放線(xiàn)菌新種分類(lèi)鑒定

1、放線(xiàn)菌新種分離鑒定放線(xiàn)菌新種分離鑒定1實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法3實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果4總結(jié)總結(jié)2011/12/2811、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?011/12/282 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)分離得到的放線(xiàn)菌新種從形態(tài)學(xué)、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)分離得到的放線(xiàn)菌新種從形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征、和分子遺傳分類(lèi)學(xué)方面進(jìn)行鑒生理生化反應(yīng)特征、和分子遺傳分類(lèi)學(xué)方面進(jìn)行鑒定，證明其是以前從未發(fā)現(xiàn)的新種。定，證明其是以前從未發(fā)現(xiàn)的新種。2、實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2.1 分離方法分離方法2.3 鑒定方法鑒定方法表觀(guān)特征表觀(guān)特征化學(xué)分類(lèi)化學(xué)分類(lèi)基因型分類(lèi)基因型分類(lèi)2011/12/2832.2 16SrRNA基因序列測(cè)定基因序列測(cè)定2.1 分

2、離方法分離方法2011/12/284近年來(lái)出現(xiàn)了胞外多糖膠與動(dòng)孢溶液相結(jié)合的分離方法、再水化近年來(lái)出現(xiàn)了胞外多糖膠與動(dòng)孢溶液相結(jié)合的分離方法、再水化-離心離心 法、極高頻輻射法、噬菌體定向分離法和蔗糖梯度離心法等用法、極高頻輻射法、噬菌體定向分離法和蔗糖梯度離心法等用于稀有放線(xiàn)菌選擇性分離的方法。于稀有放線(xiàn)菌選擇性分離的方法。2011/12/2852.2 16SrRNA基因序列測(cè)定基因序列測(cè)定放線(xiàn)菌基因組的提取放線(xiàn)菌基因組的提取16SrRNA16SrRNA基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增膠回收膠回收連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化測(cè)序研究測(cè)序研究A電鏡觀(guān)察電鏡觀(guān)察B培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征C生理生化特征生理生化特征2011/12/2

3、862.3.1 表觀(guān)特征表觀(guān)特征A. 電鏡電鏡取菌體后取菌體后,3%戊二醛固定戊二醛固定4h, 0.1M磷酸緩沖液漂洗。磷酸緩沖液漂洗。酒精梯度脫水，在酒精梯度脫水，在30%、50、70、80%、100依次脫依次脫水，其中水，其中100酒精酒精2次，每次次，每次10min。 乙酸異戊脂置換，乙酸異戊脂置換，50%一次，一次，100%兩次。兩次。Eiko公司公司XD-1型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器干燥，型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器干燥，Eiko公司公司IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜。型離子鍍金儀噴金鍍膜。 JEOL公司公司JSM-840掃描電鏡觀(guān)察。掃描電鏡觀(guān)察。2011/12/287B. 培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征參

4、照國(guó)際鏈霉菌規(guī)劃中有關(guān)放線(xiàn)菌的培養(yǎng)特征描述參照國(guó)際鏈霉菌規(guī)劃中有關(guān)放線(xiàn)菌的培養(yǎng)特征描述所采用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)特征測(cè)定。所采用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)特征測(cè)定。所用培養(yǎng)基有所用培養(yǎng)基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏瓊脂、察氏瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂馬鈴薯浸汁瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，平板接種，平板接種，28培養(yǎng)培養(yǎng)7，14，21，28d后分別觀(guān)察并記錄基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的后分別觀(guān)察并記錄基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的生長(zhǎng)情況及可溶性色素。生長(zhǎng)情況及可溶性色素。2011/12/288C. 生理生化實(shí)驗(yàn)生理生化實(shí)驗(yàn)生理生化特性的測(cè)定主要包括生理生化特性的測(cè)定主要包括:pH、鹽濃度和溫度耐受性，、鹽

5、濃度和溫度耐受性，明膠液化，淀粉水解，脲酶明膠液化，淀粉水解，脲酶的產(chǎn)生，牛奶胨化和凝固，硝酸鹽還原，的產(chǎn)生，牛奶胨化和凝固，硝酸鹽還原，H2S的產(chǎn)生，黑的產(chǎn)生，黑色素的產(chǎn)生，唯一碳、氮源利用等試驗(yàn)。色素的產(chǎn)生，唯一碳、氮源利用等試驗(yàn)。2011/12/289a. pH、鹽濃度和溫度耐受性、鹽濃度和溫度耐受性u(píng)pH耐受實(shí)驗(yàn)?zāi)褪軐?shí)驗(yàn)在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中分別加入在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中分別加入pH緩沖液，空白培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，緩沖液，空白培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，28培養(yǎng)，每周觀(guān)察一次，四周結(jié)束，重復(fù)培養(yǎng)，每周觀(guān)察一次，四周結(jié)束，重復(fù)2次。次。u溫度耐受實(shí)驗(yàn)溫度耐受實(shí)驗(yàn)將菌株接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，分別在將菌株接種

6、在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，分別在4、10 、16 、20 、28、37、45培養(yǎng)，每周觀(guān)察一次，四周結(jié)束，重復(fù)培養(yǎng)，每周觀(guān)察一次，四周結(jié)束，重復(fù)2次。次。u鹽耐受實(shí)驗(yàn)鹽耐受實(shí)驗(yàn)高氏一號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的高氏一號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)28培養(yǎng)，每周觀(guān)察一次，四周結(jié)束，重復(fù)培養(yǎng)，每周觀(guān)察一次，四周結(jié)束，重復(fù)2次。次。2011/12/2810b. 明膠液化明膠液化取明膠培養(yǎng)基試管作穿刺接種，另有兩支不接種作空白取明膠培養(yǎng)基試管作穿刺接種，另有兩支不接種作空白對(duì)照。于對(duì)照。于28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)培養(yǎng)2、7、10、14和和30天的

7、試管，放入天的試管，放入4C冰箱或置于冰箱或置于冷水中冷水中30min，然后進(jìn)行觀(guān)察。，然后進(jìn)行觀(guān)察。如明膠凝塊部分或全部變?yōu)榭闪魍ǖ娜缑髂z凝塊部分或全部變?yōu)榭闪魍ǖ囊后w液體，則明膠水解，則明膠水解陽(yáng)性陽(yáng)性。如明膠凝塊呈如明膠凝塊呈固體固體，則明膠水解，則明膠水解陰性陰性。若菌體未生長(zhǎng)，可能是不能在明膠培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。若菌體未生長(zhǎng)，可能是不能在明膠培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。2011/12/2811c. 淀粉水解淀粉水解將菌株點(diǎn)種在淀粉瓊脂平板上，待菌落生長(zhǎng)良好時(shí)，將菌株點(diǎn)種在淀粉瓊脂平板上，待菌落生長(zhǎng)良好時(shí)，在菌落周?chē)渭拥庖簷z測(cè)淀粉水解酶活性的強(qiáng)弱。在菌落周?chē)渭拥庖簷z測(cè)淀粉水解酶活性的強(qiáng)弱。滴加碘液后培

8、養(yǎng)皿背景呈藍(lán)黑色滴加碘液后培養(yǎng)皿背景呈藍(lán)黑色,菌落四周若不變色，菌落四周若不變色，或移開(kāi)菌落后滴加新碘液，菌落下得培養(yǎng)基仍或移開(kāi)菌落后滴加新碘液，菌落下得培養(yǎng)基仍不變色不變色，表示淀粉水解表示淀粉水解陰性陰性；若變成；若變成透明無(wú)色透明無(wú)色則為則為陽(yáng)性陽(yáng)性，說(shuō)明，說(shuō)明產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉。產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉。2011/12/2812d. 脲酶的產(chǎn)生脲酶的產(chǎn)生e. 牛奶凝固與胨化牛奶凝固與胨化將待測(cè)菌種接種在脫脂牛奶管中，觀(guān)察牛奶凝固與胨化現(xiàn)象。將待測(cè)菌種接種在脫脂牛奶管中，觀(guān)察牛奶凝固與胨化現(xiàn)象。若牛奶有凝塊則為凝固，繼續(xù)培養(yǎng)，凝固后有液體出現(xiàn)，進(jìn)一步水解若牛奶有凝塊則為凝固，繼續(xù)培養(yǎng)，凝固后有

9、液體出現(xiàn)，進(jìn)一步水解成液體，則為胨化，一般先凝固后胨化。成液體，則為胨化，一般先凝固后胨化。有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊鏋閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖冢?xì)菌均能合成此酶。其活性最適在，細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為為7.0。挑取挑取1824h待試菌培養(yǎng)物大量穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，待試菌培養(yǎng)物大量穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，培養(yǎng)培養(yǎng)14d觀(guān)察結(jié)果，如為陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)一下，作最終判定，變?yōu)?/p>

10、觀(guān)察結(jié)果，如為陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)一下，作最終判定，變?yōu)榉奂t粉紅色為陽(yáng)性色為陽(yáng)性。2011/12/2813將待測(cè)菌種接在硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置室溫下培養(yǎng)，將待測(cè)菌種接在硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置室溫下培養(yǎng)，1、3、5d取樣測(cè)定。每株菌作復(fù)本，另兩管作對(duì)照。取樣測(cè)定。每株菌作復(fù)本，另兩管作對(duì)照。培養(yǎng)液中加入格里氏試劑培養(yǎng)液中加入格里氏試劑A、B液各一滴，如呈現(xiàn)液各一滴，如呈現(xiàn)粉紅色、粉紅色、玫瑰紅色玫瑰紅色，表明硝酸鹽還原，表明硝酸鹽還原陽(yáng)性陽(yáng)性，如無(wú)紅色出現(xiàn)，則加，如無(wú)紅色出現(xiàn)，則加1，2滴二苯胺試劑，如呈滴二苯胺試劑，如呈藍(lán)色藍(lán)色，表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在，表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在，硝酸鹽還原屬硝

11、酸鹽還原屬陰性陰性，若，若不呈藍(lán)色不呈藍(lán)色，表示硝酸鹽和亞硝酸鹽，表示硝酸鹽和亞硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì)，仍按都已還原成其他物質(zhì)，仍按陽(yáng)性陽(yáng)性結(jié)果處理。結(jié)果處理。f. 硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)2011/12/2814g. H2S的產(chǎn)生的產(chǎn)生某些細(xì)菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而產(chǎn)生硫化氫某些細(xì)菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而產(chǎn)生硫化氫氣體，若于培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵銨或醋酸銨，則與硫化氫作用氣體，若于培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵銨或醋酸銨，則與硫化氫作用生成生成硫化亞鐵或硫化鉛（黑色）沉淀硫化亞鐵或硫化鉛（黑色）沉淀。h. 黑色素的產(chǎn)生黑色素的產(chǎn)生將供試菌株接種在酪氨酸培養(yǎng)基斜面管上，培

12、養(yǎng)將供試菌株接種在酪氨酸培養(yǎng)基斜面管上，培養(yǎng) 7 d 和和 14 d 觀(guān)觀(guān)察結(jié)果，培養(yǎng)基被染成察結(jié)果，培養(yǎng)基被染成褐色或者黑色褐色或者黑色即說(shuō)明該菌產(chǎn)生黑色素。即說(shuō)明該菌產(chǎn)生黑色素。2011/12/2815i. 碳源利用和氮源利用（本實(shí)驗(yàn)利用碳源利用和氮源利用（本實(shí)驗(yàn)利用BIOLOG板）板）碳源：碳源：D-葡萄糖，蔗糖，葡萄糖，蔗糖，L-樹(shù)膠醛糖，樹(shù)膠醛糖，D-果糖，果糖，D-木糖，鼠李糖，木糖，鼠李糖，I-肌醇，棉子糖，肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纖維素。甘露醇，纖維素。不加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。不加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。氮源氮源: KNO3，NaNO2，尿素，尿素， (NH4

13、)2SO4，絲氨酸，煙酰胺，酪氨，絲氨酸，煙酰胺，酪氨酸，酸， DL-天冬氨酸，天冬氨酸，L-甲硫氨酸，甲硫氨酸，DL-丙氨酸，丙氨酸，L-精氨酸，精氨酸，L(+)-谷氨谷氨酸，甘氨酸，酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。苯丙氨酸，腺嘌呤。不同氮源按不同氮源按0.5%的濃度加入，培的濃度加入，培15天后，將各種氮源上的生長(zhǎng)狀況天后，將各種氮源上的生長(zhǎng)狀況與不加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況作比較。與不加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況作比較。2011/12/2816A細(xì)胞壁化學(xué)組分細(xì)胞壁化學(xué)組分B磷酸類(lèi)脂測(cè)定磷酸類(lèi)脂測(cè)定C甲基萘醌測(cè)定甲基萘醌測(cè)定D脂肪酸測(cè)定脂肪酸測(cè)定2011/12/28172.3.2

14、 化學(xué)分類(lèi)化學(xué)分類(lèi)A.細(xì)胞壁化學(xué)組分細(xì)胞壁化學(xué)組分放線(xiàn)菌的細(xì)胞壁主要成分為肽聚糖，根據(jù)肽聚糖放線(xiàn)菌的細(xì)胞壁主要成分為肽聚糖，根據(jù)肽聚糖分子中肽鏈第分子中肽鏈第3位氨基酸的種類(lèi)，種間肽橋和鄰近的位氨基酸的種類(lèi)，種間肽橋和鄰近的四肽交聯(lián)的位置來(lái)決定放線(xiàn)菌細(xì)胞壁型的劃分。四肽交聯(lián)的位置來(lái)決定放線(xiàn)菌細(xì)胞壁型的劃分。Lechevalier等（等（1976）根據(jù)放線(xiàn)菌細(xì)胞壁的化學(xué)組）根據(jù)放線(xiàn)菌細(xì)胞壁的化學(xué)組分和全細(xì)胞水解液糖型，將放線(xiàn)菌歸為分和全細(xì)胞水解液糖型，將放線(xiàn)菌歸為9個(gè)主要類(lèi)群個(gè)主要類(lèi)群和和4個(gè)糖型。個(gè)糖型。2011/12/2818胞壁類(lèi)型胞壁類(lèi)型主要組成主要組成代表屬代表屬I(mǎi)L,L-DAP，甘氨

15、酸，甘氨酸SterptomycesIIMeso-DAP，甘氨酸，甘氨酸MicromonosporaIIIMeso-DAPActinomaduraIVMeso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖，阿拉伯糖，半乳糖NocardiaV賴(lài)氨酸，鳥(niǎo)氨酸賴(lài)氨酸，鳥(niǎo)氨酸ActinomycesVI賴(lài)氨酸（天冬氨酸，半乳糖）賴(lài)氨酸（天冬氨酸，半乳糖）OerskoviaVIIDAB，甘氨酸，甘氨酸AgromycesVIII鳥(niǎo)氨酸鳥(niǎo)氨酸BifidobacteriumIXMeso-DAP， 多種氨基酸多種氨基酸Mycoplana放線(xiàn)菌細(xì)胞壁的主要構(gòu)成（放線(xiàn)菌細(xì)胞壁的主要構(gòu)成（Lechevalier，1976）2011/12/2

16、819糖類(lèi)型糖類(lèi)型主要成分主要成分代表屬、種代表屬、種A阿拉伯糖，半乳糖阿拉伯糖，半乳糖NocardiaB馬杜拉糖馬杜拉糖ActinomaduraC無(wú)特征性糖無(wú)特征性糖StreptomycesD木糖，阿拉伯糖木糖，阿拉伯糖MicromonosporaE半乳糖半乳糖Kutzneria viridogriseum放線(xiàn)菌全細(xì)胞的主要糖類(lèi)型（放線(xiàn)菌全細(xì)胞的主要糖類(lèi)型（Lechevalier，1976）2011/12/2820全細(xì)胞全細(xì)胞TLC分分析實(shí)驗(yàn)流程：析實(shí)驗(yàn)流程：全細(xì)胞糖分析全細(xì)胞糖分析菌體培養(yǎng)與收集菌體培養(yǎng)與收集細(xì)胞水解細(xì)胞水解（0.1ml 0.5mol/L HCl）點(diǎn)樣點(diǎn)樣（0.6-0.8l

17、水解液和水解液和1%的的標(biāo)準(zhǔn)糖液）標(biāo)準(zhǔn)糖液）層析層析顯色顯色（苯胺鄰苯二甲酸試劑）（苯胺鄰苯二甲酸試劑）氨基酸分析氨基酸分析菌體培養(yǎng)與收集菌體培養(yǎng)與收集細(xì)胞水解細(xì)胞水解（0.1ml 6mol/L HCl）點(diǎn)樣點(diǎn)樣（氨基酸水解樣品（氨基酸水解樣品0.4l和和0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液混合液0.2l）層析層析顯色顯色（0.4%茚三酮試劑）茚三酮試劑）2011/12/2821磷酸類(lèi)脂位于放線(xiàn)菌細(xì)胞膜上，屬于極性脂。不同屬菌的磷酸類(lèi)脂磷酸類(lèi)脂位于放線(xiàn)菌細(xì)胞膜上，屬于極性脂。不同屬菌的磷酸類(lèi)脂組份是不同的，它是鑒別屬的重要特征之一，是化學(xué)分類(lèi)項(xiàng)目中不可組份是不同的，它是鑒別屬的重要特征

18、之一，是化學(xué)分類(lèi)項(xiàng)目中不可缺少的分類(lèi)指征。磷酸類(lèi)脂的種類(lèi)繁多，但用于分類(lèi)的指征并不多。缺少的分類(lèi)指征。磷酸類(lèi)脂的種類(lèi)繁多，但用于分類(lèi)的指征并不多。用于分類(lèi)指征的磷酸類(lèi)脂只有五種：用于分類(lèi)指征的磷酸類(lèi)脂只有五種：磷脂酰乙醇胺（磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE）磷脂酰甲基乙醇胺（磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME）磷脂酰膽堿（磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline, PC）磷脂酰甘油（磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol ,PG）含葡萄糖胺的未知結(jié)構(gòu)磷酸類(lèi)脂（含葡萄糖胺的未

19、知結(jié)構(gòu)磷酸類(lèi)脂（phospholipids of unknown structure containing glucosamine, GluNu）B. 磷酸類(lèi)脂測(cè)定磷酸類(lèi)脂測(cè)定2011/12/2822稱(chēng)取稱(chēng)取1g濕菌體于帶螺口的濕菌體于帶螺口的40 ml離心管中。離心管中。加入加入15ml甲醇。甲醇。100水浴水浴10 min，自然冷卻。，自然冷卻。 加入加入10 ml氯仿和氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力搖勻用力搖勻10 min，靜止可看到分層。，靜止可看到分層。 8000 rpm，離心，離心10 min。到入分液漏斗靜止分層，取下層。到入分液漏斗靜止分層，取下層。30-40旋轉(zhuǎn)蒸干

20、。旋轉(zhuǎn)蒸干。分兩次各加入分兩次各加入200l氯仿氯仿/甲醇（甲醇（2:1）沖洗器壁。）沖洗器壁。 液體移入液體移入EP管（約管（約100-200l）,8000 rpm，離心，離心10 min，去沉淀。，去沉淀。4保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?細(xì)胞磷脂的提取細(xì)胞磷脂的提取2011/12/2823點(diǎn)樣點(diǎn)樣（距離底邊距離底邊2*2cm，點(diǎn)樣，點(diǎn)樣10l，溶劑前沿，溶劑前沿1cm）展層展層（展層液：第一層：展層液：第一層： 氯仿氯仿:甲醇甲醇:水水=65:25:4 第二層第二層: 氯仿氯仿:甲醇甲醇:乙酸乙酸:水水=80:12:15:4 ）顯色顯色（6種顯色劑）種顯色劑）實(shí)驗(yàn)流程：實(shí)驗(yàn)流程：2011/12/2

21、824C. 甲基萘醌測(cè)定甲基萘醌測(cè)定2011/12/2825大多數(shù)細(xì)菌含有甲基萘醌或泛醌，或兩者均有。包大多數(shù)細(xì)菌含有甲基萘醌或泛醌，或兩者均有。包括放線(xiàn)菌在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌只含甲基萘醌。括放線(xiàn)菌在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌只含甲基萘醌。放線(xiàn)菌及有冠軍的甲基萘醌異戊烯側(cè)鏈長(zhǎng)度和氫飽放線(xiàn)菌及有冠軍的甲基萘醌異戊烯側(cè)鏈長(zhǎng)度和氫飽和度變化相當(dāng)大，多為部分飽和，含有和度變化相當(dāng)大，多為部分飽和，含有7-12個(gè)異戊烯個(gè)異戊烯單位。單位。放線(xiàn)菌目中不同菌屬的甲基萘醌類(lèi)型如下表所示。放線(xiàn)菌目中不同菌屬的甲基萘醌類(lèi)型如下表所示。2011/12/2826放線(xiàn)菌目中甲基萘醌類(lèi)型放線(xiàn)菌目中甲基萘醌類(lèi)型類(lèi)型類(lèi)型萘醌種類(lèi)萘醌

22、種類(lèi)Eubacteria（異戊烯單位無(wú)氫化）（異戊烯單位無(wú)氫化）IaMK-7Bmk-9Mycobacterium（主要是（主要是8或或9個(gè)異戊烯個(gè)異戊烯單位上被單位上被2或或4個(gè)氫化）個(gè)氫化）IIaMK-8(H2)bMK-8(H4)cMK-9(H2)dMK-9(H4)Saccharomonospora（4氫化的多烯萘醌）氫化的多烯萘醌）IIIaMK-8(H4), MK-9(H4)bMK-9(H4),MK-10(H4)Streptomyces（具有同一鏈長(zhǎng)，但氫（具有同一鏈長(zhǎng)，但氫飽和度不同的萘醌）飽和度不同的萘醌）IVaMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6)bMK-9(H4),

23、 MK-9(H6),MK-9(H8)cMK-10(H4),MK-9(H6)菌體的收集制備菌體的收集制備待測(cè)菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心收集菌體，用蒸餾待測(cè)菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心收集菌體，用蒸餾水洗滌兩次，菌體于水洗滌兩次，菌體于-80冷凍冷凍3d，冷凍干燥機(jī)抽干菌，冷凍干燥機(jī)抽干菌體，凍干菌體體，凍干菌體4干燥器保存?zhèn)溆?。干燥器保存?zhèn)溆?。醌的提取及純化醌的提取及純?011/12/2827D. 脂肪酸測(cè)定脂肪酸測(cè)定放線(xiàn)菌細(xì)胞中脂肪酸的鏈長(zhǎng)、雙鍵位置和數(shù)量及取代基團(tuán)具放線(xiàn)菌細(xì)胞中脂肪酸的鏈長(zhǎng)、雙鍵位置和數(shù)量及取代基團(tuán)具有分類(lèi)學(xué)意義，是一項(xiàng)重要的分類(lèi)特征。有分類(lèi)學(xué)意義，是一項(xiàng)重要的分類(lèi)特征。脂肪

24、酸組份一般較為復(fù)雜，分別歸屬脂肪酸組份一般較為復(fù)雜，分別歸屬3種類(lèi)型：種類(lèi)型： 直鏈飽和與不飽和、分枝和復(fù)雜形式的脂肪酸。直鏈飽和與不飽和、分枝和復(fù)雜形式的脂肪酸。脂肪酸分析應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)化的條件下進(jìn)行，因?yàn)椴煌M分的相對(duì)脂肪酸分析應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)化的條件下進(jìn)行，因?yàn)椴煌M分的相對(duì)含量因菌齡和培養(yǎng)條件的不同而異。含量因菌齡和培養(yǎng)條件的不同而異。脂肪酸定性分析結(jié)果限于屬和屬以上的分類(lèi)；脂肪酸定量分脂肪酸定性分析結(jié)果限于屬和屬以上的分類(lèi)；脂肪酸定量分析可為種和亞種分類(lèi)提供有用的基本資料。析可為種和亞種分類(lèi)提供有用的基本資料。2011/12/28282.2.3 基因型分類(lèi)基因型分類(lèi)AG+C%含量分析含量分析BDN

25、A-DNA分子雜交分子雜交C16srRNA基因序列分析及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建基因序列分析及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建2011/12/2829A. G+C%含量分析含量分析DNA 堿基組成比例（堿基組成比例（G+C mol%）是十分典型的基因指征之一，）是十分典型的基因指征之一，一般認(rèn)為一般認(rèn)為 G+C mol%在種內(nèi)相差不會(huì)超過(guò)在種內(nèi)相差不會(huì)超過(guò) 3%，在屬內(nèi)不會(huì)超過(guò)，在屬內(nèi)不會(huì)超過(guò) 10%。大量分析結(jié)果表明：放線(xiàn)菌屬于高大量分析結(jié)果表明：放線(xiàn)菌屬于高 GC 含量的微生物，并且含量的微生物，并且 G+C%變化范圍小，最多不會(huì)超過(guò)變化范圍小，最多不會(huì)超過(guò) 30%。由于。由于 G+C%在不同物在不同物種中均是比較恒定的

26、，因此可作為諸多分類(lèi)指征中不可或缺的一種中均是比較恒定的，因此可作為諸多分類(lèi)指征中不可或缺的一個(gè)，常常作為屬的分類(lèi)鑒定標(biāo)準(zhǔn)之一。個(gè)，常常作為屬的分類(lèi)鑒定標(biāo)準(zhǔn)之一。2011/12/2830HPLC實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：2011/12/2831實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)條件：1.0ml/min 37C柱子：柱子：C18反相柱反相柱溶劑：溶劑：12%甲醇甲醇 20mM磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1） 20mM磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1）配制：）配制：三乙胺（三乙胺（99%）用水稀釋?zhuān)茫┯盟♂專(zhuān)?5%磷酸調(diào)磷酸調(diào)pH至至5.1，即，即0.5M磷酸三乙胺磷酸三乙胺40ml 0.5M磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1）與）與750ml glass-distilled water混合，再混合，再加入加入120mlHPLC-grade甲醇，再加入水至總體積為甲醇，再加入水至總體積為1L。不用柱子時(shí)，流速減至不用柱子時(shí)，流速減至0.1ml/min當(dāng)儀器超過(guò)當(dāng)儀器超過(guò)3天不使用時(shí)，柱子先用水清洗，再用天不使用時(shí)，柱子先用水清洗，再用70%甲醇清洗。甲醇清洗。B. DNA-DNA分子雜交分子雜交DNA-DNA分子雜交可以在基因組水平上研究微生物間的分子雜交可以在基因組水平上研究微生物間的區(qū)別與聯(lián)系，用于種水平的分類(lèi)學(xué)研