血凝和血凝抑制教材

1、血凝和血凝抑制試驗血凝和血凝抑制試驗一、試驗目的血凝試驗：滴定病毒的血凝效價(病毒的凝集價)，采用一定的病毒量，通常采用4個血凝單位。血凝抑制試驗： 應用標準病毒液測定血清中的相應抗體或應用特異性抗體鑒定新分離的血凝性病毒檢測雞群有無病毒感染和監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)。掌握血凝和血凝抑制試驗的原理和操作方法，能夠正確判定試驗結果二、血凝試驗(hemagglutination test) 原理 病毒粒子上的血凝素蛋白與紅細胞特定表面受體相結合，引起特異性凝集。血凝現(xiàn)象：有些病毒可凝集某些動物（如雞、鵝、豚鼠、綿羊）和人的紅細胞。HA試驗的原理示意圖用途：1確定病毒的存在； 2測定病毒的血凝價血凝價：能使

2、一定量紅細胞發(fā)生50%凝集的 病毒最高稀釋度實驗材料實驗材料器材：96孔V型微量反應板、微量移液器、槍頭試劑：1%雞紅細胞(采集健康雞血液，以阿氏液抗凝， 用PBS洗滌3-5次，用PBS配成1%紅細胞懸液備 用)。 試驗抗原、PBS緩沖液血凝實驗步驟血凝實驗步驟1.取96孔V型反應板1塊置于水平實驗臺上，在第1排 1-10孔內加入25ulPBS緩沖液，第11孔不加。第12孔 加25ulPBS緩沖液2.在第1孔內加入血凝素25ul，混勻后吸出25ul加入第 2孔內，再混勻后吸出25ul加入第3孔內，依次類推 至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。3.在1-12孔均加入25ul的生理

3、鹽水。4.在每孔內加入25ul1%的雞紅細胞懸液，震蕩，室溫靜止感 作15-30min，每5min觀察一次結果。5.計算血凝效價，稀釋使成為四價備用結果判定結果判定1.在各組對照均正確的情況下，按下列標準判定 血凝反應強度示意圖“4” 紅細胞呈片狀凝集，均勻布滿孔底，邊緣有時不整齊或皺縮?！?” 紅細胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”?！?” 紅細胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點狀?！啊?紅細胞大部分沉于孔底中央，周圍有少量散在凝集顆粒。“” 紅細胞均沉于孔底呈小圓點狀，邊緣整齊。2.對照孔正常的情況下，紅細胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價的終點。凡能使雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀

4、釋倍數(shù)為病毒的凝集價。血凝抑制試驗步驟血凝抑制試驗步驟1.取96孔V型反應板1塊置于水平實驗臺上， 在第1排1-10孔內加入25ul PBS緩沖液，第11孔不加。第12孔加25ul PBS緩沖液。2.在第1孔內加入被檢血清25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內，再混勻后吸出25ul加入第3孔內，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。3.在1-12孔內均加入“四價”血凝素25ul，震蕩后，室溫靜止作用40min。4.在1-12 孔內均加入1%的雞紅細胞懸液25ul，震蕩，室溫30min。5.觀測結果，記錄實驗數(shù)據(jù)血凝抑制試驗結果判定血凝抑制試驗結果判定 測定孔 RBC沉于

5、孔底中心，呈紐扣狀。(+) 凝集 （-） 病毒對照孔：凝集 RBC對照孔：無自凝 血凝抑制試驗效價：呈完全血凝抑制使的最高血清稀釋度。 思考題1、病毒凝集紅細胞是不是一種特異的抗原體反應？為什么？ 2、血凝抑制實驗是不是特異的抗原抗體反應? 為什么？3、血凝試驗中為什么要加補充液？4、為什么加病毒液和紅細胞懸液時要反向加？5、血凝試驗和血凝抑制試驗中空白對照的意義？孔號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)12（-)HA稀釋度248163264128256、棄PBS25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素xPBS2525252525252525252525251%雞紅細胞252525252525252525252525結果預測+-+_孔號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)12（-)HI稀釋度248163264128256、棄PBS25252525252525252525X25待檢血清2525252