哺乳動物細胞表達重組蛋白

1、1會計學(xué)哺乳動物細胞表達重組蛋白哺乳動物細胞表達重組蛋白原核表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)植物表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞制備的蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量高， 與天然蛋白質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)和生物 學(xué)功能 我國從2000年開始逐漸發(fā)展了該項技術(shù)，雖然起步較 晚，基礎(chǔ)較差，但經(jīng)過努力實現(xiàn)了該項技術(shù)的突破。 (1) 細胞培養(yǎng)時間延長，由過去的7天延長至21天； (2) 細胞密度增加， 過去：1-2X106細胞毫升， 現(xiàn)在：1-1.5X107細胞毫升； (3) 產(chǎn)量增加， 過去：1020pg重組蛋白細胞天， 50一100mg重組蛋白升， 現(xiàn)在：50-90pg重組蛋白細胞天， 1-5g重組蛋白升。 人工構(gòu)建的哺乳動物

2、細胞表達載體為穿梭載體，含： 原核DNA序列：大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因，便于 載體在原核細胞中擴增和大量制備。 轉(zhuǎn)錄相關(guān)元件：哺乳動物細胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子 元件，以及終止子和加polyA信號序列。 翻譯相關(guān)元件：有效的mRNA翻譯信號 其它：視實驗需要加入標(biāo)志基因、內(nèi)含子、內(nèi)部核糖體進入 位點等。 轉(zhuǎn)錄終止序列 真核基因的hnRNA的加工過程需要PolyA信號,在目的基因3端加上PolyA,表達水平提高10倍以上。SV40的早期和晚期PolyA.分泌表達載體 以高效表達外源基因為目標(biāo)的高等哺乳動物受體細胞應(yīng)具備以下條件： 細胞系特征：喪失細胞接觸抑制和錨地依賴特征， 便于大規(guī)模

3、培養(yǎng)。 遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代后不至于丟失， 易于長期保存。 合適的標(biāo)記：便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持。 生長快且齊：分裂周期短，生長均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌。 中國倉鼠卵巢細胞（CHO的優(yōu)勢遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準確基因轉(zhuǎn)移和載體表達系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞人胚腎細胞（ HEK293 ）的優(yōu)勢貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)三種方式均可用于293細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。在無Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長，也可生長在血清濃度較低的培養(yǎng)基中。具有很高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和對保持外

4、源基因的高穩(wěn)定性 為了減少成本和節(jié)約時問，近年來發(fā)展了大規(guī)模懸浮培養(yǎng)細胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù) 常用的商業(yè)化的離了脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染效率很高，但價格不菲 目前有兩種試劑(磷酸鈣和聚乙烯亞胺)可用以滿足大規(guī)模培養(yǎng)瞬時表達利用代謝工程，改進培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本抑制細胞凋亡，延長培養(yǎng)周期原核表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)植物表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞制備的蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量高， 與天然蛋白質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)和生物 學(xué)功能 人工構(gòu)建的哺乳動物細胞表達載體為穿梭載體，含： 原核DNA序列：大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因，便于 載體在原核細胞中擴增和大量制備。 轉(zhuǎn)錄相關(guān)元件：哺乳動物細胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子 元件，以及終止子和加polyA信號序列。 翻譯相關(guān)元件：有效的mRNA翻譯信號 其它：視實驗需要加入標(biāo)志基因、內(nèi)含子、內(nèi)部核糖體進入 位點等。 轉(zhuǎn)錄終止序列 真