圓二色譜 張詩群

1、高級物理化學實驗實驗項目名稱：圓二色光譜原理、實驗技術及應用姓名: 張詩群 學號：130420123 指導教師：吳舒婷老師成績評定： 評閱教師：日期： 2014 年 7 月 10 日一、實驗目的：1 圓二色性；2 圓二色譜的原理及應用；3 圓二色譜的相關拓展知識；4 圓二色譜的實驗技術及操作；二、實驗原理： 圓二色性是手性分子在光學上表現(xiàn)的一種特性。光可視為振動方向與傳播方向垂直的電磁橫波。當光波的電矢量方向以一個固定的角速度以傳播方向為軸心勻速旋轉時，稱之為圓偏振光。根據(jù)圓偏振光電矢量旋轉方向的不同，可以將其區(qū)分為左圓偏振光和右圓偏振光。一束平面偏振光可以看成是由兩個振幅和速度相同而螺旋前進

2、方向相反的圓偏振光疊加而成（圖1）。兩圓偏振光彼此對映，互為鏡像。當手性物質在偏振光的波長范圍內存在吸收的時候，其對左右圓偏振光的吸收程度，也就是摩爾吸光系數(shù)，是不同的。此時不但偏振光的偏振平面將被旋轉，構成該偏振光的左右圓偏振光的振幅也將不再相等。組成出射光的左右圓偏振光的電矢量和將沿一個橢圓軌跡移動，此時的出射光就是橢圓偏振光（圖2）。這種光學現(xiàn)象就稱為手性物質所具有的圓二色性。對于純手性物質，其橢圓偏振光的橢圓度在特定溶劑、濃度、溫度和光程下，在特定波長處為定值。同時，在特定波長處的橢圓度與在該波長處對左右圓偏振光的摩爾吸光系數(shù)之差()成正比。將或對波長作圖，即得到圓二色光譜。圖1 右圓

3、偏振光(a)、左圓偏振光(b)及平面偏振光示意圖，水平箭頭表示光的傳播方向。圖2 (a) 平面偏振光的圓組分；(b) 平面偏振光的旋轉與圓組分；(c) 橢圓偏振光的旋轉與圓組分被吸收的情況。其中，OB與OC分別表示右、左圓偏振光被吸收后的振幅，OD表示OB與OC的矢量和，表示橢圓偏振光的橢圓率角，tan = OE/OA 。圓二色光譜的英文名稱為Circular Dichroism，簡稱CD光譜。其光譜儀的基本測試原理是通過入射圓偏振光的波長變化，測定手性樣品的左圓偏振光和右圓偏振光摩爾消光系數(shù)之差。由于CD光譜反映了光和分子間的能量交換，因而只能在有最大能量交換的共振波長范圍內測。CD光譜可用

4、于分析一般電子光譜所不能體現(xiàn)出來的能級躍遷的細節(jié)，是討論手性化合物電子躍遷性質的重要表征手段。當測試條件嚴格一致時，一對對映異構體的CD光譜呈鏡像對稱。通常采用光學純的樣品（即僅含單一對映體）進行CD光譜的測定，可由實驗值 根據(jù)濃度 c、光程長 l 求出該純樣的 。在嚴格相同的測試條件下，測定未知樣品的CD光譜，可根據(jù)實驗值求出未知樣的 。根據(jù)上述數(shù)據(jù)可估算未知樣品的對映體過量值（Enantiomeric Excess，簡稱ee%）。當樣品溶解性差、溶劑背景干擾、溶解過程中絕對構型發(fā)生變化時，固相CD光譜測試很有必要。通常對純樣進行CD光譜的測試，可在樣品絕對構型與CD信號間建立關聯(lián)。對同物質

5、未知ee%值的樣品，可通過CD光譜，簡單判斷其哪種對映體過量。此外，光譜還可結合其他結構表征手段用于關聯(lián)確定手性化合物的絕對構型，或檢測靶向分子與DNA等生物大分子的相互作用。圖3 圓二色光譜儀示意圖如圖3所示，圓二色光譜儀由氙燈光源、單色系統(tǒng)、偏振系統(tǒng)、樣品臺、光電倍增管等部件組成。具體參數(shù)如下：光源 兩種標配燈：150瓦氙燈及150瓦汞氙燈可同時裝置。分離式光源置,205nm以上測量不需使用氮氣,波長205nm以下氮器使用量3升/每分鐘。單色器 光柵：雙光柵1200條/mm。波長設定范圍：185至800 nm。光學系統(tǒng) 全反射消色差的光學系統(tǒng), 氟化鎂（MgF2 ）偏振光學組件,具參比二極

6、管檢測器。數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析采樣速率： 10 微秒/每點-1000 秒/每點。波長掃描速度： 最高 1200nm/min (0.05秒 to 20秒/每點) 。圓二色測量噪聲： 0.01 mdeg(2nm, 1sec)?；€穩(wěn)定性： 0.01 mdeg/小時。CD分辨率： 最低達0.0006mdeg。CD測量范圍： 最高達6500mdeg。三、儀器和藥品：（1）、藥品：KCl (光譜純)、純手性試劑、無水乙醇（A.R.）。（2）、儀器：MOS-450圓二色光譜儀，分析天平，壓片機（包括壓模等），瑪瑙研缽。四、實驗步驟：1 電源依次打開ALX-250光源開關（先開光源盒背后開關，再開光源盒面板開

7、關），MM-450電源開關，計算機電源，預熱半小時。查看ALX-250面板顯示功率，微調旋鈕，將功率確定在150W。 2 制備樣品液相樣品：選取潔凈的比色皿，為減小實驗誤差，空白與試樣宜采用同一比色皿。固相壓片樣品：采用KCl壓片法。以光譜純KCl（需自備）為惰性介質。壓制純KCl片為空白樣，待測樣品與KCl混合物壓片為試樣片，二者質量宜相同，以確保厚度一致。壓片越薄越透明越好。3 開啟程序(1)點擊電腦桌面上的“BioKine”圖標，進入BioKine軟件操作主界面。(2)點擊操作主界面的Device/Scanning Spectrometer，進入光譜掃描界面。4 安放空白樣液相樣品：將裝

8、有待測樣品空白溶液（如水或緩沖鹽）的石英比色皿放入樣品倉，確保每次測試比色皿放置朝向相同，蓋上蓋子。固相壓片樣品：取下光電倍增管，將帶有純KCl壓片的模具置于樣品臺上，凹口向內垂直放置，將光電倍增管罩住固體壓片模具，鎖緊螺絲。5 空白樣掃描與扣除(1) 根據(jù)樣品的最大吸收波長，輸入到操作界面下方的“Ex”處，回車。(2) 點擊按鈕變?yōu)?，然后點擊，自動調整HV電壓，然后再點擊按鈕，鎖定此電壓值。(3) 點擊主界面上方的 按鈕，進行測試參數(shù)的設置：a) Acquisition mode：選擇測量模式CD；b) Begin(nm)：掃描初始波長；c) End(nm）：掃描結束波長；d) Scan R

9、epeat ：掃描次數(shù)；e) Acquisition duration：每個nm的測量持續(xù)時間，范圍0.05s-20s。此數(shù)值越長，則掃描時間越長，信噪比越優(yōu)；f) Shutter Automatic mode：選擇Always open；g) PM gain*10：當在非常低的信號測量，可選擇此項，進行信號的增益。h) CD parameters：CD的靈敏度，根據(jù)信號的振幅設置，有四個不同的選項，1000、300、100和30 mdeg。上述選項，b), c) 項應根據(jù)試樣的紫外可見吸收譜帶選定，其他參數(shù)可選用默認值。以上參數(shù)都設置好后，點擊OK按鈕，參數(shù)設置完成，回到主界面。(4) 點擊

10、主界面左方Blank spectrum區(qū)域的Record按鈕，進行空白樣的掃描。(5) 掃描完成后，在第四步的操作區(qū)域內，選中Subtract復選框，將在隨后進行的試樣光譜測試中扣除空白值。6 樣品的測量1 再點擊Shutter按鈕關閉擋板，點擊HV on按鈕變?yōu)镠V off 。將空白樣品替換成待測樣品，放置方法與空白樣相同。2 這時再點擊Shutter打開擋板，點擊HV off按鈕變?yōu)镠V on，然后點擊Auto，自動調整HV電壓，然后再點擊Auto按鈕，鎖定此電壓值。3 點擊主界面Acquisition control區(qū)域的按鈕，進行待測樣品的圓二色光譜掃描。 7 譜圖數(shù)據(jù)的保持選擇主界面

11、的File菜單下的Save As。注意選中左下角的“Save As Text”復選框，則保存的bka文件可由記事本打開。8儀器的關閉光譜掃描完畢，務必先取出樣品。關閉操作軟件主界面，關閉MM-450電源開關，ALX-250光源開關（光源盒背后開關）；關閉計算機，最后關閉外部電源。五、注意事項1. 每次更換測試樣，請確認如下兩點：a) 光電倍增管處于關閉狀態(tài)：軟件主界面下方的電壓提示處于“ ”狀態(tài)；b) 擋板處于關閉狀態(tài)：軟件主界面下方顯示處于灰色的“ ”狀態(tài)；2. 對于固相樣品測試，需移動光電倍增管的情況，光電倍增管需輕拿輕放，請避免劇烈振動。3. 光譜掃描時，請避免實驗臺面的劇烈震動。4.

12、實驗結束后，固相樣品的壓片模具嚴禁在潮濕狀態(tài)下裝入模具盒。為避免模具生銹，應在清洗后紅外燈下烘干。確認干燥后裝入模具盒，置于干燥器中。5. 實驗數(shù)據(jù)請存放于“I:Data”目錄下。為便于管理，建議以導師姓名為文件夾名稱。6. 每次實驗需拷貝的數(shù)據(jù)，請將另存一份在電腦桌面，并將文件（或文件夾）名稱填寫于電腦桌面“需傳遞數(shù)據(jù).xls”文檔中。請注明數(shù)據(jù)歸屬者姓名，電子郵箱及聯(lián)系方式。數(shù)據(jù)拷貝將由管理人員每周傳遞12次。7. 請做好實驗登記工作，如實登記所測樣品名稱，儀器運行情況，以及實驗時間。8. 如需進行上述實驗內容以外的測試，敬請聯(lián)系管理人員。六、數(shù)據(jù)處理： 圖1. 空白樣圓二色譜圖圖2. 樣

13、品的圓二色譜圖3. 波長隨電壓變化曲線圖因為波長在200nm至300nm時，電壓大于600V，數(shù)據(jù)不準確，所以，當波長為200nm至300nm時，數(shù)據(jù)舍去不用。圖4. 舍棄數(shù)據(jù)后樣品圓二色譜圖由上圖我們可以看出譜圖出現(xiàn)負峰，CD信號表明是右旋，負的CD信號表明左旋。在650nm至800nm處有負Cotton效應,由此可以判定該化合物有CD信號，初步斷定為手性化合物，且為左旋。在300-780nm范圍的峰主要是由于化合物的生色團引起的，對 CD 的貢獻來自含有金屬離子的生色團，這一波段的CD譜對金屬離子的氧化態(tài)、配位態(tài)及鏈鏈相互作用均是敏感的。查閱資料可知，由于樣品中存在負的CD信號，所以樣品中

14、含有M（左手螺旋）構型的Cu(succ)(4，4-bpy)4H20，他們所屬的空間群分別為P6122與P6522。 七、思考討論：1. 哪些物質需要收集CD光譜？CD光譜可以提供哪些信息？ CD光譜的測量條件：在給定波長范圍內有較強的CD信號和合適吸收值的手性物質。CD 光譜提供信息：圓二色譜在有機化合物結構鑒定中有著廣泛的應用?？梢娂敖贤庾鳛槿肷涔庠?這就要求被研究的手性分子要具有發(fā)色基團,通過對發(fā)色基團的研究來獲得分子結構信息,因此它只能提供分子局部的結構信息。主要用于測定蛋白質的立體結構圓二色性R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象。圓二色譜是一種測定分子不對稱結構的光譜法。在分子生物學

15、領域中主要用于測定蛋白質的立體結構，也可用來測定核酸和多糖的立體結構。2. 在CD光譜測試之前，需要哪些準備工作？（1）圓二色譜反映光和分子間能量轉換情況，這種相互作用只在短波范圍內共振波長周圍發(fā)生，并且在共振波長處產生最大能量交換，因此圓二色譜僅在這個區(qū)域可以被測量。理想情況下，紫外吸收譜圖（UV）中吸收帶max和CD的|max（在圖中呈峰或谷）是重合的，但實際上兩者是接近的。CD測試前進行UV測試，可找出其理想的測試光譜范圍。（2）理想的溶液中除樣品分子具有吸收外，其他物質都不具有光學活性。但研究表明絕大部分物質在紫外區(qū)（尤其是250nm以下深紫外區(qū)）都有吸收，并且波長越短，吸收越強，測試

16、光的強度越低。測試光強度太低時，則無法測試。因此，每種溶劑都有其測試截止波長。CD測試中應盡可能選用截止波長較短的溶劑，如水、環(huán)己烷、甲醇、乙醇、乙腈、二氧雜環(huán)已烷，避免截止波長較長的溶劑，如苯、甲苯等。此外，CD測試波長掃描時，應盡量避免深紫外區(qū)的掃描，減少溶劑以及其他物質的吸收干擾。（3）根據(jù)比耳定律，選用光程較短的吸收池和濃度較大的溶液可以有效地減少溶劑吸收。雖然比耳公式表明CD信號與其濃度成線性關系，但并不是濃度越高，CD信號越好。濃度過高將導致吸收峰紅移和扁平效應。此外，值非常小，濃度過高可測光的強度減小，此時吸收所產 生的微小變化則被測試噪音所覆蓋，并且光強越小噪音越大。在波長確定

17、的情況下，理想的濃度所對應的吸光度應在08左右。因此，CD測試前的UV測試，在找出其理想的測試光譜范圍的同時，還可以確定其理想的濃度。（4）有些樣品需在一定的鹽或緩沖液中才能穩(wěn)定或接近其實際使用環(huán)境。但鹽或緩沖溶液的使用通常又會帶來吸收干擾，并且波長越短干擾越強。因此，鹽和緩沖液也有其對應的CD測試截止波長。CD測試中應根據(jù)樣品性質和所選波譜范圍，選用合適的鹽或緩沖溶液，避免吸收干擾。（5）CD信號的質量受倍增電壓值影響，理想的倍增電壓（DV）為200V左右。當倍增電壓高于500V時，CD噪音增加，測試信號減弱，所測結果不可靠。此時應適當稀釋溶液或選用光程較短的樣品池（6）CD樣品應盡可能為均

18、相溶液且不含吸光干擾的雜質，如有不溶物則應過濾或離心去除。為避免紙屑影響，比色皿的擦拭須使用擦鏡紙。此外，溫度或溶劑的變化常會引起溶液中氣體溶解度的變化，析出氣體滯留在溶液中就會產生氣泡。進行溫度或者滴定實驗時，樣品放入圓二光譜儀前，應先排除氣泡干擾，必要時進行攪拌。通常樣品（包括一些在可見光范圍內沒有光化學活性的樣品）都存在著光化反應，從而導致CD信號隨時間而變。光化反應的變化有時會被波長、溫度或其他變化所掩蓋，但通常都遵循以下規(guī)律：狹縫減半，光強減為原來1/4時，光化反應的速率也減為原來的1/4。該規(guī)律常用在相同光照和緩沖條件下，區(qū)分光化反應和其他動力學反應。CD基線校正的條件應盡可能與樣品條件相同，如相同的測試方法、吸收池、光路方向、緩沖體系，并盡可能縮短測試時間差，然后通過CD軟件中的Math操作去除基線干擾。3. 簡述CD光譜對你今后科研工作發(fā)揮的作用。圓二色譜在有機化合物結構鑒定中有著廣泛的應用?？梢娂敖贤庾鳛槿肷涔庠?這就要求被研究的手性分子要具有發(fā)色基團,通過對發(fā)色基團的研究來獲得分子結構信息,因此它只能提供分子局部的結構信息。但今后我工作的主要方向是進行直接乙醇燃料電池陽極催化劑的制備以及性能的研究，制備的一系列催化劑主要是無機化合物，不存在發(fā)色基團，主要還是需要通過BET，SEM，TEM，XR