食品分析《維生素的測(cè)定》(第8章)

1、第第8 8章：維生素的測(cè)定章：維生素的測(cè)定浙江科技學(xué)院浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 劉鐵兵劉鐵兵Chapter 8 Analysis of VitaminChapter 8 Analysis of Vitamin浙江科技學(xué)院浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院劉劉 鐵鐵 兵兵食品分析1）維生素對(duì)人體的作用：維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類天然有機(jī)化合物。其種類很多，目前已確認(rèn)的有30余種，其中被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的有20余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚或醌類化臺(tái)物。

2、作為代謝的輔酶。 這些化合物或其前體化合物都在天然食物中存在；它們不能供給機(jī)體熱能。也不是構(gòu)成組織的基本原料，主要功用是通過(guò)作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過(guò)程，需要量極?。凰鼈円话阍隗w內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝??；長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。 我們?cè)谠u(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開(kāi)發(fā)利用高含量維生素的食品資源，指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)制定加工工藝或貯存條件，最大限量地保留各種維生素，還要控制強(qiáng)化食品中加入量，防中毒，都離不開(kāi)分析檢測(cè)工作。維生素的共性：維生素的共性： 化學(xué)方法： 3 3）維生素分析方法：）維生素分析方法： 水溶性維生素：B、C 脂溶性維生素：A、

3、D、E、K 2 2）維生素的分類：）維生素的分類： 儀器方法： 微生物法： 生物鑒定法： 1溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。 2耐酸堿性：維生素A、D對(duì)酸不穩(wěn)定， 對(duì)堿穩(wěn)定，維生素E對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。脂溶性維生素的測(cè)定脂溶性維生素的測(cè)定脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)：脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)：VA、VD、VE、與類脂物一起存于食物中，攝食時(shí)可吸收，可在體內(nèi)積貯。 耐熱性 氧化性VA 好，能經(jīng)受煮沸 易被氧化 （光、熱 促進(jìn)其氧化）V D 好，能經(jīng)受煮沸 不易被氧化V E 好，能經(jīng)受煮沸 在空氣中能

4、慢慢被氧化 （光、熱、堿促進(jìn)其 氧化）耐熱性、耐氧化性： 皂化樣品 水洗去除類脂物 有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素(不皂化物) 濃縮 溶于適當(dāng)?shù)娜軇?測(cè)定。 在皂化和濃縮時(shí)，為防止維生素的氧化分解，常加入抗氧化劑(如焦性沒(méi)食子酸、維生素C等)。 對(duì)于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。國(guó)際單位： IU （International Unit) 1 IU = 0.3g VA = 0.025 VD = 1.79 g-胡蘿卜素 = 1.1mg - VE = 3 g VB根據(jù)上述性質(zhì)測(cè)定脂溶性維生素時(shí)，通常：維生素A的結(jié)構(gòu)：CH3CH3CH3CH2OHCH3CH3CH3

5、CH3CH3CH2OHCH3CH3脫氫視黃醇視黃醇高效液相色譜法測(cè)定食物中高效液相色譜法測(cè)定食物中V VA A、V VE E（GB/T 5009.822003GB/T 5009.822003中第一法）中第一法） 高效液相色譜法測(cè)定維生素A是近幾年發(fā)展起來(lái)的方法，此法能快速分離和測(cè)定視黃醇和它的同分異構(gòu)體、酯及其衍生物。此法是同時(shí)測(cè)定維生素A和維生素E的方法。三氯化銻比色法測(cè)定三氯化銻比色法測(cè)定V VA A基本原理：基本原理： 在氯仿溶液中VA能與三氯化銻生成藍(lán)色可溶性絡(luò)合物，在620nm有最大光吸收，其光吸收強(qiáng)度與VA濃度成正比。適用范圍與特點(diǎn)：適用范圍與特點(diǎn)： 適用于高VA含量的食品；對(duì)低V

6、A含量的食品因其它脂溶性成分的存在而受干擾；本法生成的藍(lán)色絡(luò)合物不穩(wěn)定，比色必須在6秒內(nèi)完成。試劑：試劑： 無(wú)水乙醚：不含過(guò)氧化氫，檢測(cè)方法：5ml乙醚加1ml10%碘化鉀振1分鐘，或再加4滴0.5%淀粉，水呈藍(lán)色；去除方法：重蒸餾時(shí)，瓶?jī)?nèi)加入少許鐵絲。GB/T 5009.822003GB/T 5009.822003中第二法）中第二法）測(cè)定方法：測(cè)定方法： 樣品處理：脫脂，用皂化法；皂化-提取-洗滌-濃縮； 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制： 樣品測(cè)定：反應(yīng)在比色皿中進(jìn)行。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 乙醇為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象； 所用氯仿中不應(yīng)有水分，因三氯化銻遇水會(huì)出現(xiàn)沉淀，干 擾測(cè)定；故在每ml氯仿中滴加

7、1滴乙酸酐，以保證脫水； VA見(jiàn)光易分解，故整個(gè)操作要在暗處進(jìn)行； 每國(guó)際單VA相當(dāng)于0.3ugVA。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 樣品中的-胡蘿卜素會(huì)干擾測(cè)定，可將干樣品用正已烷溶解，以氧化鋁為吸附劑，丙酮-已烷混合液為洗脫劑進(jìn)行層析分離； 三氯化銻腐蝕性極強(qiáng)； VA含量高的樣品可直接加無(wú)水硫酸鈉研磨后，加乙醚提取，加三氯甲烷溶解后即為待測(cè)的處理樣品； 顯色劑除用三氯化銻外，還可用三氟乙酸、三氯乙酸?；驹恚夯驹恚?VA的異丙醇溶液在325nm有最大吸收峰，其吸光度與VA含量成正比；適用范圍與特點(diǎn)：適用范圍與特點(diǎn)： 靈敏度高，檢測(cè)下限為5ppm，但325nm吸收干擾物質(zhì)多；因此只適合于透明魚(yú)油

8、、VA濃縮物等純度較高的樣品； 測(cè)定方法：測(cè)定方法： 樣品-皂化-洗脫-脫水-蒸發(fā)-異丙醇溶解-325nm測(cè)定光吸收； VA的前體物質(zhì)：類胡蘿卜素； 、胡蘿卜素，其中以-胡蘿卜素的效價(jià)最高，每毫克-胡蘿卜素相當(dāng)于560國(guó)際單位VA。 胡蘿卜素只存在于植物性食物中；胡蘿卜素對(duì)熱、酸、堿比較穩(wěn)定，但對(duì)紫外線和氧卻不穩(wěn)定，可將其破壞。 胡蘿卜素在450nm有最大吸收；但由于其常與葉綠素、葉黃素等色素共存，故要測(cè)定必須要分離出胡蘿卜素?；驹恚?以丙醇、石油醚提取出胡蘿卜素，以石油醚為展開(kāi)劑進(jìn)行紙層析，由于胡蘿卜素的極性最小，移動(dòng)速度最快，從而與其它色素分開(kāi)，取下此區(qū)帶，洗脫后于450nm比色測(cè)定。

9、 通常用層析法分離測(cè)定胡蘿卜素：胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)如下：胡蘿卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡蘿卜為食物的家禽、獸類、水產(chǎn)動(dòng)物及其加工產(chǎn)品，以及為著色而添加胡蘿卜素的食品，當(dāng)然也含有胡蘿卜素。樣品的提取與洗滌：注意植物油和高脂肪樣品先要皂化；樣品的濃縮與定容：在有氮?dú)猸h(huán)境中濃縮，但不要濃縮得太干；紙層析： 點(diǎn)樣：在基線（距低端4CM處）上取四點(diǎn)，分別在二點(diǎn)間 帶狀點(diǎn)樣； 展開(kāi)：以飽和過(guò)的石油醚為展開(kāi)劑，進(jìn)行上行展開(kāi)； 洗脫：剪下胡蘿卜素色帶，置于5ml具塞試管中，用力振搖， 使色素完全溶解；比色測(cè)定：以石油醚為空白，于450nm處比色測(cè)定；標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：測(cè)定方法： 此法為國(guó)標(biāo)方法，方法簡(jiǎn)單、

10、最小檢出限為0.11ug； 濃縮時(shí)要防止蒸干，同時(shí)要在充氮條件下進(jìn)行； 層析分離也可用柱層析，效果好，但費(fèi)時(shí)； 一般用專用的中速濾紙； （GB/T 5009.832003 ）第一方法是HPLC；第二方法為紙層析法。說(shuō)明與討論：概述：概述： 成人缺乏VD會(huì)患軟骨病，兒童缺乏VD會(huì)患佝僂病；VD有多種，其中最重要的是VD2和VD3及其維生素D原，VD3只存在于某些動(dòng)物性食物中。維生素D2無(wú)天然存在，維生素D2只存在于某些動(dòng)物性食物中。但它們都可由維生素D原(麥角固醇和7一脫氫膽固醇)經(jīng)紫外線照射形成。 1IU=0.025ugVD3 VD測(cè)定方法有：比色法、紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法

11、、薄層層析；比色法和HPLC法為AOAC推薦的VD測(cè)定方法?；驹恚夯驹恚?在三氯甲烷溶液中，VD與三氯化銻結(jié)合生成一種橙黃色化合物，在500nm處的呈色強(qiáng)度與VD的含量成正比； 樣品測(cè)定：樣品測(cè)定：樣品處理：當(dāng)有VA與VD共存時(shí)，要進(jìn)行分離，分離方法為：制備分離柱：分四層，依次為無(wú)水Na2SO4、聚乙二醇層、中性氧化鋁層和無(wú)水Na2SO4；純化：以石油醚為淋洗劑，棄去初濾液，收集一定量；然后用水三次洗以除去殘余的聚乙二醇，避免與三氯化銻反應(yīng)生成混濁物影響比色；然后再用無(wú)水硫酸鈉脫水，之后用三氯甲烷溶解；測(cè)定：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：樣品測(cè)定： VD常與VA、VE、膽固醇等在一起，且量要大大超過(guò)V

12、D，嚴(yán)重干擾其測(cè)定，因此要經(jīng)柱層析去除這些干擾成分； 操作時(shí)加入乙酰氯可消除溫度的影響； 此法不能區(qū)分VD2和VD3，測(cè)定的是二者的總和；說(shuō)明與討論：概述： VE有八種，又稱生育酚，屬于酚類化合物；其中以-生育酚的生理活性最高，分布也最廣；動(dòng)植物中均有分布，其中又以植物油料中為最多。 主要測(cè)定方法有：比色法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜法；比色法操作簡(jiǎn)單，靈敏度較高，但由于VE無(wú)特異性反應(yīng)，要采取一些方法消除干擾；熒光法特異性強(qiáng)、干擾少、靈敏、快速、簡(jiǎn)單；目前測(cè)定VE最好的方法為HPLC法?；驹恚夯驹恚?VE能將Fe3+還原成Fe2+，而Fe2+能與聯(lián)氮苯發(fā)生顏色反應(yīng)，可于520n

13、m比色測(cè)定；測(cè)定操作：測(cè)定操作： 樣品處理：皂化：于KOH的甲醇溶液中皂化，并在充氮?dú)饬髦?2-74皂化，然后加水乙醚萃取，再將萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水；在二氧化碳?xì)饬髦袦p壓蒸干； 純化：用苯作洗脫液進(jìn)行柱層析，洗至洗出液約25ml；若柱上出現(xiàn)微藍(lán)色帶則為類胡蘿卜素；出現(xiàn)暗藍(lán)色帶則為VA； 樣品測(cè)定：FeCl3乙醇溶液、聯(lián)氮苯乙醇溶液；放置10分鐘；520nm； 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制： VE在堿性條件下易被氧化，因此需在N2氣流中皂化，并可加入 焦性沒(méi)食子酸作為抗氧化劑； 處理前應(yīng)將其它可使三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵的還原性物質(zhì)去除； 發(fā)色劑除用聯(lián)氮苯外，也可用4，7-二苯基-1，10-菲繞啉； VE的各種異構(gòu)

14、體與試劑的反應(yīng)速度、呈色強(qiáng)度各不相同； VE見(jiàn)光易氧化，因此操作要避光。說(shuō)明與討論：說(shuō)明與討論： 水溶性維生素B1、B2和C，廣泛存在于動(dòng)植物組織中，飲食來(lái)源充足。但是由于它們本身的水溶性質(zhì)，除滿足人體生理、生化作用外，任何多余量都會(huì)從小便中排出。為避免耗盡，需要經(jīng)常地由飲食來(lái)提供。 水溶性維生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，既使加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在堿性條件下加熱，可破壞大部分或全部。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響； 維生素B2對(duì)光，特別是紫外線敏感，易被光線破壞； 維生素C對(duì)氧、銅離子敏感，易被氧化。水水

15、溶溶 性性 維維 生生 素素 的的 測(cè)測(cè) 定定根據(jù)上述性質(zhì)，測(cè)定水溶性維生素時(shí)，一般都在酸性溶液中進(jìn)行前處理。 維生素B1、B2 鹽酸水解 酶解 提取 純化 維生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對(duì)維生素C的破壞作用。草酸價(jià)廉，使用方便，對(duì)維生素C有很好的保護(hù)作用。 淀粉酶淀粉酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶活性人造浮石活性人造浮石硅鎂吸附劑硅鎂吸附劑概述： VB1又名硫胺素，可與鹽酸生成鹽酸鹽；通常以游離態(tài)，自然界常與焦磷酸結(jié)合成焦磷酸硫胺素（TPP）。在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色蔬菜和牛乳、蛋黃中含量較為豐富。VB1在機(jī)體代謝

16、中具有重要作用，缺乏會(huì)引起腳氣病、神經(jīng)炎等。人體維生素B1的需要量為每天12mg。主要測(cè)定方法有：分光光度法、熒光法、高效液相色譜法；GB/T 5009.842003中唯一的方法是熒光計(jì)法。熒熒 光光 法法 測(cè)測(cè) 定定 維維 生生 素素 B1 B1基本原理：基本原理： VB1在堿性高鐵氰化鉀溶液中，能被氧化成一種藍(lán)色的熒光化合物硫色素，在沒(méi)有其它熒光物質(zhì)存在時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與硫色素的濃度成正比。所含雜質(zhì)需要用柱色譜法處理，測(cè)定提純?nèi)芤褐蠽B1的含量。操作步驟：操作步驟：（1）樣品處理：（2）提純：（3）氧化：（4）標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)空白制備：（5）測(cè)定：（1）凡士林有熒光，因此活塞上不能涂，可用甘油

17、-淀粉代替；（2）一般樣品中VB1有游離也有結(jié)合型，故需要用酸和酶水解；（3）谷物類不需要酶分解，樣品經(jīng)粉碎后用酸性氯化鉀直接提 取，氧化測(cè)定；（4）一般每克人造沸石能吸附30ugVB1，硫胺素量過(guò)大，回收 率下降；（5）鐵氰化鉀的用量要適當(dāng)，過(guò)多會(huì)破壞硫胺素，過(guò)少則硫胺 素氧化不完全；（6）樣液和標(biāo)準(zhǔn)液通過(guò)交換管的流速要一致，流速過(guò)快會(huì)因交 換不徹底或吸附不完全而影響測(cè)定結(jié)果。 說(shuō)說(shuō) 明：明：維生素維生素B B2 2即核黃素。即核黃素。在食品中以游離形式或磷酸酯等結(jié)合形式存在。膳食中的主要來(lái)源是各種動(dòng)物性食品，其中以肝、腎、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆類和新鮮綠葉蔬菜。分析方法：

18、 GB/T 5009.852003中第一法為熒光法， 第二法為微生物法。維維 生生 素素 B2 的的 測(cè)測(cè) 定定維維 生生 素素 C C 的的 測(cè)測(cè) 定定概述：概述： VC又名抗壞血酸，廣泛分布于新鮮果蔬及綠色植物中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑桔等食品中含量尤豐富。VC在生物機(jī)體中起重要功能。 固體VC比較穩(wěn)定，但其水溶液極易氧化，氧化速度隨溫度升高pH增加而加快維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3 -二酮古樂(lè)糖酸，失去生理作用。VC在食品工業(yè)中常作抗氧化劑。 VC測(cè)定方法主要有2,6-二氯靛

19、酚滴定法、2,4-二硝基苯肼比色法、熒光法、極譜法、HPLC法等。原理：原理： 中性和弱酸性條件下，Vc能將2,6-二氯酚靛酚還原成無(wú)色的還原型2,6-二氯酚靛酚，同時(shí)Vc被氧化成脫氫Vc，因此可用2,6-二氯酚靛酚測(cè)樣品中的V c含量。Vc全部被氧化后，稍多加一點(diǎn)染料，使溶液呈淡粉紅色，即為終點(diǎn)。如無(wú)其它干擾，則消耗的染料與樣品中Vc含量成正比。 Vc的提?。?g樣品（加5ml2%草酸，研磨成勻漿）轉(zhuǎn)入50ml容量瓶（殘?jiān)?%草酸提取23次）并入50ml容量瓶（加2%草酸35ml）用1%草酸定容到刻度過(guò)濾或離心濾液（清液）備用。 空白滴定：取20ml空白液（加35 ml2%草酸，用1%草酸定容到50 ml）用2,6-二氯酚靛酚滴定。 標(biāo)準(zhǔn)液滴定，取標(biāo)準(zhǔn)Vc液20ml23份，置三角瓶中，