病毒的研究方法

1、分離技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)血清學(xué)方法分子生物學(xué)方法圖1.1 混合物分離原料（混合物）原料（混合物）殘余物殘余物分離設(shè)備分離設(shè)備分離劑分離劑產(chǎn)產(chǎn) 品品進(jìn)一步綜合利用進(jìn)一步綜合利用一、分離技術(shù)機(jī)械分離機(jī)械分離傳質(zhì)分離傳質(zhì)分離分類分類反應(yīng)分離反應(yīng)分離1、機(jī)械分離 過濾分離：過濾介質(zhì) 固體顆粒大小 沉降分離：重力作用 密度差 離心分離：離心力 密度差 旋風(fēng)分離：慣性力 密度差 靜電除塵：靜電場 使細(xì)顆粒帶電特點：相間無物質(zhì)傳遞離心 常用于病毒的純化A:等速度沉降，B:等密度沉降2、傳質(zhì)分離平衡分離過程：平衡分離過程：蒸發(fā)、蒸餾、吸收、萃取、結(jié)晶、離子交換、吸附、蒸發(fā)、蒸餾、吸收、萃取、結(jié)

2、晶、離子交換、吸附、干燥、浸取、泡沫吸附等干燥、浸取、泡沫吸附等傳質(zhì)分離傳質(zhì)分離速率控制分離過程：速率控制分離過程：氣體擴(kuò)散氣體擴(kuò)散熱擴(kuò)散熱擴(kuò)散電滲析電滲析電泳電泳反滲透反滲透微濾、超濾和納濾微濾、超濾和納濾3、反應(yīng)分離 可逆反應(yīng)（如離子交換、反應(yīng)萃?。徊豢赡娣磻?yīng)（反應(yīng)吸收、反應(yīng)結(jié)晶）；分解反應(yīng)（生物分解、電化學(xué)反應(yīng)、光化學(xué)反應(yīng)）等。二、電子顯微鏡技術(shù)1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（TEM），電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。技術(shù)方法 負(fù)染色法 超薄切片技

3、術(shù) 免疫電鏡技術(shù) 冷凍電鏡技術(shù) 肌動蛋白纖維的負(fù)染電鏡照片用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色。1、負(fù)染色法通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度2050nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差.萊卡超薄切片機(jī)2 2、超薄切片技術(shù)、超薄切片技術(shù)冰凍蝕刻,亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，進(jìn)行冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻。在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu).3、冰凍蝕刻、冰凍蝕刻人冠狀病毒（左）與SARS冠狀病毒病毒粒子三

4、維重構(gòu)模型電鏡觀察發(fā)現(xiàn)痘病毒是整個病毒粒子通過吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的三、組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)指從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理條件在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長。1 1、組織培養(yǎng)的原理組織培養(yǎng)主要是為病毒易感的組織細(xì)胞提供一個良好的生存環(huán)境，使細(xì)胞對環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性，獲得生長繁殖的能力。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）群體培養(yǎng)群體培養(yǎng): : 將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層。中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層。克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng): : 將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各

5、個細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增中，各個細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克隆。殖每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克隆。2、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)：原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)：分離病毒最為敏感分離病毒最為敏感 二倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞 ：用于病毒分離和疫苗制備用于病毒分離和疫苗制備 傳代細(xì)胞系傳代細(xì)胞系 ：用于病毒的分離鑒定和抗病用于病毒的分離鑒定和抗病毒藥物篩選研究。毒藥物篩選研究。病毒基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：病毒基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：用于病毒基因調(diào)控用于病毒基因調(diào)控和抗病毒藥物的研究。和抗病毒藥物的研究。常用的細(xì)胞培養(yǎng)常用的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE） 由病毒增殖

6、引起的細(xì)胞改變，稱細(xì)胞病變效應(yīng)。3、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件 細(xì)胞接種數(shù)：接種傳代細(xì)胞一般為1030萬/ml 合成培養(yǎng)液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagles MEM。 酸堿度：細(xì)胞生長最適宜的PH范圍是7.07.4。 溫度：細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度與細(xì)胞來源的動物體溫一致。 無菌條件 培養(yǎng)器皿的處理4 4、組織培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：可提供大量生物性狀相同的細(xì)胞作為研究對象，對疫苗生產(chǎn)來說，其抗原性更接近于自然流行株，可減少宿主蛋白成分，減少變態(tài)反應(yīng)。缺點：病毒復(fù)制后滴度低，不易保存，保存時易使病毒滴度丟失，傳代細(xì)胞含致癌因子，不宜用于疫苗生產(chǎn)。且隨著細(xì)胞代數(shù)增加，對病毒敏感性也隨之下降。四、血清

7、學(xué)方法 中和試驗：適用于病毒鑒定，機(jī)體中抗體的檢測，分析病毒抗原的性質(zhì)，疫苗接種效果評估等 補(bǔ)體結(jié)合試驗 血凝抑制試驗：常用于正粘病毒和副粘病毒感染的診斷和病毒亞型鑒定及抗原變異的監(jiān)測，如流感病毒的分型 酶聯(lián)免疫吸附試驗 放射免疫試驗免疫熒光檢測五、病毒學(xué)研究常用方法 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 轉(zhuǎn)印雜交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot 蛋白質(zhì)組學(xué)：肽圖譜 基因組學(xué)：核酸序列測定及基因功能 基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽 、病毒載體2、傳質(zhì)分離平衡分離過程：平衡分離過程：蒸發(fā)、蒸餾、吸收、萃取、結(jié)晶、離子交換、吸附、蒸發(fā)、蒸餾、吸收

8、、萃取、結(jié)晶、離子交換、吸附、干燥、浸取、泡沫吸附等干燥、浸取、泡沫吸附等傳質(zhì)分離傳質(zhì)分離速率控制分離過程：速率控制分離過程：氣體擴(kuò)散氣體擴(kuò)散熱擴(kuò)散熱擴(kuò)散電滲析電滲析電泳電泳反滲透反滲透微濾、超濾和納濾微濾、超濾和納濾肌動蛋白纖維的負(fù)染電鏡照片用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色。1、負(fù)染色法通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度2050nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差.萊卡超薄切片機(jī)2 2、超薄切片技術(shù)、超薄切片技術(shù)人冠狀病毒（左）與SARS冠狀病毒病毒粒子三維重構(gòu)模型電鏡觀察發(fā)現(xiàn)痘病毒是整個病毒粒子通過吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的2、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)：原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)：分離病毒最為敏感分離病毒最為敏感 二倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞 ：用于病毒分離和疫苗制備用于病毒分離和疫苗制備 傳代細(xì)胞系傳代細(xì)胞系