藥品檢驗(yàn)用菌種的傳代和保藏2

1、藥品微生物檢驗(yàn)用菌種的傳代和保藏浙江省藥品檢驗(yàn)所葉銘龍2菌種的定義及其與各應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)系n菌種泛指從自然界獲取的各種微生物的不同的種。n醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究菌種主要考慮其致病機(jī)理n工業(yè)生產(chǎn)研究菌種主要考慮其發(fā)酵機(jī)理n藥品微生物檢驗(yàn)主要考慮其標(biāo)準(zhǔn)性 3標(biāo)準(zhǔn)菌種的概念及其管理n標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由國(guó)家授權(quán)機(jī)構(gòu)制備的具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性并用妥善方法保藏的菌種。n我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)菌種統(tǒng)一由中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCMCCCCM）管理，涉及藥品微生物檢驗(yàn)的菌種由醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCCCMCC）提供4標(biāo)準(zhǔn)菌種的保藏形式 我國(guó)提供的標(biāo)準(zhǔn)菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。在這種容器中，微生物通

2、常與賦形劑共存，由于缺乏生長(zhǎng)必須的環(huán)境條件，一般呈休眠狀態(tài)。5純培養(yǎng) 所謂微生物的純培養(yǎng)是指在一個(gè)微生物的菌落形成單位中，所有的微生物細(xì)胞或孢子都屬于生物學(xué)的同一個(gè)種。嚴(yán)格地說(shuō)，純培養(yǎng)是在培養(yǎng)基上由一個(gè)細(xì)胞或孢子分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。在該細(xì)胞或孢子的生長(zhǎng)過(guò)程種，不受其他微生物的侵犯，不會(huì)在培養(yǎng)物中產(chǎn)生另外微生物種的后代，在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中不發(fā)生變異或死亡。 6獲取純培養(yǎng)的工作環(huán)境1、潔凈工作室：環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)，全過(guò)程必須無(wú)菌操作，防止微生物污染。2、無(wú)菌隔離艙7獲取純培養(yǎng)的接種工具1、接種環(huán)2、接種針3、接種鏟4、接種鉤5、其他玻璃器械8獲取純培養(yǎng)的其

3、他器具1、玻璃器皿：如各種規(guī)格培養(yǎng)皿。2、微生物實(shí)驗(yàn)室常用的設(shè)備，如高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等9獲取純培養(yǎng)的主要技術(shù)移植（又稱接種） 微生物的移植（或稱接種）是指將微生物接種在培養(yǎng)基上的操作。10移植（又稱接種）的兩種方式劃線 和穿刺 1、劃線法是指用接種工具將微生物細(xì)胞移植在固體培養(yǎng)基斜面或平板上的一種方法 。2、穿刺法是指用接種工具將微生物細(xì)胞移植到固體或半固體培養(yǎng)基內(nèi)的一種方法。 11影響集菌培養(yǎng)效果的若干因素n溫度n滲透壓n氧氣n光npH值和氧化還原電位n培養(yǎng)基n抗生素12驗(yàn)證純培養(yǎng)的主要依據(jù)1、用顯微鏡觀察時(shí)，全部的生物個(gè)體是相似的，如果是細(xì)菌，對(duì)革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)當(dāng)是一致的。2、將培養(yǎng)

4、物制成懸液，重新傾注平板，或平板劃線培養(yǎng)后，所形成的全部菌落的形態(tài)應(yīng)該是相似的。如果是細(xì)菌，將重新形成的菌落各作穿刺培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征應(yīng)當(dāng)是一致的。3、從重新分離的各菌落作生理特征觀測(cè)時(shí)，如對(duì)氮源的利用，對(duì)糖類的發(fā)酵或同化以及其他生理生化的測(cè)定，應(yīng)呈現(xiàn)出一致性。 13定期移植保藏法 一般步驟為：將菌種接種在所要求的培養(yǎng)基上，置最適溫度下集菌培養(yǎng)。得到健壯的菌體（如有性孢子、無(wú)性孢子或細(xì)胞等）后，放于溫度較低、干燥處保藏，并且每隔一定時(shí)間重新移植培養(yǎng)一次。 14定期移植保藏法1、細(xì)菌置46保藏，芽孢桿菌每36個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。 2、放線菌于46保藏，每3個(gè)月移植一次。 3、酵母菌

5、于46保藏，每46個(gè)月移植一次。 4、絲狀真菌于46保藏，每3個(gè)月移植一次。 5、擔(dān)子菌于46保藏，每3個(gè)月移植一次。6、保藏的濕度通常在5070為宜。 15定期移植保藏法1、需定期檢查2、移植進(jìn)行時(shí)，應(yīng)仔細(xì)核對(duì)3、集菌培養(yǎng)完成后，應(yīng)比較培養(yǎng)特征4、應(yīng)注意觀察各代之間的變化16瓊脂斜面低溫保藏法1、菌種的典型菌落接種至斜面，規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，充分生長(zhǎng)，硅膠塞換成無(wú)菌橡膠塞。46 冰箱保藏a:13個(gè)月移植一次，繼續(xù)保藏。b:用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，可保藏半年至一年。17瓊脂斜面低溫保藏法n適用細(xì)菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏n優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、大多數(shù)微生物適用n缺點(diǎn)：保藏期短；傳代次數(shù)多；容易發(fā)

6、生變異及污染。n生孢梭菌用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、乙型溶血性鏈球菌及肺炎球菌用血肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基18液體石蠟保藏法 一般步驟為：準(zhǔn)備液體石蠟并滅菌去水備用。獲得需要保藏菌種的純培養(yǎng)，將液體石蠟注入培養(yǎng)容器中，并完全覆蓋培養(yǎng)基。 液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基上端0.51cm為宜 46 冰箱保藏19液體石蠟保藏法n確保保藏環(huán)境的干燥，避免長(zhǎng)霉。n使用此法保藏的菌種時(shí)應(yīng)特別注意防止微生物外濺污染。n該法對(duì)酵母菌的保藏最為有效，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌保藏效果一般。20甘油冷凍保藏法n將保藏菌種接種瓊脂斜面上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間，用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過(guò)接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使菌種充分?jǐn)U散到無(wú)菌水中，調(diào)

7、證菌液濃度，向已制備好的菌懸液加入等體積的20無(wú)菌甘油，輕輕振試管管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無(wú)菌小管。甘油冷凍管最好在-30 貯存。21沙管保藏法n制備沙管n培養(yǎng)接種n制備菌懸液n混菌n干燥n保藏n適合保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌和一些絲狀真菌。 22土壤保藏法n用土壤替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同n適合保藏土壤細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌，時(shí)間為26年。 23硅膠保藏法n用硅膠替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同n適合保藏酵母菌和某些絲狀真菌 24濾紙保藏法n保藏微生物細(xì)胞或孢子的載體為濾紙。n對(duì)細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌等都有一定的效果，有些菌種最長(zhǎng)可達(dá)17年 。25明

8、膠片保藏法n制備無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)明膠n制備無(wú)菌石蠟濾紙n微生物培養(yǎng)并制成濃厚的懸液n在懸液中加入營(yíng)養(yǎng)明膠n將含微生物細(xì)胞或孢子的營(yíng)養(yǎng)明膠滴于石蠟濾紙表面n干燥n將形成的明膠片密封保藏26麩皮保藏法n我國(guó)歷史悠久的微生物保藏法n適于保藏根霉、曲霉、青霉、紅曲霉等屬和赤霉菌 27梭氏真空干燥保藏法n在小試管中放置菌懸液n小試管在大試管中放置n大試管在真空狀態(tài)下干燥n密封大試管28液體直接干燥保藏法n需要加入保護(hù)劑n干燥之前不需凍結(jié)n在干燥過(guò)程中為增大蒸發(fā)面積，可加入多孔材料n干燥后的容器應(yīng)熔封29蒸餾水保藏法n最為簡(jiǎn)便的微生物保藏法n微生物細(xì)胞或孢子保藏在蒸餾水中n保藏的容器應(yīng)密封n適于保藏棒狀桿菌、土壤

9、桿菌和假單孢菌等 30液氮冰箱超低溫保藏法n需專用設(shè)備液氮超低溫冰箱n菌懸液密封于安瓿管內(nèi)，控速凍結(jié)n國(guó)外已普遍采用n保藏時(shí)間長(zhǎng)31凍結(jié)真空干燥保藏法n歷史悠久，又稱凍干法n不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用該法n適用面廣n保藏時(shí)間可達(dá)10年以上n多為菌種保藏機(jī)構(gòu)采用32凍結(jié)真空干燥保藏法n密封性好，可避免保藏期間的污染n保藏容器體積小，方便攜帶和貯藏n保藏時(shí)間更長(zhǎng)，變異概率更低33普通微生物實(shí)驗(yàn)室適用的保藏技術(shù)n瓊脂斜面低溫保藏法n液體石蠟保藏法n低溫冷凍保藏法n甘油冷凍保藏法34瓊脂斜面低溫保藏法n細(xì)菌置46保藏，芽孢桿菌每36個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。 n放線菌于46保藏

10、，每3個(gè)月移植一次。 n酵母菌于46保藏，每46個(gè)月移植一次。 n絲狀真菌于46保藏，每4個(gè)月移植一次。 n擔(dān)子菌于46保藏，每3個(gè)月移植一次。n保藏的濕度通常在5070為宜。 35菌種保藏的一般規(guī)定1、菌種“代”的確定：2005版藥典規(guī)定，以干燥菌種管為第“0”代，由此得到的第一批子代為第一代，以此類推。2、菌種傳代次數(shù)規(guī)定：2005版藥典規(guī)定不超過(guò)5代。3、菌種應(yīng)專人保藏、專柜貯藏，認(rèn)真做好登記，統(tǒng)一編號(hào)，按期傳代，并做好有關(guān)檢驗(yàn)記錄。4、保存菌種傳代或凍干均應(yīng)填寫(xiě)專用記錄，菌種管上應(yīng)有標(biāo)簽，表明菌種編號(hào)、代次、批號(hào)、日期。5、過(guò)期菌種應(yīng)及時(shí)處理、登記，經(jīng)121 30分鐘滅菌消毒。36實(shí)驗(yàn)

11、室菌種傳代操作步驟n1、接種前用1：1000新潔爾滅擦拭工作臺(tái)面，然后開(kāi)紫外燈消毒30分鐘。n2、自冰箱取出保存工作用菌種，室溫放置20分鐘；溫度平衡后才能傳代。n3、實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入緩沖間，換鞋、穿無(wú)菌衣、戴口罩，用1：1000新潔爾滅溶液消毒雙手，并將培養(yǎng)基及菌種移入陽(yáng)性菌接種室。n4、點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管塞子，通過(guò)火焰轉(zhuǎn)動(dòng)使稍稍松動(dòng)，以免接種時(shí)粘著打不開(kāi)。n5、接種操作：左手拿住菌種管，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒，將白金耳燒紅約30秒，桿部通過(guò)火焰滅菌。挑取少量菌苔；另取，照上述方法在火焰旁打開(kāi)塞子，將白金耳伸入管內(nèi)斜面培養(yǎng)基的底部，從下到上將白金耳輕貼斜面培養(yǎng)基的表面作曲折移動(dòng)。n5、

12、接種后，將斜面置規(guī)定溫度、時(shí)間培養(yǎng)。取出觀察，菌種生長(zhǎng)良好，換橡皮塞，貼上標(biāo)簽，放入冰箱保存。n6、細(xì)菌一個(gè)月傳代一次，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉可三個(gè)月傳代一次。37菌種管理n1、標(biāo)準(zhǔn)菌種必須從認(rèn)可的菌種收集途經(jīng)獲得；實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存所有菌種的收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗(yàn)的記錄。n2、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有文件管理標(biāo)準(zhǔn)菌種（從原始菌種到工作用菌種）。該程序應(yīng)包括：a:標(biāo)準(zhǔn)菌種必須定期傳代，并做確認(rèn)試驗(yàn)，包括實(shí)驗(yàn)室在所需要關(guān)鍵診斷指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室必須記錄并保存。b：每一子菌種都應(yīng)以適當(dāng)標(biāo)簽、標(biāo)記來(lái)表示名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期和傳代日期。C:每一子菌種都應(yīng)以標(biāo)記從原始菌種傳代到工作

13、用菌種的代數(shù)；記錄菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；菌種生存條件等。38過(guò)期菌種處理n過(guò)期菌種應(yīng)及時(shí)清理、登記，并經(jīng)121 、30分鐘高壓消毒滅菌。39例1：金黃色葡萄球菌傳代保藏技術(shù)n1、購(gòu)置金黃色葡萄球菌（如我所提供的菌種為第二代菌種），假定購(gòu)置日期為5月21日。n2、準(zhǔn)備10支營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，其中2支用于保藏，其余8支用于當(dāng)月實(shí)驗(yàn)。n3、于5月22日打開(kāi)菌種管，接種菌種至上述10支斜面，35 培養(yǎng)1618小時(shí)。n4、將10支第三代菌種管做好標(biāo)簽，置適宜溫度保藏。n5、5月22日至6月22日，可以使用上述第三代菌種管。n6、至6月22日，重復(fù)步驟2，得第四代菌種管。n7、至8月22日前，重新購(gòu)置原

14、種管。40例2：黑曲霉的傳代技術(shù)n1、制備孢子懸液：取滅菌水或生理鹽水35ml，分23次小心滴加至菌種管內(nèi)（試管斜面），反復(fù)振搖。傾取孢子懸液置另一滅菌試管。n2、涂布接種：用滅菌滴管吸取懸液滴加至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面，每管滴加23滴，轉(zhuǎn)動(dòng)試管，使懸液與斜面表面充分接觸41菌種確認(rèn)試驗(yàn)n包括以下幾個(gè)方面：1、菌落生長(zhǎng)情況：目測(cè)2、染色鏡檢：3、生化試驗(yàn)；(1)糖醇代謝試驗(yàn) （2）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn) （3）碳源和氮源利用試驗(yàn) （4）酶類試驗(yàn) （5）其他試驗(yàn)42短小芽孢桿菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽(yáng)性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄

15、，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。 3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原 ，結(jié)果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。43枯草芽孢桿菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為呈鏈狀排列的桿菌，不形成莢膜，革蘭氏染色為陽(yáng)性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長(zhǎng)豐厚，粗糙，不透明，不閃光，蠟質(zhì)，蔓延，奶油色至微褐色。 3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結(jié)果明膠呈漏斗形至層狀液化，淀粉水解陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性。44大腸埃希菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為成對(duì)和呈短鏈排列的近球形的桿菌，一般不形成莢膜，革蘭氏染色為陰性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌

16、苔通常白色，有時(shí)帶黃白色，濕潤(rùn)，閃光，蔓延生長(zhǎng)。 3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺和靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)，結(jié)果不液化明膠，靛基質(zhì)試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，V.P.和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性。45大腸埃希菌 該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，有一整套完整的鑒定手段，也可參考該方法用于判斷所保藏的菌種有無(wú)發(fā)生變異。 該鑒定方法主要內(nèi)容即為經(jīng)典的IMViC試驗(yàn)，結(jié)果為+-。46銅綠假單孢菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為單個(gè)，成對(duì)或呈短鏈排列的桿菌，有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色為陰性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長(zhǎng)旺盛，薄，白色，閃光，培養(yǎng)基變?yōu)榫G色至暗褐色或黑色

17、，發(fā)熒光。 3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、吲哚和硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果迅速液化明膠，液體呈淺黃綠色或淺藍(lán)綠色，吲哚試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性。47銅綠假單孢菌 該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，可利用氧化酶試驗(yàn)和綠膿菌素試驗(yàn)迅速判斷所保藏的菌種有無(wú)發(fā)生變異。48乙型副傷寒沙門(mén)菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為單個(gè)出現(xiàn)的桿菌，有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色為陰性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔淺灰色，濕潤(rùn)，光滑，半透明。 3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、吲哚、硫化氫和硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果不液化明膠，吲哚試驗(yàn)陰性，硫化氫陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性。49乙型副傷寒沙門(mén)菌 該菌為微生物限度檢查規(guī)定不

18、得檢出的控制菌，可利用三糖鐵瓊脂斜面和血清試驗(yàn)迅速判斷所保藏的菌種有無(wú)發(fā)生變異。50藤黃微球菌 確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為呈堆團(tuán)排列的球菌，革蘭氏染色為陽(yáng)性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔硫黃色到酪黃色，光滑，軟。 3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、硫化氫和硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果緩慢液化明膠成漏斗形，硫化氫陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性。51金黃色葡萄球菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為單個(gè)或成對(duì)呈短鏈和不規(guī)則堆團(tuán)狀排列的球菌，革蘭氏染色為陽(yáng)性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長(zhǎng)茂盛，半透明，光滑，平坦，濕潤(rùn)，白色至淺黃色或橙色。 3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、硝酸鹽還原和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，結(jié)果明膠呈囊狀液化，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性。52金黃色葡萄球菌 該菌為微生物限度檢