第16章分子育種

1、第16章 分子育種市場對園林植物新品種要求的增多及珍貴野生資源的過度開發(fā)，致使基因資源匱乏，傳統(tǒng)育種方法表現(xiàn)出了局限性，自然條件下，植物變異頻率較人類需要的要小得多；人工誘變雖然提高了變異頻率，但盲目性較大。雜交育種雖然能彌補兩者不足，卻也存在著遠緣雜交不親和性、物種生殖隔離等問題，導(dǎo)致目前園林植物育種難以滿足快速發(fā)展的社會需要。 分子育種包括基因工程和分子標記輔助選擇育種兩部分。 基因工程是指利用DNA重組技術(shù)，把經(jīng)過分離或人工構(gòu)建的目的基因通過適當?shù)霓D(zhuǎn)基因方法插入到植物基因組中，使該基因得到表達并能遺傳至后代的技術(shù)體系。通過外源基因?qū)耸怪系街参锘蚪M上，可以使之最終表達為觀賞性狀從而

2、創(chuàng)造植物新品種。 分子標記輔助育種過利用與目標性狀緊密連鎖的DNA分子標記對目 標性狀進行間接選擇，以便在早期就能夠?qū)δ繕嘶虻霓D(zhuǎn)移進行準確、穩(wěn)定的選 擇，而且克服隱性基因再度利用時識別的困難，從而加速育種進程，提高育種效率，選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種。一、進展 經(jīng)過近20年的發(fā)展，已成功克隆了許多重要的功能基因，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法進行了多種園林植物的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了矮牽牛、香石竹、菊花、百合、石斛等園林植物的轉(zhuǎn)化體系和轉(zhuǎn)化植株。在花色、采后保鮮、株型、香味方面取得了重要進展。二、基因工程植物基因工程是近20年來隨著DNA重組技術(shù)、 植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)而發(fā)展起來的現(xiàn)代生

3、物技術(shù)。1.目的基因的選取觀賞植物基因工程的目的基因1、觀賞性 開花、花色、花型、花徑相關(guān)基因。2、抗逆性 抗蟲、抗旱、耐鹽堿、抗寒相關(guān)基因3、切花壽命4、花期調(diào)控2.外源基因?qū)胫参锏姆椒╲載體介導(dǎo)法（間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法）v農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化v 利用土壤中的根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的發(fā)病過程，將外源基因轉(zhuǎn)入植物細胞。根癌農(nóng)桿菌侵染后產(chǎn)生冠纓瘤，Ti質(zhì)粒與此有關(guān)；發(fā)根農(nóng)桿菌產(chǎn)生發(fā)狀根，Ri質(zhì)粒與此有關(guān)。 病毒介導(dǎo)法植物載體在宿主細胞內(nèi)能夠自我復(fù)制，將外源基因插入到病毒載體的基因組中，通過病毒對植物細胞的感染，就可以將外源基因?qū)胨拗髦参锛毎?。DNA病毒載體和RNA病毒載體煙草花

4、葉病毒，煙草脆裂病毒和雀麥花葉病毒。染色體介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)化用分離到的中期染色體作為轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的介體，先將供體細胞用秋水仙堿處理時其受阻從而染色體固宿，然后破碎細胞，通過差速離心分離出染色體，再將染色體與受體細胞混合，部分染色體被吞噬到細胞質(zhì)中，被頓裂成許多小片段后，有些小片段可能進入核內(nèi)，于受體細胞染色體整合。v直接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法 將外源DNA直接導(dǎo)入原生質(zhì)體包括電穿孔法、 PEG法、超聲波沖擊法、脂質(zhì)體融合法、基因槍法、微激光法、電泳法、超聲波介導(dǎo)法、碳硅纖維導(dǎo)入法、離子束介導(dǎo)法等 生殖細胞轉(zhuǎn)移法 花粉管通道法 花粉介導(dǎo)法 微注射法 種胚浸泡法需要具備如下條件： 高效的植株再生體系。選擇容易從體

5、細胞再生植株的受體基因型是獲得轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。 受體植物細胞對農(nóng)桿菌要有很高的親和力。一般認為受體細胞應(yīng)處于高度的分裂狀態(tài)，T-DNA才能插入植物基因組； 具有有效的選擇系統(tǒng)。必須有一個理想的選擇方法將轉(zhuǎn)化細胞從非轉(zhuǎn)化細胞中選擇出來； 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達。外源基因轉(zhuǎn)入植物后應(yīng)能傳代并穩(wěn)定表達。v農(nóng)桿菌法一般技術(shù)程序 農(nóng)桿菌侵染植物細胞、細菌與植物細胞共培養(yǎng)、在篩選培養(yǎng)基上篩選、獲得轉(zhuǎn)化細胞克隆、轉(zhuǎn)化細胞分化并再生植株。 葉圓盤轉(zhuǎn)化法。帶有傷口的植物葉片的圓盤。使用的外植體可以是葉圓盤、下胚軸、胚性愈傷組織等。F1. 共培養(yǎng)2. 在選擇培養(yǎng)基上篩選3. 篩選獲得的抗性愈傷 5. 胚萌發(fā)成苗

6、6. 轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4. 抗性愈傷分化成胚狀體選擇是為了將轉(zhuǎn)化細胞與非轉(zhuǎn)化細胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細胞具有生長優(yōu)勢。在構(gòu)建載體時，往往在目的基因上連上一個選擇標記基因。通常使用的是抗生素抗性基因，如NPTII基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，能分解卡那霉素等抗生素。其它選擇標記基因，如抗除草劑基因，報告基因（如：GUS基因）等。選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng)w質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建啟動子啟動子 外源基因外源基因 終止子終止子 啟動子啟動子 報告基因報告基因 終止子終止子 （標記基因）（標記基因） 目的片段目的片段 選擇標記選擇標記 載體載體報告基因的種類l 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（ Neomycine pho

7、sphotransferase II, NPT II)基因l 氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶（Chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因l 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hygromycin phosphotransferase, Hpt）基因l 葡萄糖酸苷酶 （ Glucuronidase, GUS）基因l 熒光素酶（Luceferase, Luc）基因1. 抗除草劑（Basta, Bar）基因u基因槍法（gene gun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴毎囊环N轉(zhuǎn)化技術(shù)。v基因槍法 優(yōu)點：（1）無宿主限制?？梢詫θ魏位蛐筒牧线M行轉(zhuǎn)化研究；(2)靶受體幾乎包括所有具有潛

8、在分化能力的組織或細胞。（3）易于操作。 缺點：如轉(zhuǎn)化頻率低、嵌合體較多、結(jié)果的重復(fù)性差，轉(zhuǎn)化的外源基因以多拷貝居多，易導(dǎo)致基因沉默，實驗成本較高等。還有很多將外源基因引入植物基因組的方法，如電激法、花粉管通道法、超聲波法等，它們都在不同程度上得到應(yīng)用。3.轉(zhuǎn)基因植物的鑒定抗生素篩選報告基因篩選PCR檢測PCR檢測外源基因的原理是根據(jù)被轉(zhuǎn)移的外源基因（目的基因或選擇標記基因）設(shè)計引物，擴增外源基因的片段。如果擴增出的片段與設(shè)計的一對引物之間的實際片段在長度上相吻合，說明基因已轉(zhuǎn)入受體細胞。Southern雜交將DNA用限制性酶酶切酶切DNA電泳變性轉(zhuǎn)移到膜上經(jīng)過標記的DNA探針與膜上的DNA片

9、段雜交洗去膜上非特異性結(jié)合的探針檢測雜交信號 。如果轉(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會檢測到雜交帶信號。Northern雜交Northern雜交是一種RNA-DNA雜交。 將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上； 將它們原位轉(zhuǎn)移到固相膜上；在適宜的離子強度及溫度條件下，用探針與膜雜交； 然后通過探針的標記性質(zhì)檢出雜交體。Western雜交 從轉(zhuǎn)基因植物中提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)純化處理后，進行SDS(十二烷基磺酸鈉)聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子量大小分離，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，按特定的程序與抗體雜交，對雜交結(jié)果進行檢

10、測便可得知被檢植物組織內(nèi)目的蛋白表達與否及其表達量。生物學(xué)性狀鑒定 鑒定轉(zhuǎn)移的目的基因、選擇標記基因是否表達。 觀察是否發(fā)生外源基因以外的變異。轉(zhuǎn)基因生物還可能因為細胞培養(yǎng)或T-DNA的插入而造成其它性狀的突變。最好選出其它性狀均未改變而僅產(chǎn)生目的基因性狀的轉(zhuǎn)基因材料。但是，不應(yīng)忽視轉(zhuǎn)基因過程中產(chǎn)生的其它變異的應(yīng)用價值，如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的研究中就可篩選到既抗蟲纖維品質(zhì)的某方面也改善的品系。轉(zhuǎn)基因棉花飼喂棉鈴蟲時被食用情況（左圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，右圖為非轉(zhuǎn)基因棉） 轉(zhuǎn)基因藍玫瑰轉(zhuǎn)基因藍玫瑰適宜外植體的選擇及再生體系的建立適宜外植體的選擇及再生體系的建立抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇抗生素篩選壓

11、的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇遺傳轉(zhuǎn)化操作遺傳轉(zhuǎn)化操作l 載體介導(dǎo)的載體介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化方法l DNA直接導(dǎo)入法直接導(dǎo)入法l 種質(zhì)系統(tǒng)法種質(zhì)系統(tǒng)法選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株鑒定轉(zhuǎn)基因植株鑒定獲得再生植株獲得再生植株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株的繁殖與應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植株的繁殖與應(yīng)用利用報告基因利用報告基因Southern 雜交雜交Northern 雜交雜交Western 雜交雜交4.園林植物分子育種的優(yōu)越性1、常規(guī)育種的整體水平，主要通過雜交育種來改良品種；分子育種則深入到細胞、亞細胞（包括細胞核、細胞器）、特別是分子水平來改造生物的本性。 2、 常規(guī)育種盲目性大，方向不定；分子育種則使定向

12、改造生物有機體的目標得以逐步實現(xiàn)。 3、 分子育種擴大了育種范圍，打破了種間雜交障礙。由于花卉大多只供觀賞而非食用，故就其安全性而言較其他作物更易批準推廣。 5. 園林植物分子育種的安全性 加拿大有關(guān)部門批準了從今年秋季開始在魁北克省北部試驗種植一批轉(zhuǎn)基因楊樹和杉樹，專家們在今后五年內(nèi)將在自然環(huán)境中觀察、測試轉(zhuǎn)基因樹木是否會對自然環(huán)境造成危害，卷葉蛾等害蟲是否會象某些具有耐藥性細菌那樣逐漸產(chǎn)生對桿菌基因的抵抗力。他們尤其想要知道的是，轉(zhuǎn)基因樹木會不會把自己經(jīng)過改造的基因傳給天然樹木。如果會的話，就必須讓轉(zhuǎn)基因樹失去繁殖能力。 環(huán)保人士對轉(zhuǎn)基因樹木則干脆表示信不過。加拿大拉瓦爾大學(xué)的貝朗瑞教授說

13、，一顆樹在被砍伐之前在大自然中起碼要生長25年，它有足夠的時間影響或改變周圍的環(huán)境，在樹木的基因上做文章是很危險的。 但其他人則表示，由于不用或少用殺蟲劑，轉(zhuǎn)基因樹木的種植會有助于減少環(huán)境污染，而且轉(zhuǎn)基因樹木可以密集種植，木材的單位產(chǎn)量提高了，就能減少對天然森林的砍伐。他們預(yù)測，在不久的將來，專家們將會培育出能夠吸收土壤中的有害化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因樹木。 不過，科學(xué)家們的謹慎和環(huán)保人士的擔(dān)憂也許都敵不過商業(yè)大潮的沖擊，森林工業(yè)界早就夢想有一種生長快、木材質(zhì)量好而且不怕病蟲害的超級樹。據(jù)報道，近年來，新西蘭、澳大利亞、美國等許多國家都投入大量人力、物力進行轉(zhuǎn)基因樹木研究。美國的四家公司最近聯(lián)合投資一億美元，用于研究一種生長快并且對除草劑有耐藥性的轉(zhuǎn)基因松樹。 轉(zhuǎn)基因樹木的出現(xiàn)，使人們看到了“立竿見影”效果。沒有了司空見慣的蟲害，飛絮也無影無蹤，失去天敵的行道樹枝繁葉茂，防風(fēng)防雨、遮陽固土作用明