湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)-02-核酸的結(jié)構(gòu)與功能-03_PDF轉(zhuǎn)換成word轉(zhuǎn)換器

1、 第三章核酸的結(jié)構(gòu)與功能 生物化學(xué)（第三版）輔導(dǎo)與習(xí)題集（王鏡巖生物化學(xué)配套輔導(dǎo)）戴余軍 著湖北辭書出版社2010 - 06當(dāng)當(dāng)價：¥20.80 第三章核酸的結(jié)構(gòu)與功能第一節(jié)核酸通論第二節(jié)核酸基本構(gòu)件單位核苷酸第三節(jié) DNA的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié) RNA的分子結(jié)構(gòu)第五節(jié)核酸的某些理化性質(zhì)第六節(jié)核酸研究常用技術(shù) 第五節(jié)核酸的某些理化性質(zhì)一、核酸的水解二、核酸的兩性解離性質(zhì)三、核酸的紫外吸收（max=260nm）四、核酸的變性、復(fù)性、增（減）色效應(yīng)五、核酸的熔解溫度（Tm） 一、核酸的水解核酸可被酸、堿或酶水解成為各種組分，其水解程度因水解條件而異，水解產(chǎn)物可用層析、電泳等方法分離。堿水解&#

2、216;RNA能被稀堿水解，在水解過程中，隨著磷酸二酯鍵的斷裂，先生成2,3-環(huán)核苷酸中間物，最后生成2-核苷酸和3-核苷酸的混合物。ØDNA由于不存在2-OH，對稀堿有一定抗性酸水解在酸性條件下，磷酸酯鍵比糖苷鍵更穩(wěn)定，其中穩(wěn)定性最差的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。所以，若對核酸進(jìn)行酸水解，首先生成的是無嘌呤酸(apurinic acid）。 核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。Ø依據(jù)底物不同分類DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)：專一降解DNA。RNA酶 (ribonuclease, RNase)：專一降解RNAØ依據(jù)切割部位不同。核酸內(nèi)

3、切酶：分為限制性核酸內(nèi)切酶和非特異性限制性核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶：5´3´或3´5´核酸外切酶。 RNase實(shí)驗(yàn)室常用的RNase有兩種，其一是牛胰核糖核酸酶(pancreatic ribonuclease)，又稱RNase I或RNaseA，是一種專一性內(nèi)切酶，水解產(chǎn)物為3'-嘧啶核苷酸，和以3'-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。其二是核糖核酸酶T1(ribonuclease T1)，水解產(chǎn)物為3'-鳥嘌呤核苷酸，和以3'-鳥嘌呤核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。 DNase實(shí)驗(yàn)室常用的DNase有牛胰脫氧核糖核酸酶(DNase I, p

4、ancreatic deoxyribonuclease)，可以將單鏈或雙鏈DNA水解為平均長度為4個核苷酸的，以5'-磷酸為末端的寡聚核苷酸。牛脾脫氧核糖核酸酶(DNase II, spleendeoxyribonuclease)，可以將單鏈或雙鏈DNA水解為平均長度為6個核苷酸的，以3'-磷酸為末端的寡聚核苷酸。 核酸的一般理化性質(zhì)1.核酸為兩性電解質(zhì)，通常表現(xiàn)為酸性。2.DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，不溶于有機(jī)溶劑。3.DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多。4.RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對堿穩(wěn)定。5.沉降行為:不同構(gòu)象的核酸分子的沉降的速率有很

5、大差異，這是超速離心法提取和純化核酸的理論基礎(chǔ)。 二、核酸的酸堿性質(zhì)磷酸基的解離胞嘧啶的解離 腺嘌呤核苷酸pK2¢ = 3.7核苷含氮環(huán) pK3 = 6.2第二磷酸基pK1¢ = 0.9第一磷酸基酸的解離曲線鳥嘌呤核苷酸pK2¢ = 3.7含氮環(huán)離子pK1¢ = 0.7第一磷酸基pK3¢ = 6.1第二磷酸基烯醇式羥基化程度pK2¢ = 4.3含氮環(huán)胞嘧啶核苷酸pK3 = 6.3第二磷酸基pK1¢ = 0.8第一磷酸基尿嘧啶核苷酸pK1¢ = 1.0pK3¢ = 6.4第一磷酸基 第二磷酸基烯醇式羥基pH

6、 三、核酸分子具有強(qiáng)烈的紫外吸收核酸在波長 260nm處有強(qiáng)烈的吸收，是由堿基的共軛雙鍵所決定的。這一特性常用作核酸的定性和定量分析。 堿基的紫外吸收光譜 紫外吸收的應(yīng)用ØDNA或RNA的定量A260= 1.0相當(dāng)于50g/mL雙鏈DNA(dsDNA)40g/mL單鏈DNA (ssDNA or RNA)20g/mL寡核苷酸Ø確定樣品中核酸的純度分別測定蛋白和核酸在260和280的OD值：純的 DNA兩者比值: A260/A280= 1.8純的RNA兩者比值: A260/A280= 2.0 四、核酸的變性、復(fù)性變性：在物理、化學(xué)因素影響下， DNA堿基對間的氫鍵斷裂，雙螺旋解

7、開，這是一個是躍變過程，伴有A260增加（增色效應(yīng)）,DNA的功能喪失。復(fù)性：在一定條件下，變性DNA 單鏈間堿基重新配對恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，伴有A 260減?。p色效應(yīng)）,DNA的功能恢復(fù)。變性（加熱）復(fù)性（緩慢冷卻） DNA解鏈時的紫外吸收變化30.40.3123天然DNA21變性DNA光吸收核苷酸總吸收值0.20.1220 240 260 280波長（nm）Ø增色效應(yīng) (hyperchromic effect)： DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。這是由于在雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基有規(guī)律的緊密堆積降低了其對紫外光的吸收。 五、DNA的熔解曲線（melting curve）連續(xù)加熱

8、DNA的過程中以溫度相對于 A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。解鏈溫度(melting temperature，Tm)解鏈過程中，紫外吸光度的變化達(dá)到最大吸收（完全變性）的一半時所對應(yīng)的溫度。即此時的 50%的DNA雙鏈被打開DNA的Tm值一般為70-85 影響Tm的因素(1) DNA的均一性越高，Tm的溫度范圍越小。(2) G-C含量越高， Tm的值越大，若GC的含量上升1%，則Tm上升0.41。馬默多蒂（Marmur-Doty）關(guān)系式：Tm = 69.3 + 0.41(G + C)%，或GC% =（Tm - 69.3）× 2.44(3) 介質(zhì)的離子強(qiáng)度較高時， Tm的值較大

9、。（中和負(fù)電荷，降低排斥力，穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)）(4) 變性劑如甲酰胺、尿素、甲醛等可破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。 第三章核酸的結(jié)構(gòu)與功能第一節(jié)核酸通論第二節(jié)核酸基本構(gòu)件單位核苷酸第三節(jié) DNA的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié) RNA的分子結(jié)構(gòu)第五節(jié)核酸的某些理化性質(zhì)第六節(jié)核酸研究常用技術(shù) 第六節(jié)核酸研究常用技術(shù)一、分子雜交二、PCR三、DNA序列測定 一、核酸分子雜交(hybridization)Ø不同種類的 DNA單鏈分子或 RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件可以在不同的分子間形成雜交雙鏈(heteroduplex)。Ø這種雜交

10、雙鏈可以在不同的 DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。 分子雜交的應(yīng)用Ø 研究DNA分子中某一種基因的位置。Ø 鑒定兩種核酸分子間的序列相似性。Ø 檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否。 分子雜交探針：用放射性同位素或熒光標(biāo)記，或特定的基團(tuán)(如生物素，地高辛)標(biāo)記的DNA或RNA片段。原位雜交技術(shù)：直接用探針與菌落或組織細(xì)胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。點(diǎn)雜交：將核酸直接點(diǎn)在膜上，再與核酸雜交。Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再進(jìn)行雜交。Nor

11、thern印跡法：將電泳分離后的RNA吸印到硝酸纖維素膜上再進(jìn)行分子雜交。 Northern/Southern Blot基本流程圖制備總RNA/DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移至薄膜與同位素標(biāo)記的特異性探針雜交放射性自顯影 法可用于檢測特異的序列片 基因芯片發(fā)展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray 基因芯片（Gene Chip）基因芯片,又稱DNA微陣列(DNA microarray），將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地高密度地排列固定于支持物上，制成基因微陣列,樣品（DNA/RNA）通過PCR擴(kuò)

12、增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息?？蓪蛐蛄屑肮δ苓M(jìn)行大規(guī)模、高通量地研究。 DNA Microarray analysis of gene expressionTreatment / controlNormal / tumor tissueBrain / liver Image of a DNA Microarray 二、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）定義： PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction)，是通過模擬體內(nèi)

13、 DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將 DNA某個特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的技術(shù)。原理：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán)的反應(yīng)過程,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。靈敏度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好、操作簡便、快速 循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度 30次擴(kuò)增100萬倍 PCRu理論擴(kuò)增率： 2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)）， 2530循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加10 倍。9u實(shí)際擴(kuò)增率：() ，X為PCR的

14、實(shí)際擴(kuò)增率，n平均約為75%。u由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行 30個循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106107。u以“變性、退火、延伸”三部曲為 PCR一輪循環(huán)。 DNA測序技術(shù)的歷史第一代DNA測序技術(shù)三測序方法的原理第二代DNA測序技術(shù)三個測序平臺的工作原理及操作步驟第三代DNA測序技術(shù)單分子測序的特點(diǎn)及應(yīng)用前景自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個測序技術(shù)的發(fā)展歷程。 1998 2000 2001 200220042006 200720082009 201020112012 DNA測序技術(shù)的誕生和發(fā)展DN

15、A測序技術(shù)的誕生（第一代DNA測序技術(shù)）v 1977年，英國劍橋醫(yī)學(xué)研究會的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Frederick Sanger發(fā)明雙脫氧鏈終止法DNA測序技術(shù)(Sanger和Coulson)v 1977年，美國哈佛大學(xué)生化學(xué)家Walter Gilbert發(fā)明DNA化學(xué)降解法測序技術(shù)(Maxam 和Gilbert,1977)Ø1980年， Sanger和Gilbert因建立DNA測序技術(shù)而獲得諾貝爾化學(xué)獎（Sanger是第2次獲得諾貝爾化學(xué)獎） 1、雙脫氧鏈終止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種dNTP存在條件下復(fù)制時，在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸( ddN

16、TP) ，因?yàn)殡p脫氧核苷沒有3 ´-OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長，若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3 ´端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分4個泳道進(jìn)行凝膠電泳,分離長短不一的核酸片段，長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后,根據(jù)片段3端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。 用于終止反應(yīng)的雙脫氧核苷酸Ø將2 ，3 雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3 羥基，因此不能與下一位核苷酸反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應(yīng)將中止。

17、 技術(shù)路線與要求A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性制備單鏈模板B M13克隆單鏈DNAC 噬粒克隆DNA將單鏈模板與一小段引物退火D PCR產(chǎn)生單鏈DNA加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP分別加入少量4種雙脫氧核苷酸將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列 2.化學(xué)降解法美國哈佛大學(xué)的Maxam和Gilbert于1977年發(fā)明的，化學(xué)降解法主要用于測定短片段DNA的序列。用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割。由此產(chǎn)生的一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳和放射自顯影后，直接

18、讀出待測DNA片段的核苷酸順序。 化學(xué)裂解法測定DNA的核苷酸序列 Ø Maxam-Gilber法所能測定的長度要比Sanger法短一些，它對放射性標(biāo)記末端 250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。Sanger 法需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高質(zhì)量酶制劑，而Maxam-Gilbert法只需簡單化學(xué)試劑。Ø 隨著M13 噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物唾手可得及測序反應(yīng)日臻完善，雙脫氧鏈終止法如今遠(yuǎn)比Maxam-Gilbert法應(yīng)用得廣泛。Ø 然而，化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點(diǎn)：所測序列來自

19、原DNA 分子而不是酶促合成所產(chǎn)生的拷貝。因此，利用Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進(jìn)行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況。Ø 由于Sanger法既簡便又快速，因此是現(xiàn)今的最佳選擇方案。事實(shí)上，目前大多數(shù)測序策略都是為Sanger法而設(shè)計(jì)的。 3、熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理，用四種不同的熒光混合物分別標(biāo)記四種反應(yīng)的產(chǎn)物，用四種反應(yīng)物混合在一起進(jìn)行電泳，在激光的激發(fā)下四種帶有不同熒光染料標(biāo)記物的ddNTP可以在同一反應(yīng)管種進(jìn)終止測序反應(yīng)，并于變性的聚丙烯酰胺凝膠的同一泳道中進(jìn)行電泳檢測。當(dāng)帶有某種熒光素標(biāo)記的DNA片段電泳到激光探頭的檢測

20、范圍時，激光所激發(fā)的熒光信號被探測器接受，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，自動排列出DNA序列。 第一代半自動測序示意圖 第一代全自動測序 毛細(xì)管電泳測序用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，可使DNA的測序速度更為迅速。這種電泳裝置有96個泳道，每次可同時進(jìn)行96次測序，每輪實(shí)驗(yàn)不到2小時，1天可完成近千次反應(yīng)。 毛細(xì)管電泳測序裝置 第一代測序法的比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)雙脫氧末端終止法 化學(xué)降解法 熒光自動測序技術(shù)操作簡便，結(jié)果清晰可靠，一次能確定300500個核苷酸序不需要進(jìn)行酶促反應(yīng)，可以分析 自動化程度高，高甲基化等DNA的 效率，精確度增加列，已成為最常用的修飾情況DNA測序方法一次最多只能分花費(fèi)時間過久

21、，成本 析250個核苷酸，純化量小，不能純化較長的片段較高所用的許多化學(xué)試劑有毒 第二代DNA測序技術(shù)p二代測序的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列。p第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測序,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。p第二代測序技術(shù)主要包括羅氏公司的454（GS FLX）測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺。 1、 Roche 454GS FLX454公司可謂新一代測序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公

22、司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System，被Nature雜志以里程碑事件報(bào)道，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河。后來，他們又推出了全新的GS FLX系列試劑和軟件的補(bǔ)充，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，準(zhǔn)確性、讀長也進(jìn)一步提升。 Roche 454測序原理原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時檢測DNA序列的目的。 乳液PCR（emRCR）每個獨(dú)特的片段在

23、自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對于每一個片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，攜帶擴(kuò)增片段的磁珠進(jìn)入進(jìn)入反應(yīng)板。 一個磁珠一條讀長Ø放置在單獨(dú)的試劑瓶里的堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入反應(yīng)板，每次只進(jìn)入一個堿基Ø如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。Ø焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號，并被高靈敏度CCD捕獲到。 GS FLX測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)GS FLX系統(tǒng)的測序也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)

24、。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；特點(diǎn)：分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動化。 2.Illumina -Solexa Genome AnalyzerSolexa系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（Sequencing BySynthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基。

25、此時，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號結(jié)果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。 Solexa測序技術(shù)的特點(diǎn)通量高：目前一臺機(jī)器在兩周內(nèi)最高可產(chǎn)出360G的數(shù)據(jù);準(zhǔn)確率高：高于98.5% ，同時也有效地解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題;成本低：低于傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)的成本; 3. ABI SOLiD測序技術(shù)SOLiD的獨(dú)特之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測序。就通量而言，SOLiD 3系統(tǒng)是革命性的，目前SOLiD 3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。而其無以倫比的準(zhǔn)確性、系統(tǒng)可靠性和可擴(kuò)展性更讓它從其他新一代測序平臺中脫穎而出。 三大測序平臺的技術(shù)特點(diǎn)和差異大約讀長(堿基數(shù))平臺名稱檢測方法公司測序方法優(yōu)點(diǎn)相對局限性樣品制備較難；難于在第二代中最高讀長；處理重復(fù)和同種堿基比第一代的測序通量 多聚區(qū)域；試劑沖洗基因組羅氏 測序儀 焦磷酸測230-400光學(xué)/454 FLX系統(tǒng)序法大帶來錯誤累積；儀器昂貴HiSeq2illumina可逆鏈終000/mi 止物和合Seq 成測序法儀器昂貴；用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分