基因組學(xué)研究在功能基因組中的應(yīng)用

1、基因組學(xué)研究在功能基因組中的應(yīng)用摘 要：20世紀(jì)的最后十年，分子生物學(xué)研究發(fā)生了很大的變革，從單個(gè)基因或蛋白質(zhì)研究轉(zhuǎn)向大規(guī)模研究基因，從而產(chǎn)生了基因組學(xué)、功能基因組學(xué)等新學(xué)科。功能基因組學(xué)是在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)豐富信息資源的基礎(chǔ)上，應(yīng)用先進(jìn)的基因表達(dá)技術(shù)、生物功能檢測(cè)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)分析研究基因的表達(dá)、調(diào)控和功能；探討生物的生長(zhǎng)、發(fā)育規(guī)律的新型交叉學(xué)科。目前功能基因組學(xué)研究的內(nèi)容和方法，主要包括應(yīng)用微點(diǎn)陣、基因表達(dá)系列分析（SAGE）、蛋白質(zhì)組、生物信息學(xué)等方法來(lái)研究基因組表達(dá)概況、基因組多樣性、模式生物體等。關(guān)鍵詞：基因組學(xué)，功能基因組學(xué)，SAGE，蛋白質(zhì)組學(xué)人類基因組計(jì)劃的完成意味著從結(jié)構(gòu)基

2、因組學(xué)到功能基因組學(xué)的跨越，把我們帶進(jìn)了后基因組時(shí)代，基因組學(xué)的研究發(fā)生了翻天覆地的變化已從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)過(guò)渡到功能基因組學(xué)。功能基因組學(xué)以揭示基因組的功能及調(diào)控機(jī)制為目標(biāo)功能基因組學(xué)的研究是21世紀(jì)國(guó)際研究的前沿也是最熱門的研究領(lǐng)域之一。本文簡(jiǎn)要介紹功能基因組學(xué)的研究進(jìn)展尤其是功能基因組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容和研究方法，。1功能基因組的含義基因組(genome)這一概念于1924年提出用于描述生物的全部基因和染色體組成?；蚪M學(xué)(genomics)由美國(guó)科學(xué)家ThomasRoderick于1986年提出是指對(duì)所有基因進(jìn)行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜)核苷酸序列分析基因定位和基因功能

3、分析的一門科學(xué)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(Structural genomics)是基因組學(xué)的一個(gè)重要組成部分和研究領(lǐng)域它是通過(guò)基因作圖，核苷酸序列分析以確定基因組成、基因定位的一門科學(xué)，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)代表基因組分析的早期階段以建立生物體高分辨率遺傳、物理和轉(zhuǎn)錄圖譜為主。比較功能基因組學(xué)(comparative genomics)是在基因組圖譜及序列測(cè)定的基礎(chǔ)上對(duì)已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較以了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理及物種進(jìn)化的學(xué)科。功能基因組學(xué)(functional genomics)被稱為后基因組學(xué)(post genomics)是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息和產(chǎn)物發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段通過(guò)在基因組或系統(tǒng)

4、水平上全面分析基因的功能使得生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向多個(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究的一門科學(xué)，功能基因組學(xué)代表基因組分析的新階段以高通量、大規(guī)模試驗(yàn)方法、統(tǒng)計(jì)與計(jì)算機(jī)分析為主要特征。功能基因組學(xué)的近期目標(biāo)是采用高通量、大規(guī)模、自動(dòng)化的方法加速遺傳分析進(jìn)程；長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)是避開傳統(tǒng)遺傳分析的局限采用系統(tǒng)化的途徑及數(shù)據(jù)采集方法闡明復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。2 功能基因組學(xué)的研究方法基因的時(shí)空差異表達(dá)是植物發(fā)育、分化、衰老和抗逆等生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)?；蛟诓煌M織、不同器官以及不同環(huán)境條件下的差異表達(dá)特征，為基因的功能提供了重要的信息。Velculescu等(1997)將在特定組織或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄

5、的所有基因及其表達(dá)豐度稱為轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)，因此在轉(zhuǎn)錄水上進(jìn)行的基因表達(dá)差異分析實(shí)際上就是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究。經(jīng)典的減法雜交(subtractive hybridization)，差示篩選(differential screening)，cDNA代表差異分析(representative difference analysis，RDA)以及mRNA差異顯示(differential display)等技術(shù)已被廣泛用于鑒定和克隆差異表達(dá)的基因，但是這些技術(shù)不能勝任對(duì)大量的植物基因進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析，于是，基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(serial analysis of gene exp

6、ression，SAGE)、cDNA微陣列(cDNA microarray)和DNA芯片(DNA chip)等能夠大規(guī)模地進(jìn)行基因差異表達(dá)分析的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。2.1 基因表達(dá)的系統(tǒng)分析( SAGE)SAGE技術(shù)的主要理論依據(jù)是:來(lái)自cDNA 3端特定位置的一段911bp長(zhǎng)的序列能夠區(qū)分基因組中95%的基因。這一段基因特異的序列被稱為SAGE標(biāo)簽(SAGE tag)。通過(guò)對(duì)cDNA制備SAGE標(biāo)簽并將這些標(biāo)簽串聯(lián)起來(lái)，然后對(duì)上述串聯(lián)起來(lái)的SAGE標(biāo)簽進(jìn)行測(cè)序不僅可以顯示各SAGE標(biāo)簽所代表的基因在特定組織中是否表達(dá)，還可以根據(jù)各SAGE標(biāo)簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達(dá)豐度的指標(biāo)。應(yīng)用SAG

7、E技術(shù)的一個(gè)必要前提是GenBank中必須有足夠的某一物種的DNA序列資料，尤其是EST序列資料。目前該技術(shù)在人類和酵母基因組研究中已得以應(yīng)用，但是尚未用于植物基因組研究。SAGE技術(shù)的不足是不能夠檢測(cè)出稀有轉(zhuǎn)錄物。2.2 cDNA 微陣列和 DNA 芯片技術(shù) cDNA微陣列和DNA芯片都是基于reverse Northern雜交以檢測(cè)基因表達(dá)差異的技術(shù)。二者的基本思路都是首先把cDNA，或EST，或基因特異的寡聚核苷酸固定在固相支持物上，并與來(lái)自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA探針進(jìn)行雜交，然后用特殊的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析，理論上雜交點(diǎn)的強(qiáng)度基本上反映

8、了其所代表的基因在不同細(xì)胞、組織或器官中的相對(duì)表達(dá)豐度。這兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)大量基因，甚至整個(gè)基因組的基因的表達(dá)差異進(jìn)行對(duì)比分析。cDNA微陣列技術(shù)是Schena等(1995)發(fā)展起來(lái)的，其主要優(yōu)點(diǎn)是:靈敏度極高，mRNA豐度低至10萬(wàn)分之一仍能被檢測(cè)出;使用幾種不同顏色的熒光染料標(biāo)記探針，這樣在同一張陣列膜上進(jìn)行一次雜交實(shí)驗(yàn)就可以同時(shí)分析不同細(xì)胞間或不同環(huán)境脅迫下基因表達(dá)的差異。cDNA微陣列技術(shù)的主要不足是成本非常高，如需要機(jī)器人點(diǎn)膜和特殊的信號(hào)檢測(cè)分析系統(tǒng)，點(diǎn)在玻璃片上的array不能重復(fù)使用等。最近，Desprez等和胡玉欣等分別獨(dú)立發(fā)展了利用尼龍膜作固相支持物和使用同位素標(biāo)記

9、探針進(jìn)行雜交的cDNA表達(dá)陣列技術(shù)，從而降低了成本，但檢測(cè)的靈敏度卻降低了(萬(wàn)分之一)。DNA芯片技術(shù)是Affymetrix公司率先研制出來(lái)的，該技術(shù)利用結(jié)合化學(xué)手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特異的寡聚核苷酸，并與熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，再利用特殊的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)分析，就可以獲得基因的時(shí)空差異表達(dá)譜，最近Ramsay(1998)對(duì)DNA芯片技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行了較全面的介紹。2.3 蛋白組( proteome) 研究轉(zhuǎn)錄不是基因表達(dá)的最終結(jié)果，基因功能的實(shí)現(xiàn)最終是以蛋白質(zhì)的形式體現(xiàn)的。因此，在轉(zhuǎn)錄水平上所獲取的基因表達(dá)的信息有時(shí)并不足以揭示該基因在細(xì)胞內(nèi)的確切功能。蛋白組指的是由基

10、因組表達(dá)產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱，由英文單詞protein的前半部加上單詞genome的后半部組合而成。蛋白質(zhì)雙向電泳是目前蛋白組研究的首選技術(shù)（Humphery Smith，1997），但是該技術(shù)在以下方面尚需改進(jìn)：分辨率和可重復(fù)性；蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的自動(dòng)定量檢測(cè)系統(tǒng)，以及蛋白質(zhì)N端和內(nèi)部氨基酸序列測(cè)定技術(shù)等。 利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)基因敲除(knock-out)突變體或轉(zhuǎn)基因重組體與野生型個(gè)體間雙向電泳蛋白圖譜的差異進(jìn)行對(duì)比分析就可以對(duì)目的基因的功能進(jìn)行分析。在植物上該技術(shù)已被用來(lái)分離新的基因，Damerval等(1998)分析了玉米Opaque2基因的近等基因系之間的雙向電泳蛋白圖譜的差異，結(jié)果

11、鑒定克隆了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄激活因子基因。對(duì)水稻鹽脅迫處理和ABA處理前后的雙向電泳蛋白圖譜進(jìn)行的對(duì)比分析同樣克隆了幾個(gè)與水稻耐鹽性相關(guān)的胚胎晚期豐富蛋白(lea)基因。2.4 反向遺傳學(xué)研究 傳統(tǒng)的遺傳學(xué)或稱為正向遺傳學(xué)(forward genetics)主要研究自發(fā)或誘發(fā)突變體中某一突變性狀的遺傳行為，如控制突變性狀的基因的數(shù)目及其在染色體上的位置、突變性狀在后代中的傳遞規(guī)律等。反向遺傳學(xué)(reverse genetics)是在已知基因序列的基礎(chǔ)上研究基因的生物學(xué)功能，一般通過(guò)創(chuàng)造功能喪失(loss-of-function)突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)。在微生物和小鼠中可以通過(guò)同源重組的方法

12、用突變的基因取代野生型基因創(chuàng)造功能喪失突變體進(jìn)行反向遺傳學(xué)研究，但在植物中很難進(jìn)行同源重組試驗(yàn)(Puchta H,1996)，不過(guò)植物中有成熟的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(transposon tagging)系統(tǒng)和T-DNA標(biāo)簽系統(tǒng)，而且目前已經(jīng)獲得了擬南芥、金魚草、番茄、玉米和水稻等植物的轉(zhuǎn)座子插入誘變的突變體群體，以及T-DNA插入誘變了的擬南芥突變體群體。從這些突變體群體中篩選出特異基因被突變了的植株，并對(duì)突變株進(jìn)行表型分析將有助于揭示目的基因的生物學(xué)功能。篩選突變體的常用方法是利用PCR技術(shù)，這是在果蠅(Ballinger D G,1989)和線蟲(C.elegans)(Zwaal R R,1993

13、)中發(fā)展起來(lái)的比較成熟的方法，其基本思路是根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)一個(gè)引物，再根據(jù)插入元件(轉(zhuǎn)座子或T-DNA)的序列設(shè)計(jì)第二個(gè)引物，用上述引物對(duì)突變體群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于只有目的基因插入轉(zhuǎn)座子或T-DNA的突變體才有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這樣根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)就可以很容易地從數(shù)以千計(jì)的突變體群體中篩選出所需要的突變體。該技術(shù)已經(jīng)在矮牽牛(Koes R,1995)、玉米(Bensen R T,1995；Mena M，1996)和擬南芥（Krysan P J，1996）等植物中得以成功應(yīng)用。但是對(duì)數(shù)以千計(jì)的材料進(jìn)行PCR反應(yīng)工作量十分巨大，為克服這一困難，Winkler等(1998)設(shè)計(jì)了利用DNA

14、混合池(pooling)進(jìn)行突變體篩選的實(shí)驗(yàn)程序，結(jié)果只需要進(jìn)行36個(gè)PCR反應(yīng)就可以從由6000個(gè)突變體組成的群體中篩選出單個(gè)的突變株，大大減輕了篩選的工作量，同時(shí)這些突變體的DNA樣品及構(gòu)建的DNA池也可以向其他研究者免費(fèi)提供。當(dāng)然，要對(duì)基因組中所有的基因進(jìn)行功能分析所需要的突變體的數(shù)目也是十分可觀的，理論上，要達(dá)到95%的概率使基因組中每一個(gè)基因均因插入元件而致突變，則所構(gòu)建的突變體群體中個(gè)體的數(shù)量至少應(yīng)為該植物基因總數(shù)的5倍左右。3基因組學(xué)在我的課題中的應(yīng)用 我的課題為山葡萄抗霜霉病候選基因功能驗(yàn)證研究。葡萄是一個(gè)具有多樣性的群體，不同群體和個(gè)體在生物學(xué)性狀以及在對(duì)疾病的易感性、抗性上的差別，是由于基因序列的差異與內(nèi)外環(huán)境相互作用的結(jié)果。這種基因不同的差異極為多態(tài)性，最常見的多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNPs），葡萄中大約有三萬(wàn)多個(gè)基因，編碼區(qū)的SNPs可能導(dǎo)致蛋白序列的多態(tài)性，非編碼區(qū)的