植物組織培養(yǎng) 第五章 植物花藥和花粉培養(yǎng)ppt課件

1、第五章第五章 植物花藥和花粉培育植物花藥和花粉培育 本章內(nèi)容提要：本章內(nèi)容提要： 一、概念一、概念 二、花粉和花藥培育技術(shù)二、花粉和花藥培育技術(shù) 三、花粉和花藥培育運(yùn)用三、花粉和花藥培育運(yùn)用1 1、概念、概念單倍體細(xì)胞單倍體細(xì)胞(haploid cell)(haploid cell)：植物的：植物的花粉是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂構(gòu)成的，花粉是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂構(gòu)成的，其染色體數(shù)只需體細(xì)胞的一半。其染色體數(shù)只需體細(xì)胞的一半。花粉和花藥的培育花粉和花藥的培育(pollen and (pollen and anther culture)anther culture)：指花粉在培育基上：指花粉在培育基上

2、改動(dòng)其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受精而改動(dòng)其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完好植株的技術(shù)。完好植株的技術(shù)。單倍體植物單倍體植物(haplobiont)(haplobiont)：用離體培：用離體培育花藥的方法使花粉發(fā)育成一個(gè)完好育花藥的方法使花粉發(fā)育成一個(gè)完好的植株。的植株。2、花粉和花藥培意義、花粉和花藥培意義 誘導(dǎo)構(gòu)成單倍體，快速獲得純系，縮短育誘導(dǎo)構(gòu)成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；種周期； 有利于挑選隱性突變體，提高選擇效率。有利于挑選隱性突變體，提高選擇效率。 獲得無病毒個(gè)體。獲得無病毒個(gè)體。3 3、花藥培育開展簡(jiǎn)史、花藥培育開

3、展簡(jiǎn)史19641964年：年：Guha&MaheshwariGuha&Maheshwari南洋金花花藥培育發(fā)育成南洋金花花藥培育發(fā)育成胚；胚；19671967年：年：Bourgin&NitschBourgin&Nitsch花藥培育獲得煙草植株；花藥培育獲得煙草植株；19731973年：我國(guó)初次報(bào)道了小麥花藥培育獲得再生植株；年：我國(guó)初次報(bào)道了小麥花藥培育獲得再生植株；目前：許多農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)植物經(jīng)過花粉培育都能誘導(dǎo)目前：許多農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)植物經(jīng)過花粉培育都能誘導(dǎo)成植株。成植株。 4.花藥培育與單倍體育種花藥培育與單倍體育種花藥培育的主要目的：花藥培育的主要目的： 培

4、育花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，培育花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種資料的來源。作為育種資料的來源。 利用雜種花藥離體培育獲得的再生植株，由不利用雜種花藥離體培育獲得的再生植株，由不同基因型的配子發(fā)育而來，具有豐富的變異類同基因型的配子發(fā)育而來，具有豐富的變異類型，選擇出有利的變異類型，經(jīng)過經(jīng)濟(jì)性狀鑒型，選擇出有利的變異類型，經(jīng)過經(jīng)濟(jì)性狀鑒定后，選出優(yōu)良者直接用于消費(fèi)或配制雜交組定后，選出優(yōu)良者直接用于消費(fèi)或配制雜交組合，獲得優(yōu)良雜交種子。合，獲得優(yōu)良雜交種子。 構(gòu)建永久性分別群體雙單倍體系構(gòu)建永久性分別群體雙單倍體系Doubled haploid)，用于基因定位。，用于基因

5、定位。大大縮短育種周期大大縮短育種周期5 5、花藥培育技術(shù)、花藥培育技術(shù) 確定取材時(shí)間確定取材時(shí)間 選擇大致處于所需求時(shí)期的花蕾。由于花選擇大致處于所需求時(shí)期的花蕾。由于花粉發(fā)育時(shí)期和植株的某些外部形狀特征之粉發(fā)育時(shí)期和植株的某些外部形狀特征之間的大致相關(guān)性，因此利用這些外部標(biāo)志，間的大致相關(guān)性，因此利用這些外部標(biāo)志，選擇符合條件的花蕾，經(jīng)鏡檢確定花粉發(fā)選擇符合條件的花蕾，經(jīng)鏡檢確定花粉發(fā)育的準(zhǔn)確時(shí)期。育的準(zhǔn)確時(shí)期。在水稻中，以單核靠邊期的花粉對(duì)誘導(dǎo)單在水稻中，以單核靠邊期的花粉對(duì)誘導(dǎo)單倍體植株較為適宜，在外部形狀上可根據(jù)倍體植株較為適宜，在外部形狀上可根據(jù)葉枕距為葉枕距為5-15cm5-15

6、cm，穎片淡黃綠色、雄蕊長(zhǎng)，穎片淡黃綠色、雄蕊長(zhǎng)度接近穎片長(zhǎng)度的度接近穎片長(zhǎng)度的1/21/2這些條件鑒定。這些條件鑒定。水稻花藥培育操作過程水稻花藥培育操作過程旗葉鞘用旗葉鞘用7070酒精擦洗一遍酒精擦洗一遍剝?nèi)テ烨?，剝?nèi)テ烨?，取出稻穗取出稻?010漂白粉漂白粉10 min10 min，無菌水洗一次。無菌水洗一次。7070酒精酒精手洗兩遍手洗兩遍培育培育5 5天后，花藥變黑褐色，天后，花藥變黑褐色，2020天花天花藥裂開，長(zhǎng)出淡黃色的花粉愈傷組織，藥裂開，長(zhǎng)出淡黃色的花粉愈傷組織，先構(gòu)成芽，后長(zhǎng)出根，構(gòu)成幼苗。先構(gòu)成芽，后長(zhǎng)出根，構(gòu)成幼苗。用接種環(huán)接種用接種環(huán)接種到培育基上到培育基上左手持穗

7、，右左手持穗，右手用鑷子取出手用鑷子取出花藥，無菌培花藥，無菌培育皿中育皿中選取主穗一級(jí)側(cè)枝的花蕾，由于一級(jí)側(cè)枝選取主穗一級(jí)側(cè)枝的花蕾，由于一級(jí)側(cè)枝的花蕾發(fā)育良好，數(shù)量大，發(fā)育同步。的花蕾發(fā)育良好，數(shù)量大，發(fā)育同步。操作過程中不應(yīng)使花藥遭到損傷，假設(shè)受損傷，操作過程中不應(yīng)使花藥遭到損傷，假設(shè)受損傷，那么應(yīng)淘汰，由于損傷經(jīng)常會(huì)刺激花粉壁構(gòu)成那么應(yīng)淘汰，由于損傷經(jīng)常會(huì)刺激花粉壁構(gòu)成二倍體的愈傷組織。二倍體的愈傷組織?；ㄋ幣嘤臈l件：花藥培育的條件：光照光照(1218h，5,00010,000 lx，28)黑暗黑暗(12-16h，22)周期交替進(jìn)展。周期交替進(jìn)展。6 6、影響花藥誘導(dǎo)頻率的要素、影響

8、花藥誘導(dǎo)頻率的要素1 1 花粉發(fā)育時(shí)期是影響培育效果的重花粉發(fā)育時(shí)期是影響培育效果的重要要素。要要素。 在誘導(dǎo)花粉進(jìn)展雄性發(fā)育在誘導(dǎo)花粉進(jìn)展雄性發(fā)育( (指小孢子沿指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株孢子體途徑發(fā)育成花粉植株) )過程中，不過程中，不同物種花粉最適的發(fā)育時(shí)期不同，對(duì)多同物種花粉最適的發(fā)育時(shí)期不同，對(duì)多數(shù)植物來說，單核中期或晚期的花粉最數(shù)植物來說，單核中期或晚期的花粉最容易構(gòu)成花粉胚或花粉愈傷組織。容易構(gòu)成花粉胚或花粉愈傷組織。 如南洋金花、煙草和芍藥中的最適時(shí)如南洋金花、煙草和芍藥中的最適時(shí)期是第一次有絲分裂時(shí)期或稍前后，禾期是第一次有絲分裂時(shí)期或稍前后，禾本科植物在單核早期本科

9、植物在單核早期( (大麥大麥) )或單核中期或單核中期( (玉米、小麥玉米、小麥) )反響最好，番茄在減數(shù)分反響最好，番茄在減數(shù)分裂中期時(shí)更適宜。裂中期時(shí)更適宜。2 2花藥供體植株的生長(zhǎng)條件對(duì)花藥培育反花藥供體植株的生長(zhǎng)條件對(duì)花藥培育反響的影響是很大的。響的影響是很大的。水稻、小麥、大麥等禾本科植物，主莖穗水稻、小麥、大麥等禾本科植物，主莖穗比分蘗穗花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯地提比分蘗穗花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯地提高。同步化程度高。高。同步化程度高。3 3 培育基是花粉啟動(dòng)和再分化的重要條件培育基是花粉啟動(dòng)和再分化的重要條件我國(guó)科學(xué)任務(wù)者對(duì)水稻、小麥的花藥培育基做我國(guó)科學(xué)任務(wù)者對(duì)水稻、小麥的花藥

10、培育基做了改良，研制出了改良，研制出N6N6培育基。在培育基。在N6N6培育基上，水培育基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。稻花粉的出愈率大幅度提高。N6N6培育基的特點(diǎn)培育基的特點(diǎn)是銨離子濃度較低。是銨離子濃度較低。隨后，進(jìn)一步降低銨鹽和硝酸鹽濃度，同時(shí)附隨后，進(jìn)一步降低銨鹽和硝酸鹽濃度，同時(shí)附加生物素，研制出加生物素，研制出C17C17和和W14W14培育基，它們可以培育基，它們可以大幅度提高小麥的花藥出愈率。大幅度提高小麥的花藥出愈率。馬鈴薯提取液為根本成分的馬鈴薯培育液，如馬鈴薯提取液為根本成分的馬鈴薯培育液，如今被廣泛地運(yùn)用于小麥花藥培育，效果良好。今被廣泛地運(yùn)用于小麥花藥培育，效果良

11、好。 培育基中的植物生長(zhǎng)物質(zhì)種類會(huì)影響花粉培育基中的植物生長(zhǎng)物質(zhì)種類會(huì)影響花粉發(fā)育的途徑發(fā)育的途徑 普通在禾本科植物中，常用普通在禾本科植物中，常用1-5mg/L 2,4-D或或NAA誘導(dǎo)花粉愈傷組織構(gòu)成，再將愈傷組織轉(zhuǎn)誘導(dǎo)花粉愈傷組織構(gòu)成，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至降低或去除生長(zhǎng)素或補(bǔ)加細(xì)胞分裂素類物移至降低或去除生長(zhǎng)素或補(bǔ)加細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的分化培育基上，以誘導(dǎo)器官分化和再生植質(zhì)的分化培育基上，以誘導(dǎo)器官分化和再生植株構(gòu)成。株構(gòu)成。 糖種類對(duì)花粉胚的誘導(dǎo)和分化有顯著影響。糖種類對(duì)花粉胚的誘導(dǎo)和分化有顯著影響。 朱至清等朱至清等(1990)(1990)報(bào)道在過濾滅菌的條件下，假設(shè)以報(bào)道在過濾滅菌的條

12、件下，假設(shè)以0.21 mg/L0.21 mg/L葡萄糖取代液體培育基中同等濃度的蔗糖，葡萄糖取代液體培育基中同等濃度的蔗糖，小麥花粉胚的誘導(dǎo)頻率可添加小麥花粉胚的誘導(dǎo)頻率可添加2-102-10倍。倍。 普通說來，高蔗糖濃度可以抑制體細(xì)胞的生長(zhǎng)而對(duì)普通說來，高蔗糖濃度可以抑制體細(xì)胞的生長(zhǎng)而對(duì)花粉的生長(zhǎng)無妨礙?；ǚ鄣纳L(zhǎng)無妨礙。 煙草的最適蔗糖濃度為煙草的最適蔗糖濃度為3 3，水稻為，水稻為3 3-6-6，玉米，玉米那么為那么為1212-15-15。 在培育基中參與活性炭能促進(jìn)花藥培育在培育基中參與活性炭能促進(jìn)花藥培育4 4 低溫預(yù)處置可以提高花粉胚的誘導(dǎo)頻率低溫預(yù)處置可以提高花粉胚的誘導(dǎo)頻率 以

13、以1-51-5預(yù)低溫處置小麥幼穗，能提高花粉預(yù)低溫處置小麥幼穗，能提高花粉愈傷組織的產(chǎn)量。在愈傷組織的產(chǎn)量。在44下冷凍石刁柏花蕾，預(yù)下冷凍石刁柏花蕾，預(yù)處置處置4 4天、天、8 8天和天和1212天，愈傷組織誘導(dǎo)率比室溫天，愈傷組織誘導(dǎo)率比室溫對(duì)照分別提高對(duì)照分別提高2.42.4倍、倍、1.91.9和和1.51.5倍。倍。 各種植物要求預(yù)處置的溫度和時(shí)間不同。各種植物要求預(yù)處置的溫度和時(shí)間不同。培育溫度是影響花藥反響的一個(gè)重要要素。培育溫度是影響花藥反響的一個(gè)重要要素。小麥要求先高溫培育小麥要求先高溫培育6464天之后，再轉(zhuǎn)入天之后，再轉(zhuǎn)入28-3028-30下培育。不斷高溫培育效果并不好。

14、下培育。不斷高溫培育效果并不好。較高的溫度雖能誘導(dǎo)較高頻率的花粉愈傷組織，較高的溫度雖能誘導(dǎo)較高頻率的花粉愈傷組織，但愈傷組織分化白化苗的頻率也高?？刂婆嘤鷤M織分化白化苗的頻率也高?？刂婆嘤郎囟热允菧p少白化苗的一個(gè)有效措施。溫度仍是減少白化苗的一個(gè)有效措施。7、 圖示花藥培育過程圖示花藥培育過程花藥資料的選取花藥資料的選取 關(guān)鍵選取處于適宜發(fā)育期的關(guān)鍵選取處于適宜發(fā)育期的花藥，離體培育后才干啟動(dòng)花花藥，離體培育后才干啟動(dòng)花粉發(fā)育。實(shí)際闡明，從減數(shù)分粉發(fā)育。實(shí)際闡明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有能裂期至雙核期的花藥，均有能夠誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。夠誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。 大多數(shù)園藝植物的花藥培

15、育，大多數(shù)園藝植物的花藥培育，勝利率最高的時(shí)期為單核期，勝利率最高的時(shí)期為單核期，或單核中晚期?；騿魏酥型砥凇；ǚ叟嘤^程花粉培育過程選幼年樹花蕾選幼年樹花蕾取下花蕾鏡檢取下花蕾鏡檢預(yù)培育數(shù)天預(yù)培育數(shù)天取花藥取花藥接種接種分別分別花粉花粉v藥壁向花粉提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；藥壁向花粉提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；v經(jīng)過藥壁吸收、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化經(jīng)過藥壁吸收、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化培育基中的外源物質(zhì)培育基中的外源物質(zhì)低溫預(yù)處置低溫預(yù)處置消毒消毒過濾離心過濾離心再生再生單倍體植株的二倍化單倍體植株的二倍化花粉植株染色體可自發(fā)加倍；人工措施花粉植株染色體可自發(fā)加倍；人工措施染色體加倍。染色體加倍。 傳統(tǒng)方法是用秋水仙素處置。較大濃度的秋傳統(tǒng)方法是用秋水仙素處置。較大濃度的秋水仙素溶液處置單倍體植株，時(shí)間為水仙素溶液處置單倍體植株，時(shí)間為24-96 h24-96 h。浸泡試管苗方法、處置芽方法、浸根方法浸泡試管苗方法、處置芽方法、浸根方法花藥培育脫毒花藥培育脫毒19741974年日本：花藥培育可以脫除草莓病毒；年日本：花藥培育可以脫除草莓病毒；花藥采取時(shí)期花藥采取時(shí)期 單核期：花蕾單核期：花蕾4-6mm4-6mm，花藥，花藥1mm1mm花藥誘導(dǎo)愈傷組織培育基花藥誘導(dǎo)愈傷組織培育基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖蔗糖30g