第4章_細菌藥敏試驗及其耐藥表型檢測

1、第第4 4章章 細菌藥物敏感細菌藥物敏感試驗及其耐藥表型檢測試驗及其耐藥表型檢測王輝王輝 北京大學醫(yī)學部北京大學醫(yī)學部抗菌藥物敏感試驗測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感性試驗（Antimicrobial Susceptibility Test），簡稱藥敏試驗（AST）。藥敏試驗的意義預測抗菌治療的效果；指導抗菌藥物的臨床應用；發(fā)現或提示細菌耐藥機制的存在，能幫助臨床醫(yī)生選擇合適的藥物，避免產生或加重細菌的耐藥；監(jiān)測細菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學，以控制和預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。 藥敏試驗MIC：在與微生物生長速率有關的特定時間間隔

2、內，通常是1824小時，能夠抑制被測菌生長的最低藥物濃度。對倍稀釋的優(yōu)點：操作容易敏感株的MIC呈正態(tài)分布區(qū)分異常(R)與敏感(S)的菌群藥敏試驗折點的建立 1. MIC的分布的分布2. 藥代動力學和藥效學藥代動力學和藥效學 定 MIC的折點3. 臨床療效和細菌清除率臨床療效和細菌清除率4. 抑菌圈直徑的分布 定抑菌圈折點統(tǒng)計學的線性回歸計算錯誤率：盡可能減少極重要誤差 (假敏感率)MIC的分布051015200.0080.0320.1250.52832128512藥代動力學和藥效學藥代動力學：藥物吸收，分布，代謝，排泄藥效學：藥物對機體的作用時間依賴型（TMIC：-內酰胺類，大環(huán)內酯類濃度依

3、賴型（AUC/MIC比率：AGS, FQ這些參數可用于計算具有最佳藥效的給藥方案MIC與抑菌圈直徑的線性關系耐藥 中介 敏感RISLog2. MICD 1 d2 抑菌圈直徑（mm)抑菌圈直徑與MIC的關系MIC (ug/ml)1 12 23 35 52 22 22 22 22 21 11 11 11 12 22 25 58 8111251 12 25 568小誤差中介中介3234耐藥耐藥重要誤差小誤差9敏感敏感小誤差極重要誤差小誤差24262830141820220.250.510121248256256163264128不同國家的判定折點可能不同原因：用藥劑量不同，服藥的間隔不同評價敏感時較

4、保守更強調檢測出耐藥株（即特定的耐藥群）技術因素：接種、培養(yǎng)基在我國主要遵循臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則。 敏感性分類(CLSI的定義)敏感（Susceptible）用常規(guī)用量治療有效常規(guī)用藥時達到的平均血藥濃度超過細菌的MIC 5倍以上。耐藥（Resistance）用常規(guī)用量治療不能抑制細菌的生長MIC高于藥物在血、體液中可能達到的濃度敏感性分類（2）中介 (Intermediate)MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應率低于敏感株藥物生理濃集部位有效 (尿-FQ)加大用

5、藥劑量可能有效緩沖區(qū)：防止操作的系統(tǒng)誤差造成重大結果的判定錯誤藥敏試驗的方法學半定量紙片擴散法 (抑菌圈直徑)MIC法：稀釋法(肉湯、瓊脂)自動化儀法抗生素連續(xù)梯度法 (Etest )流式細胞儀 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關關系。 紙片擴散法（Kirby-Bauer法）紙片擴散法水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.27.4，做成瓊脂厚度4mm

6、，直徑90mm的平板；挑取孵育16 24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥氏標準。 紙片擴散法用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內壁旋轉擠去多余菌液；然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60度；最后沿平板內緣涂抹1周；平板在室溫下干燥35min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內緣大于15mm。紙片擴散法35孵育1624小時量取抑菌圈直徑；根據抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標準判讀，報告敏感、中介、耐藥。2022-5-718紙片擴散法影響因素MIC接種菌量細菌生長率抗生素含量、擴散性平皿厚度溫度，預孵

7、育時間2022-5-719紙片擴散法標準化CLSI：美國實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute)每年修訂更改包括質控新藥的判定標準特殊耐藥性的檢測2022-5-720CLSI的法規(guī)規(guī)定紙片含量、接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、判定標準、質控；規(guī)定常規(guī)測試報告的抗生素；不同的藥判定標準不同；不同的菌判定標準也不同。2022-5-721常規(guī)測試并報告的藥物分組常規(guī)測試并報告的藥物分組(1) 腸桿菌科 綠膿和非腸桿菌科一 級 氨芐西林 頭孢他啶，慶大霉素 頭孢唑林，慶大霉素替卡西林，哌拉西林二級 阿米卡星 阿米卡星 氨芐西林/舒巴坦 頭

8、孢吡肟，頭孢哌酮 阿莫西林/克拉維酸氨曲南 頭孢呋肟，頭霉素環(huán)丙沙星，亞胺培南 頭孢噻肟，頭孢曲松 替卡西林/克拉維酸 環(huán)丙沙星，亞胺培南 妥布霉素，復方磺胺 替卡西林，哌拉西林 三級 氨曲南，頭孢他啶頭孢曲松 卡那霉素，奈替米星 氯霉素，奈替米星 妥布霉素 四環(huán)素，氯霉素 2022-5-722常規(guī)測試并報告的藥物分組常規(guī)測試并報告的藥物分組(2) 葡萄球菌腸球菌一級 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨芐西林二級 紅霉素類萬古霉素 克林霉素，萬古霉素三級 氯霉素慶大霉素2022-5-723常規(guī)測試并報告的藥物分組常規(guī)測試并報告的藥物分組(3) 流感嗜血桿菌肺炎鏈球菌一級 氨芐西林，青霉素青霉素，紅霉

9、素 復方磺胺 復方磺胺二級 頭孢呋肟，頭孢噻肟氧氟沙星，四環(huán)素 頭孢他啶，氯霉素 萬古霉素三級 阿奇霉素，頭孢克羅氯霉素，利福平 環(huán)丙沙星，亞胺培南利福平，四環(huán)素2022-5-724預報用藥(一) 測試藥菌名推測其他藥物的敏感性 苯唑西林 葡萄球菌所有-內酰胺類 四環(huán)素所有（除葡多西環(huán)素，米諾環(huán)素 萄球菌和不 動桿菌紅霉素G球菌羅紅霉素，克拉霉素， 阿奇霉素克林霉素所有林可霉素2022-5-725預報用藥(二)測試藥菌名推測其他藥物的敏感性氨芐西林腸球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨芐西林，美洛西林 替卡西林頭孢噻吩腸桿菌科頭孢拉定，頭孢氨芐 頭孢克羅奈啶酸腸桿菌科所有氟喹諾酮類萬古霉素所有替考拉寧

10、以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養(yǎng)基進行一系列不同倍數稀釋（通常為雙倍稀釋），經培養(yǎng)后觀察其最低抑菌濃度。 稀釋法中用瓊脂培養(yǎng)基者為瓊脂稀釋法，用肉湯培養(yǎng)基者為肉湯稀釋法。 藥敏試驗-稀釋法常用抗菌藥物容積稀釋法步驟濃度（mg/mL）來源體積(mL)CAMHB(mL)最終濃度（mg/mL）15120儲存液195122512步驟1112563512步驟1131284512步驟11764564步驟41132664步驟41316764步驟417888步驟711498步驟7132108步驟7171111步驟10110.5121步驟10130.25131步驟10170.125抗菌藥物的稀釋和融解抗

11、菌藥物的稀釋和融解2022-5-729肉湯稀釋法 4 8 16 32 64 128 256 ug/ml 混 混 清抗生素倍比稀釋，種菌105CFU/ml ， 孵育35，1620h，判讀。2022-5-730肉湯稀釋法調節(jié)離子濃度的MH肉湯宏量肉湯法（2ml, 13x100mm ）微量肉湯法 （ 0.1ml, 微量板） 自動化儀優(yōu)點：準確，可靠，可用于研究。缺點：勞動強度大細菌生長情況不可查2022-5-731瓊脂稀釋法 濃度 16 32 64 128 256 ug/ml 制備含對倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點種菌，104/每個點，孵育，判讀結果2022-5-732瓊脂稀釋法優(yōu)點：金標準

12、 精確可靠可同時測定多株菌（40株）細菌生長情況可查缺點： 測多個藥時勞動強度大制備平皿費時費力E test 法nE試條是一條5mm50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的，濃度呈連續(xù)指數增長稀釋抗菌藥物，另一面有讀數和判別的刻度；n抗菌藥物的梯度可覆蓋有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍；n將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細菌的最小抑菌濃度。 2022-5-7wanghui-ART34E test 法 細菌生長區(qū)E test 塑料條橢圓形細菌生長抑制區(qū)256128 8016判讀抑菌濃度（MIC

13、 ug/ml)E test 法菌液制備及接種均同紙片擴散法。90mm平板上可放E試驗試條1 2條，140mm平板最多可放6條。 孵育溫度及時間同紙片擴散法。 2022-5-736E test 法優(yōu)點連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關性好影響因素少，穩(wěn)定性高操作簡單，省時缺點：昂貴用途：快生長菌，苛養(yǎng)菌，厭氧菌，酵母菌， 分枝桿菌2022-5-737評價藥物體外抗菌活性的指標MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范圍，R，I，SMIC50/ MIC90：MIC從小到大排列，位于第50 / 90百分位菌株的MIC值單純比較MIC50，MIC90是片面的，還要同時看平均MIC及MIC范圍同

14、時結合R，I，S，(不同藥物血濃度不同，安全范圍不同)細菌耐藥機制 細菌耐藥機制主要有四種：產生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶；抗生素作用的靶位改變，包括青霉素結合蛋白位點、DNA解旋酶、DNA拓撲異構酶的改變等；細菌膜的通透性下降，包括細菌生物被膜的形成和通道蛋白丟失；細菌主動外排系統(tǒng)的過度表達。在上述耐藥機制中，第一、二種耐藥機制具有專一性，第三、四種耐藥機制不具有專一性。-內酰胺酶 內酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質中； 檢測方法有微生物培養(yǎng)法、碘淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因為簡單、方便、快速，應用于臨床

15、檢測。 葡萄球菌屬 青霉素 方法敏感中介耐藥MIC0.12 mg/ml-0.25 mg/ml紙片擴散法29 mm-28 mm誘導-內酰胺酶的檢測如果青霉素的藥敏結果出現以下情況，需要做誘導-內酰胺酶的檢測 ：MIC 0.12 g/ml Zone diameter 29 mm 誘導-內酰胺酶試驗超廣譜-內酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由質粒介導的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)內酰胺類氨曲南的一類酶；ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等內酰胺酶抑制劑所抑制；ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也見于腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌

16、屬等其他腸桿菌科細菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌。超廣譜-內酰胺酶（ESBLs）紙片法，出現以下一種情況即可懷疑該菌株產生ESBL （篩選陽性）：頭孢泊肟17mm頭孢他啶22mm頭孢噻肟27mm頭孢曲松25mm氨曲南 27mm超廣譜-內酰胺酶（ESBLs）紙片法（表型確認試驗）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復方制劑的抑菌圈直徑與相應單藥抑菌圈直徑相差5mm時，即可判斷該菌產ESBL。 超廣譜-內酰胺酶（ESBLs）稀釋法，出現以下一種情況即可懷疑該菌株產生ESBL：頭孢他啶或頭孢噻肟或頭孢曲松或氨曲南MIC2mg /mL或頭孢泊肟MIC8mg /mL 超廣譜-內酰

17、胺酶（ESBLs）稀釋法（表型確認試驗）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任何一組酶抑制劑復方制劑的MIC值比相應單藥的MIC降低3個稀釋度者即可判定該菌為產ESBL菌株。 AmpC酶的特征AmpC酶是在革蘭陰性菌中發(fā)現的由染色體或質粒介導的水解頭孢菌素的型內酰胺酶，可分為誘導酶和非誘導酶。與ESBLs不同的是，AmpC酶對三代頭孢菌素耐藥但對四代頭孢菌素敏感且不被酶抑制劑克拉維酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。 AmpC酶的檢測方法頭孢西丁三維試驗是檢測AmpC酶的經典方法；除此之外，還有以硼酸化合物為抑制劑檢測肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的AmpC酶、Amp

18、C Disk、頭孢西丁瓊脂基礎法等。 碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定義為具有水解碳青霉烯類抗生素活性的-內酰胺酶，主要分布于-內酰胺酶A、B、D類中。根據水解機制中作用位點的不同可以將碳青霉烯酶分為兩大類：一類稱為金屬碳青霉烯酶，這類酶以金屬鋅離子為活性作用位點，可以被EDTA抑制，屬于B類-內酰胺酶；另一類以絲氨酸（Ser）為酶的活性作用位點，可以被酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦所抑制，屬于A、D類-內酰胺酶。 碳青霉烯酶A類酶B類酶D類酶染色體編碼：SME NMC IMI質粒編碼：KPC GES質粒編碼 OXA-23 OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-55 OXA-48 OXA-5

19、0 OXA-60 OXA-62金屬酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制劑抑制可以被EDTA抑制碳青霉烯酶表型檢測方法-改良改良hodge試驗試驗ATCC25922，0.5麥氏，1:10稀釋涂MH平板平皿中心貼10g 厄他培南或亞胺培南紙片 10l環(huán)挑取3 5個菌落從平板中心紙片邊緣向平板邊緣劃線 被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922 抑菌環(huán)交匯處大腸埃希菌生長增強，即產碳青霉烯酶。 改良改良hodge試驗的結果判讀試驗的結果判讀金屬酶表型檢測方法：EDTA協同試驗用0.5麥氏單位的待測菌懸液涂布M H 平板。 貼IMP (10g)紙片距其1cm 處貼E

20、DTA紙片（0.5mol/L 4l）。35 過夜培養(yǎng)。亞胺培南抑菌圈在靠近加EDTA紙片側明顯擴大者為產金屬酶菌株。 亞胺培南EDTA10mm 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）攜帶SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因編碼修飾的青霉素結合蛋白PBP2a，這種蛋白對甲氧西林和其他的-內酰胺類抗生素親和力下降，從而導致對這些抗生素的耐藥。 SCCmec主要由mec復合物和ccr復合物兩部分組成。根據不同mec復合物和ccr復合物的組合，可以將SCCmec分成不同的型別，目前已發(fā)現8種SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌SCCmec基因盒耐甲氧西林葡萄球菌的檢測MRSA的檢測方法有

21、頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林瓊脂稀釋法、乳膠凝膠試驗檢測PBP2a、mecA基因測定及MRSA顯色培養(yǎng)基。頭孢西丁紙片法、苯唑西林瓊脂稀釋法是目前檢測耐甲氧西林葡萄球菌最常用篩選方法。對于金黃色葡萄球菌，MRSA的檢測可以使用苯唑西林紙片，但對于凝固酶陰性葡萄球菌則不能使用苯唑西林紙片。 甲氧西林耐藥的葡萄球菌（MRS） MRS檢測藥物紙片法稀釋法金黃色葡萄球菌1mg 苯唑西林路鄧葡萄球菌1mg 苯唑西林金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌30mg 頭孢西丁除路鄧以外的凝固酶陰性葡萄球菌1mg 苯唑西林30mg 頭孢西丁凝固酶陰性葡萄球菌中苯唑西林MIC結果的報告策略*克林霉素誘導耐藥試驗 克林霉素誘

22、導耐藥葡萄球菌紅霉素*耐藥的金葡菌或凝固酶陰性葡萄球菌可對克林霉素結構性或誘導性耐藥或僅對紅霉素耐藥。 *或其他大環(huán)內酯類紅霉素/克林霉素耐藥葡萄球菌耐藥機制誘導性克林霉素耐藥（誘導性克林霉素耐藥（erm介導）介導）葡萄球菌-“D試驗”患者不會對克林霉素有反應-報告克林霉素耐藥無克林霉素誘導（無克林霉素誘導（msrA介導）介導）真的克林霉素敏感真的克林霉素敏感-報告克林霉素敏感報告克林霉素敏感“D”葡萄球菌誘導性克林霉素耐藥的MIC檢測方法對于紅霉素耐藥，克林霉素敏感的葡萄球菌，需檢測誘導性克林霉素耐藥注意試驗適用于金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐藥株)；對于CoNS，該試驗不必常

23、規(guī)開展因為克林霉素很少用于治療凝固酶陰性葡萄球菌；大多數醫(yī)院相關MRSA是克林霉素耐藥的；大多數社區(qū)相關MRSA是克林霉素敏感的(msrA 基因型)；克林霉素可以口服給藥。萬古霉素中介耐藥的金黃色葡萄球菌（VISA）血瓊脂上48小時生長當有以下一個或多個情況時菌株可疑為當有以下一個或多個情況時菌株可疑為VISA -內酰胺類藥物的內酰胺類藥物的MIC降低降低達托霉素達托霉素MIC升高升高菌落形態(tài)不典型（一些為微小菌落）菌落形態(tài)不典型（一些為微小菌落）肉湯中生長遲緩（如血培養(yǎng)）肉湯中生長遲緩（如血培養(yǎng)）凝固酶反應微弱凝固酶反應微弱/延遲延遲經過幾次次代經過幾次次代培養(yǎng)后：培養(yǎng)后：菌落回復為典型形態(tài)菌落回復為典型形態(tài)萬古霉素萬古霉素MIC降低并且菌株變?yōu)槿f古霉素敏感降低并且菌株變?yōu)槿f古霉素敏感萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（VRSA）vanA從VRE轉至金葡菌紙片擴散法折點紙片擴散法折點葡萄球菌葡萄球菌-萬古霉素萬古霉素 腸球菌腸球菌高水