分離純化蛋白質(zhì)地方法及原理

1、（二）利用溶解度差別影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素有：1溶液的pH;2、離子強(qiáng)度；3介電常數(shù)；4溫度。但在同一的特定外部條件下，不同蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。1、等電點(diǎn)沉淀：原理：蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時(shí)，他的溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。在等電點(diǎn)之上或者之下時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號(hào)的凈電荷而互相排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當(dāng)pH被調(diào)到蛋白質(zhì)混合物中其中一種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，這種蛋白質(zhì)大部分和全部被沉淀下來，那些等電點(diǎn)高

2、于或低于該pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中。這樣沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著天然的構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。5、鹽析與鹽溶：原理：低濃度時(shí)，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)溶解度這種現(xiàn)象稱為鹽溶.鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過程中往往沉淀析出，這就是因?yàn)橥肝龀チ他}類離子，使蛋白質(zhì)分子之間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解程度開始下降。當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時(shí)，例如飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)可以從水中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為

3、鹽析。鹽析作用主要是由于大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。此時(shí)那些被迫與蛋白質(zhì)表面的疏水集團(tuán)接觸并掩蓋他們的水分子成為下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶劑化鹽離子，留下暴露出來的疏水基團(tuán)。蛋白質(zhì)疏水表面進(jìn)一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)保持著他的天然構(gòu)象，能再溶解。鹽析的中性鹽以硫酸銨為最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的溫度系數(shù)較低。3、有機(jī)溶劑分級(jí)分離法：與水互溶的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。在室溫下有機(jī)溶劑會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，如果預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻到-40°

4、C以下，然后在不斷攪拌下逐滴加入有機(jī)溶劑，以防局部濃度過高，那么變性可以得到很大程度緩解。蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度也隨溫度、pH和離子強(qiáng)度而變化。在一定溫度、pH和離子強(qiáng)度條件下，弓|起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此控制有機(jī)溶劑濃度也可以分離純化蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。介電常數(shù)的降低將增加兩個(gè)相反電荷之間的吸引力。蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水集團(tuán)發(fā)生相互作用并在空間上阻礙了蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二

5、醇中的溶解度明顯的依賴于聚乙二醇的分子量。4、溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響：在一定溫度范圍內(nèi)，約040弋之間，大部分球狀蛋白的溶解度隨溫度升高而增加，在4050弋以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在0°C或更低的溫度下進(jìn)行。（三）根據(jù)電荷不同根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。1、電泳：在外電場(chǎng)的作用下，帶點(diǎn)顆粒將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和核苷酸等生物分子的分析分離和制備。區(qū)帶電泳是由于在支

6、持物上電泳蛋白質(zhì)混合物被分離為若干區(qū)帶。電泳前用緩沖液浸潤(rùn)薄膜或?yàn)V紙等支持物或用緩沖液直接配置成凝膠，將待分離的蛋白質(zhì)樣品加在它的一端或中央，支持物的兩端與電極連接，通電電泳。電泳完畢，各個(gè)組分分布在不同的區(qū)域，用顯色劑（蛋白質(zhì)可用考馬斯亮藍(lán)或氨基黑等染色）顯色后可以顯示出各個(gè)組分。氨基酸混合物特別是寡聚核苷酸混合物一次電泳往往不能完全分開。這種情況可以將第一次電泳分開的斑點(diǎn)通過支持介質(zhì)間的接觸印跡轉(zhuǎn)移到第二個(gè)支持介質(zhì)上，旋轉(zhuǎn)90°，進(jìn)行第二次電泳。這種方法稱為雙向電泳。2、聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的兩部分組成（小的部分是濃縮

7、膠，大的部分為分離膠），這兩部分凝膠的濃度、緩沖液組分和離子強(qiáng)度、pH以及電場(chǎng)強(qiáng)度都是不同的，即不連續(xù)性。電泳時(shí)樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶，然后再進(jìn)行電泳分離。電泳有三種物理效應(yīng)：1、樣品的濃度效應(yīng)；2、凝膠對(duì)被分離分子的篩選效應(yīng)；3、一般電泳分離的電荷效應(yīng)。3毛細(xì)管電泳：高效毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、自由溶液毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電泳，可分離氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段和核酸以及多種小分子，也可用于手性化合物的分離。毛細(xì)管減少了由于熱效應(yīng)產(chǎn)生的許多問題，可以提高熱散失，有助于消除由于熱引起的擴(kuò)散增加而造成的對(duì)流和區(qū)帶變寬，因此管中不需要加入穩(wěn)定介質(zhì)即可進(jìn)行自由流動(dòng)電泳

8、。電泳遷移引起溶液中荷電分子向相反電荷的電極移動(dòng)，雖然被分析樣品因電泳遷移而分離，然而電滲作用使溶液向負(fù)極流動(dòng)，而且電滲電流很強(qiáng)，其速度一般比樣品的電泳速率答，因此所有的正、負(fù)離子和中性分子都被推向負(fù)極。對(duì)荷正電分子來說，電泳遷移和電滲流效果是一致的，而且移動(dòng)最快，最先達(dá)到負(fù)極。隨著被分離的分子接近負(fù)極，它們都將通過紫外檢測(cè)器并把信號(hào)傳遞給記錄儀。所得結(jié)果是被分離組分的紫外吸收對(duì)時(shí)間的峰譜。4、等點(diǎn)聚焦（IEF）分離蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)（如濃蔗糖溶液）中進(jìn)行。在外電場(chǎng)作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦在等于其等電點(diǎn)的梯度處，并形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。pH梯度制作一般利用兩性電解質(zhì)，它是脂肪

9、族多胺和多羧類的同系物，它們具有相近但不相同的解離常數(shù)和等電點(diǎn)。在外電場(chǎng)作用下，自然形成pH梯度。5、層析聚焦：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差異分離蛋白質(zhì)混合物的柱層析方法。原理：當(dāng)用特種緩沖液滴洗填充在柱中的特種多緩沖交換劑時(shí)，就會(huì)在層析柱中自上而下自動(dòng)的建立起連續(xù)的pH梯度；同時(shí)加在柱上端的蛋白質(zhì)樣品也隨多緩沖液的展開按各自的等電點(diǎn)聚焦在相應(yīng)的pH區(qū)段。并在展開過程中隨pH梯度下移，蛋白質(zhì)混合物的各組分先后從柱中流出，達(dá)到分離純化的目的。6、離子交換層析：纖維素離子交換劑：適用于大分子的分離，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。有較大的表面積，大分子可以自由通過。洗脫條件溫和，蛋白質(zhì)回收率高交聯(lián)葡聚糖離子交換

10、劑：即可以根據(jù)分子的凈電荷數(shù)量，又可以根據(jù)分子的大?。ǚ肿雍Y效應(yīng)）進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)對(duì)離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此之間相反電荷基團(tuán)的靜電吸引，而這又和溶液的pH有關(guān)，因?yàn)閜H決定離子交換劑和蛋白質(zhì)的電離程度。鹽濃度的微小變化就會(huì)直接影響它對(duì)蛋白質(zhì)電荷吸附容量。因此蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐械柠}離子強(qiáng)度和pH完成，對(duì)離子交換劑結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先從層析柱中洗脫出來。層析洗脫，采用保持洗脫液成分一直不變的方式洗脫，也可以采用改變洗脫的鹽濃度或（和）pH的方式洗脫。后一種方式又分為：跳躍式洗脫和漸進(jìn)式的連續(xù)改變。采取前一種方式洗脫稱為分段洗脫，后一種方式為梯度洗脫。梯度洗脫一般分離效果好，分辨效

11、率高，特別是使用交換容量小，對(duì)鹽濃度敏感的離子交換機(jī)，多采用梯度洗脫。洗脫時(shí)，必須控制洗脫體積（與柱床體積相比）和洗脫液的鹽離子濃度和pH。洗脫液體積和鹽濃度變化形式（梯度形式）直接影響層析的分辨率。通常采用的梯度形式有線性（形），凸形，凹形和復(fù)合型四種。7、SDS-PAGE全稱十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：通過加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也解離為單亞基，處理后的樣品中肽鏈?zhǔn)翘幱跓o二硫鍵連接的，分離的狀態(tài)。電泳時(shí)SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)分子量。所以SDS-PAGE常用來分析蛋白質(zhì)的純度和大致測(cè)定蛋白質(zhì)的分子

12、量。8、離子交換層析：原理：氨基酸分離常用陽(yáng)離子交換樹脂，樹脂被處理成鈉型，將混合氨基酸上柱，氨基酸主要以陽(yáng)離子形式存在，在樹脂上與鈉離子發(fā)生交換，而被掛在樹脂上。（四）利用選擇性吸附劑的純化方法某些稱為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強(qiáng)弱因被吸附物質(zhì)的性質(zhì)而異。吸附過程涉及范德華力相互作用和請(qǐng)見氫鍵非離子吸引。吸附層析就是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的的。典型的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭等。硅膠適用于分離堿性物質(zhì)，氧化鋁適用于分離酸性物質(zhì)，活性炭是一種非極性吸附劑。一般選擇其極性與待分離的混合物中極性

13、最大組分的極性相當(dāng)?shù)南疵撘?。因此，如果待分離物含有羥基，則選擇醇類，含羰基則選用丙酮或脂類。烴類如己烷、庚烷和甲苯則用于非極性物質(zhì)的分離。吸附層析可采用薄層或柱方式進(jìn)行。1羥磷灰石層析：用于分離蛋白質(zhì)或核酸。最重要的用途之一就是吧單鏈DNA和雙鏈DNA分開。羥磷灰石對(duì)雙鏈DNA親和力很大，一直用羥磷灰石層析能從含RNA和蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取液中選擇性的出去DNA。2、疏水作用層析：根據(jù)蛋白質(zhì)表面的疏水性差別發(fā)展起來的一種純化技術(shù)。這種差別也用于鹽分級(jí)分離。連在支持介質(zhì)上的疏水集團(tuán)與蛋白質(zhì)表面暴露出來的集團(tuán)結(jié)合。由于疏水作用層析要求鹽析化合物如硫酸銨的存在以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)暴露。為使吸附達(dá)

14、到最大，可將蛋白質(zhì)樣品的pH調(diào)至等電點(diǎn)附近。洗脫方式包括：逐漸降低離子強(qiáng)度或增加pH的洗脫液，或使用對(duì)固定相的親和力以對(duì)蛋白質(zhì)更強(qiáng)的置換劑進(jìn)行置換洗脫。但是某些洗脫條件可引起蛋白質(zhì)變性。（五）利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子進(jìn)行特有的識(shí)別能力，也即生物學(xué)親和力，建立起來的一種有效的純化方法。只需要進(jìn)行一步的處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來，并且純度相當(dāng)高?；驹恚喊汛兓哪骋坏鞍踪|(zhì)的特意配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的功能基上。一般在配體和多糖載體之間插入一段長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)倪B接臂或稱間隔臂，使配體與凝膠之間

15、保持足夠的距離，不致因載體表面的位阻妨礙待分離的分子與配體結(jié)合。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物加入填有親和介質(zhì)的層析柱時(shí)，待純化的某一蛋白質(zhì)則被吸附在含配體的瓊脂糖顆粒表面上而其他的蛋白質(zhì)因?qū)υ撆潴w無特異的結(jié)合部位而不被吸附，他們通過洗滌即可除去，被特異結(jié)合的蛋白質(zhì)可用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來。凝集素親和層析、免疫親和層析、金屬螯合層析、染料配體層析和共價(jià)層析等屬于親和層析。（六）高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析高效液相層析（HPLC）:載體的顆粒愈小，則分辨率愈高，但是洗脫液的流速也愈慢。反相HPLC廣泛用于分離非極性化合物。固定相是非極性的，而流動(dòng)相是相對(duì)極性的。固定相與被分離物只可能有疏水

16、作用，流動(dòng)相組成的小小變化，例如加入鹽、改變pH或有機(jī)溶劑量就能成功的影響分離特性。快速蛋白質(zhì)液相層析（FPLC）專門用于蛋白質(zhì)分離，是基于反相、親和、排阻、疏水作用、離子交換和等點(diǎn)聚焦層析，能用于分離微量樣品。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin酚試劑法、紫外吸收法、染料結(jié)合法和膠體金測(cè)定法。Folin酚試劑能定量的與亞銅離子反應(yīng)，亞銅離子是由蛋白質(zhì)的易氧化成分還原銅離子而產(chǎn)生的。BCA法，BCA試劑在堿性溶液中與亞銅離子反應(yīng)生成紫色復(fù)合物，該反應(yīng)比Folin酚試劑的反應(yīng)更強(qiáng)。紫外吸收法：280nm芳香族化合物的光學(xué)效應(yīng)考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法：靈敏度高，檢測(cè)為微克膠體金測(cè)定法：靈敏度

17、最高，膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體，呈洋紅色，遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，因此可用于蛋白質(zhì)的定量。測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量通常要用具有高度特異性的生物學(xué)方法。具有酶或激素性質(zhì)的蛋白質(zhì)可以利用他們的酶活性或激素活性來測(cè)定含量。大多數(shù)蛋白質(zhì)在注入適當(dāng)動(dòng)物的血流中時(shí)，會(huì)產(chǎn)生抗體。利用抗體抗原反應(yīng)，也可以測(cè)定某一特定蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)純度檢測(cè)：電泳、沉降、HPLC和溶解度分析電泳分析有等點(diǎn)聚焦、聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳。純的蛋白質(zhì)在一系列不同的pH條件下進(jìn)行電泳時(shí)，都將以單一的速度移動(dòng)，它的電泳圖譜只呈現(xiàn)一個(gè)條帶。HPLC常用于多肽、蛋白質(zhì)純度的鑒定。純蛋白質(zhì)樣品在HPLC的洗脫圖譜上呈現(xiàn)出單一的對(duì)稱峰