western blot

1、western blotwestern blot原理介紹 膠的成分：膠的成分： 水，丙烯酰胺，水，丙烯酰胺，SDSSDS，Tris-ClTris-Cl，TEMEDTEMED 各成分的作用：各成分的作用：丙烯酰胺：聚合后形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)丙烯酰胺：聚合后形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)SDSSDS：去蛋白質(zhì)：去蛋白質(zhì)電荷電荷、解離蛋白質(zhì)之間的、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵氫鍵、取消蛋白分、取消蛋白分子內(nèi)的子內(nèi)的疏水作用疏水作用、去去多肽多肽折疊折疊，使蛋白質(zhì)變成，使蛋白質(zhì)變成統(tǒng)一構(gòu)型統(tǒng)一構(gòu)型TrisTris緩沖液：不同的緩沖液：不同的pHpH值對于蛋白的濃縮和分離很重要值對于蛋白的濃縮和分離很重要APSAPS：提供驅(qū)動丙烯酰胺和

2、雙丙烯酰胺聚合所必需的：提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由自由基基（保存期：（保存期：44一周）一周）TEMEDTEMED：催凝劑催凝劑 電泳液成分：電泳液成分：TrisTris，甘氨酸（，甘氨酸（GlyGly），），SDSSDS 轉(zhuǎn)膜液成分：轉(zhuǎn)膜液成分：TrisTris，GlyGly，甲醇，甲醇 二者均不需要調(diào)節(jié)二者均不需要調(diào)節(jié)pHpH 經(jīng)過經(jīng)過PAGEPAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離

3、的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)蛋白水平的表達(dá). .基本步驟 樣品制備樣品制備 組織組織/ /細(xì)胞裂解：加裂解液細(xì)胞裂解：加裂解液(TNE (TNE 加上蛋白抑加上蛋白抑制劑酶等制劑酶等)

4、)，44翻轉(zhuǎn)翻轉(zhuǎn)40min40min，離心取上清，離心取上清，44操操作作 蛋白濃度測定：上樣時應(yīng)按一定比例蛋白量添蛋白濃度測定：上樣時應(yīng)按一定比例蛋白量添加加 加加sample buffersample buffer： 分為還原型和非還原型，還原型上樣緩沖液中分為還原型和非還原型，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶 主要作用：蛋白變性解鏈，增加比重，增加粘稠主要作用：蛋白變性解鏈，增加比

5、重，增加粘稠度，溴酚藍(lán)指示作用度，溴酚藍(lán)指示作用 配膠 濃縮膠堆積作用，濃縮膠堆積作用，濃縮膠濃度較小，孔徑較大濃縮膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的，把較稀的樣品加到濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮樣品加到濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶，當(dāng)至一個狹窄的區(qū)帶，當(dāng)樣品液和濃縮膠選樣品液和濃縮膠選TRIS/HCLTRIS/HCL緩沖液，緩沖液，電極液選電極液選TRIS/TRIS/甘氨酸甘氨酸 電泳開始后，電泳開始后，HClHCl解離出氯離子，解離出氯離子，甘氨酸解離出甘氨酸離子，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向甘氨酸解離出甘氨酸離子，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，

6、其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中，電泳開始，氯離子涌動率最大，超過蛋白，因此在后中，電泳開始，氯離子涌動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，產(chǎn)生較面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，產(chǎn)生較高電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成穩(wěn)定高電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層 上樣與電泳上樣與電泳 冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGESDS

7、-PAGE 膠加樣孔內(nèi)即可。兩邊加上膠加樣孔內(nèi)即可。兩邊加上BufferBuffer 電泳恒流電泳恒流32mA32mA每塊膠。每塊膠。 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 選用選用PVDFPVDF膜?？梢栽O(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為膜?？梢栽O(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為400mA400mA，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間為時間為120120分鐘。分鐘。 在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜時注意正負(fù)極中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜時注意正負(fù)極 電轉(zhuǎn)搜索液中電轉(zhuǎn)搜索液中SDSSDS增加蛋白的水溶性，促進(jìn)蛋白在電轉(zhuǎn)液中增加蛋白的水溶性，

8、促進(jìn)蛋白在電轉(zhuǎn)液中泳動。若不加泳動。若不加SDSSDS，蛋白會沉淀在膠上，但，蛋白會沉淀在膠上，但SDSSDS過多會影響蛋過多會影響蛋白與膜的吸附。甲醇能使白與膜的吸附。甲醇能使SDSSDS與蛋白分離，甲醇濃度越高與蛋白分離，甲醇濃度越高SDSSDS與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對蛋白會有固定作用，不與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對蛋白會有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來。一般來說甲醇的濃度為利于蛋白從膠里跑出來。一般來說甲醇的濃度為20%20%，但，但PVDFPVDF膜截留膜截留markermarker上交聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮上交聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮提升甲醇的濃度至提

9、升甲醇的濃度至25%25%（它對普通蛋白的轉(zhuǎn)膜影響不太，顏（它對普通蛋白的轉(zhuǎn)膜影響不太，顏料截留更多）；大蛋白轉(zhuǎn)印可考慮降低甲醇濃度，另外料截留更多）；大蛋白轉(zhuǎn)印可考慮降低甲醇濃度，另外SDSSDS必須添加。甲醇的另一個作用是降溫，舊的電轉(zhuǎn)液由于電解必須添加。甲醇的另一個作用是降溫，舊的電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時電流或電壓變化更快、溫度質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時電流或電壓變化更快、溫度升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點對半干轉(zhuǎn)緩升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點對半干轉(zhuǎn)緩沖液的意義較大，因為半干轉(zhuǎn)緩沖液消耗很慢，緩沖液放置沖液的意義較大，因為半干轉(zhuǎn)緩沖液消耗很

10、慢，緩沖液放置的時間較久，甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，可臨時少量補(bǔ)加的時間較久，甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，可臨時少量補(bǔ)加 封閉封閉(Blocking) (Blocking) 轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的TBSTTBST洗滌液中，漂洗洗滌液中，漂洗1-21-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。一般將濾紙一同轉(zhuǎn)入漂洗的盒子中，再除去濾紙一般將濾紙一同轉(zhuǎn)入漂洗的盒子中，再除去濾紙和膠

11、和膠 加入封閉液，在搖床上緩慢搖動加入封閉液，在搖床上緩慢搖動, ,室溫封閉室溫封閉6060分分鐘鐘。 一抗孵育一抗孵育 室溫或室溫或44在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以在孵育一小時效果不佳，可以在44緩慢搖動孵育過夜。緩慢搖動孵育過夜。 回收一抗。加入回收一抗。加入TBSTTBST洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5 5分鐘，分鐘，4 4次。次。 二抗孵育二抗孵育 按照適當(dāng)比例用按照適當(dāng)比例用WesternWestern二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶酶(HRP)(HRP)標(biāo)記的二抗。標(biāo)記的二抗。 倒掉洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或倒掉洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或44在側(cè)在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時?；厥斩埂＜尤霐[搖床上緩慢搖動孵育一小時。回收二抗。加入WesternWestern洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5min,45min,4次次 顯色顯色1 1）1:11:1配好顯色液，用槍吸到手套上配好顯色液，用槍吸到手套上2 2）用鑷子捏起膜，扣到顯色液體上，注意避免氣泡，）用鑷子捏起膜，扣