在現(xiàn)今的研究中，序列分析表明選擇壓力明顯對顆粒污泥中的亞硝化菌生存有影響。幾乎所有的亞硝化菌一開始就被洗出，他們沒有機會跟著環(huán)境變化進化。然而，一些亞硝化螺菌屬的成員能產(chǎn)生更多兩的EPS，特別是處于氨被限制的條件下；而且這種特性也同一條帶上的其他成員身上觀察到。由此，這些EPS對群落細胞之間以及顆粒污泥是有幫助的。因此，大多數(shù)亞硝化螺菌能適應(yīng)這一挑戰(zhàn)(體積和密度變得足夠大以快速沉淀)并在反應(yīng)器中保存。在反應(yīng)器操作的最后(第180天)，不同大小的顆粒被過濾出來。我們研究了污泥顆粒大小變化對AOB群落組成的影響。如圖5所示，不同大小顆粒的AOB群落結(jié)構(gòu)不同。雖然集中主導(dǎo)條帶

22、(條帶2，5，11)。在所有樣品中都出現(xiàn)了，僅有條帶3和6在直徑大于0.6mm的顆粒上出現(xiàn)。同時，條帶7和10在直徑大于圖5：不同大小顆粒AOB群落的DGGE文件0.45mm的顆粒上強烈顯示。根據(jù)表2，我們可以清晰的推斷，亞硝化菌僅僅能在直徑大于0.6mm的顆粒上存在。因此，亞硝化菌在圖3上幾乎不存在，這是由于反應(yīng)器操作中，在TSS中的大顆粒分數(shù)較低所導(dǎo)致的。DGGE分析也解釋，大顆粒有比小顆粒更豐富的生物多樣性。這一結(jié)果也闡明，由于更大的空間和更適合生長的環(huán)境，更多的微生物能在大顆粒上生存(圖6)。圖6：不同直徑污泥顆粒微生物FISH分析結(jié)果 顆粒大小對AOB和NOB分布的影響雖然實驗中進水顆粒大小已經(jīng)被觀測，并模擬同時脫氮除磷，顆粒大小對不同生物種類分布的影響需要更進一步的研究，這一研究將借助可