端粒和端粒酶

1、telomere and telomerasetelomere and telomerase 泰山學(xué)堂2013級(jí)生物取向郭雪瑩Elizabeth BlackburnCarol Greider Jack Szostak 在細(xì)胞分裂時(shí)的染色體在細(xì)胞分裂時(shí)的染色體如何完整地自我復(fù)制如何完整地自我復(fù)制如何受到保護(hù)以免于退化如何受到保護(hù)以免于退化1）端粒和端粒酶的定義2）二者的結(jié)構(gòu)和功能3）合成端粒的機(jī)制4）在細(xì)胞衰老中的作用 1、端粒是染色體末端由重復(fù)DNA序列和相關(guān)蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和完整性的功能。 2、端粒酶是核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，以自身RNA為模板，合成端粒DNA，將端粒DNA加至

2、真核細(xì)胞染色體末端，為細(xì)胞持續(xù)分裂提供遺傳基礎(chǔ)。端粒的結(jié)構(gòu)和功能 由富含G和T的6堿基重復(fù)序列組成，結(jié)合一些蛋白質(zhì)，構(gòu)成染色體的“末端保護(hù)帽”。沒有游離的末端是染色體末端穩(wěn)定的關(guān)鍵。末端補(bǔ)齊機(jī)制：末端補(bǔ)齊機(jī)制：55G-G配對(duì)回折35 （1）端粒端粒T環(huán)環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) (terminal loop) ，使染，使染色體末端封閉起來，色體末端封閉起來，免遭破壞；免遭破壞； （2）端粒端粒D環(huán)環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(displacement loop) ，結(jié)合結(jié)合TRF2等蛋白，阻等蛋白，阻止染色體末端融合和止染色體末端融合和損傷反應(yīng)。損傷反應(yīng)。端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) GT鏈的5端 3端，總是指向染色體的末端。 重復(fù)次數(shù)不保

3、守。 鏈區(qū)內(nèi)有缺口即游離的3-OH存在。 DNA的最末端不能進(jìn)行末端標(biāo)記，推測(cè)其分子是一個(gè)回折結(jié)構(gòu)。端粒的作用 穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)； 保持染色體DNA遺傳信息復(fù)制的完整性，解決決DNA末端復(fù)制問題； 與細(xì)胞衰老有關(guān)。細(xì)胞愈年輕，端粒愈長；細(xì)胞愈老，端粒愈短。 端粒酶的結(jié)構(gòu)由RNA組分和蛋白質(zhì)組分組成。 端粒酶的結(jié)構(gòu)端粒酶的結(jié)構(gòu) 端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體, ,由由RNA RNA 和和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成結(jié)合的蛋白質(zhì)組成, ,是是RNARNA依賴的依賴的DNA DNA 聚合酶。聚合酶。 它是一種特殊的能合成端粒它是一種特殊的能合成端粒DNADNA的酶的酶,

4、,通過明顯的模通過明顯的模板依賴方式每次添加一個(gè)核苷酸。板依賴方式每次添加一個(gè)核苷酸。 端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) ) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERThTERT） 端粒酶結(jié)合蛋白端粒酶結(jié)合蛋白（TEP） 端粒酶結(jié)構(gòu)包括部分：端粒酶(）； 端粒酶催化亞單位（） 端粒相關(guān)蛋白質(zhì)（）。另外，還有0，和等。 其中和是端粒酶最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)。 的結(jié)構(gòu)改變或成分的丟失均會(huì)影響端粒酶的活性。 為端粒酶的催化亞基，是一個(gè)包含個(gè)氨基酸殘基的多態(tài)鏈。具有逆轉(zhuǎn)錄酶的共同結(jié)構(gòu)-個(gè)蛋白質(zhì)域以及端粒酶催化亞基獨(dú)特的框架保守區(qū)域。其編

5、碼基因位于染色體上。是端粒酶起作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)控亞單位，它可以通過逆轉(zhuǎn)錄模板序列，合成端粒重復(fù)序列并添加到染色體末端，從而延長端粒長度。 對(duì)端粒酶活性的表達(dá)，和兩種組分缺一不可，但它們的表達(dá)調(diào)控應(yīng)該是分離的。 在人的組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是一個(gè)普遍現(xiàn)象。 而只在有端粒酶活性的細(xì)胞中（如生殖細(xì)胞、各種具有分裂增殖能力的細(xì)胞和絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞）表達(dá)。 在端粒酶陰性的細(xì)胞中導(dǎo)入編碼的基因，則可重建細(xì)胞的端粒酶活性，結(jié)果細(xì)胞的端粒增長，壽命延長。 的水平和蛋白表達(dá)水平則總是與端粒酶活性呈正相關(guān)。端粒酶活性陽性細(xì)胞中的基因突變或沉默，則細(xì)胞端粒酶活性消長，老化過程延緩，甚至出現(xiàn)永生化現(xiàn)象 端粒的結(jié)合

6、或相關(guān)蛋白最重要的是人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子,，和等。 和均專一性地與端粒重復(fù)序列結(jié)合。 對(duì)端粒的長度起負(fù)調(diào)控作用，可以在一定程度上抑制端粒酶在端粒末端的行為； 則可以防止染色體末端相互融合，對(duì)維持端粒的正常結(jié)構(gòu)必不可少。 其他相關(guān)蛋白則可與它們形成復(fù)合體，共同行使調(diào)控端粒的長度和保護(hù)端粒末端結(jié)構(gòu)等功能作用。 端粒帽端粒帽 染色體染色體DNA DNA 端粒帽端粒帽n n（CCCCAACCCCAA） （TTGGGGTTGGGG）n nn n（GGGGTTGGGGTT） （AACCCCAACCCC）n n3 35 5 端粒酶是在染色體末端不斷合成端粒序列的端粒酶是在染色體末端不斷合成端粒序列的酶，它

7、可以維持端粒的長度。酶，它可以維持端粒的長度。它的活性不依賴于它的活性不依賴于DNA聚合酶，對(duì)聚合酶，對(duì)RNA酶、蛋白酶、蛋白酶和高溫均敏感。酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長度，抑制細(xì)胞的端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長度，抑制細(xì)胞的衰老，在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中可檢測(cè)到高水平的衰老，在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中可檢測(cè)到高水平的端粒酶活性。端粒酶活性。 端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) )端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERTTERT）端粒酶結(jié)合蛋白（端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNARNA是第一個(gè)被克隆的端粒酶是第一個(gè)被克隆的端粒酶組分。組分。端粒酶端粒酶RNARNA含有與同

8、源端粒含有與同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAGGG的互補(bǔ)序列的互補(bǔ)序列, ,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板區(qū)切割此模板區(qū), ,能使體外消除端粒酶能使體外消除端粒酶延長端粒的功能。延長端粒的功能。人類人類TERTTERT（hTERThTERT）基因?yàn)橐粏慰截惢蚧驗(yàn)橐粏慰截惢? ,定位于定位于5p15. 33 ,5p15. 33 ,具有具有7 7個(gè)保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元個(gè)保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元T T。破壞破壞TERT TERT 將消除端粒酶活性并致端粒縮短。將消除端粒酶活性并致端粒縮短。TEP1TEP1、生存動(dòng)力神經(jīng)細(xì)胞基因生存動(dòng)力

9、神經(jīng)細(xì)胞基因(SMN) (SMN) 產(chǎn)物產(chǎn)物、 hsp90hsp90 、 PinX1PinX1、 Est1p Est1p 和和Est3pEst3p 人類纖毛蟲類端粒酶對(duì)端粒的作用Telomerase activity is repressed in somatic cells of Telomerase activity is repressed in somatic cells of multicelluarmulticelluar organisms resulting in a gradual organisms resulting in a gradual shortening of

10、the chromosome with each cell shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reaches informational generation. As this shortening reaches informational DNA, the cells senesce and die.DNA, the cells senesce and die. 細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂 端粒閾值端粒閾值細(xì)胞停止分裂，走向死亡細(xì)胞停止分裂，走向死亡When telomerase ac

11、tivity is repressed 抗衰老端粒端粒酶對(duì)細(xì)胞死亡和細(xì)胞永生化的影響端粒端粒酶對(duì)細(xì)胞死亡和細(xì)胞永生化的影響 GryfeR等于1997年提出了關(guān)于細(xì)胞衰老和永生學(xué)說，認(rèn)為人的正常體細(xì)胞分裂次數(shù)達(dá)到界限時(shí)，染色體端粒長度縮短到一定程度，有絲分裂便不可逆地被阻斷在細(xì)胞周期的G1期和G2/M期之間的某個(gè)時(shí)期，這時(shí)的細(xì)胞便進(jìn)入了老化期，隨后死亡. 如果細(xì)胞被病毒感染，或p53、RB、p16INK4、ATM、APC等腫瘤抑制基因發(fā)生突變，或K ras等原癌基因被激活，或DNA錯(cuò)配修復(fù)基因(如hMSH2等)發(fā)生突變，或某些基因DNA序列發(fā)生了高度甲基化，或僅發(fā)生了低度甲基化，從而(在未發(fā)生核

12、甘酸突變的情況下)改變了該基因的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞便能越過阻斷點(diǎn)繼續(xù)進(jìn)行有絲分裂。隨著有絲分裂進(jìn)行，端粒長度不斷縮短，縮短到一定程度時(shí)，染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)畸變，大部分細(xì)胞便死亡，少部分細(xì)胞激活了端粒酶活性，不斷合成端粒DNA補(bǔ)充端粒的長度，端粒不再縮短，細(xì)胞便獲得無限分裂增生能力而成為永生化細(xì)胞。這說是端粒-端粒酶假說。 細(xì)胞的死亡過程分為兩個(gè)階段細(xì)胞的死亡過程分為兩個(gè)階段, , 當(dāng)端?？s短至一當(dāng)端?？s短至一關(guān)鍵性長度關(guān)鍵性長度2kb-4kb 2kb-4kb 時(shí)時(shí), ,染色體的穩(wěn)定性就會(huì)遭到破壞染色體的穩(wěn)定性就會(huì)遭到破壞, ,細(xì)胞開始衰老進(jìn)入細(xì)胞開始衰老進(jìn)入M M1期期（mortality stage

13、1 M M1）。在）。在M1期細(xì)胞對(duì)生長因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生期細(xì)胞對(duì)生長因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑合成蛋白抑制因子，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（制因子，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（cell cycle checkpoints）發(fā)發(fā)送周期停止信號(hào)，送周期停止信號(hào)，DNA合成停止，合成停止，DNA DNA 斷裂斷裂, ,導(dǎo)致細(xì)導(dǎo)致細(xì)胞胞G1G1期生長停滯期生長停滯, ,最終走向死亡最終走向死亡。 如果這一過程中一些癌基因如果這一過程中一些癌基因SV40T抗原、抗原、PRB ,p53 ,p16 PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活等抑癌基因失活, ,喪失正常功能喪失正常功能, , 均能均能使使M1期的機(jī)制被

14、抑制使細(xì)胞逃逸期的機(jī)制被抑制使細(xì)胞逃逸M1期，繼續(xù)生長獲得期，繼續(xù)生長獲得額外的增殖能力，此時(shí)端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮額外的增殖能力，此時(shí)端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過短，經(jīng)過20-30次分裂后，最終到達(dá)次分裂后，最終到達(dá)M2期期。細(xì)胞由于。細(xì)胞由于端粒過短端粒過短, ,基因不穩(wěn)定基因不穩(wěn)定, ,絕大多數(shù)細(xì)胞死亡絕大多數(shù)細(xì)胞死亡, ,只有極少數(shù)只有極少數(shù)細(xì)胞由于端粒酶活性的上調(diào)或重新激活細(xì)胞由于端粒酶活性的上調(diào)或重新激活, ,端粒的功能得端粒的功能得到恢復(fù)到恢復(fù), ,基因重獲穩(wěn)定基因重獲穩(wěn)定, ,使細(xì)胞超越使細(xì)胞超越M M2期期, ,成為永生化細(xì)成為永生化細(xì)胞。胞。 端粒酶被抑制端粒酶被

15、抑制 正常人體細(xì)胞正常人體細(xì)胞 端粒丟失端粒丟失 M1期阻滯期阻滯 SV40T抗原抗原 細(xì)胞分裂停止細(xì)胞分裂停止 Rb、P53與病毒蛋白結(jié)合、突變與病毒蛋白結(jié)合、突變 M1M2期間隔期間隔 永生化永生化 雙著絲粒形成雙著絲粒形成 M2期退化期退化 染色體失穩(wěn)染色體失穩(wěn) 端粒酶被激活端粒酶被激活 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 端粒酶在人體細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化端粒酶在人體細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化 端粒酶活化是腫瘤的顯著特征端粒酶活化是腫瘤的顯著特征 盡管有研究認(rèn)為端粒長度維持還可以借助于非端粒酶依盡管有研究認(rèn)為端粒長度維持還可以借助于非端粒酶依賴模式，即端粒替代延長（賴模式，即端粒替代延長（altematirealtemat

16、ire Lengthening of Lengthening of telomere ALTtelomere ALT）機(jī)制，但其存在上并不能否認(rèn)永生化細(xì)胞中機(jī)制，但其存在上并不能否認(rèn)永生化細(xì)胞中端粒酶的重要作用。端粒酶的重要作用。自從自從19941994年年KimKim等創(chuàng)立等創(chuàng)立TRAPTRAP法檢測(cè)端粒酶活性以來，越來越法檢測(cè)端粒酶活性以來，越來越多的文獻(xiàn)證明端粒酶活性在大多數(shù)人類原發(fā)性腫瘤標(biāo)本及腫多的文獻(xiàn)證明端粒酶活性在大多數(shù)人類原發(fā)性腫瘤標(biāo)本及腫瘤衍生細(xì)胞系中可被檢測(cè)到。美國學(xué)者在瘤衍生細(xì)胞系中可被檢測(cè)到。美國學(xué)者在400多例來源于多例來源于12 種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的

17、端粒酶陽性率高種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽性率高達(dá)達(dá)84.8，而腫瘤周圍組織或良性病變中陽性率僅為，而腫瘤周圍組織或良性病變中陽性率僅為4.4。 附表附表 人體組織中端粒酶活性人體組織中端粒酶活性 腫瘤部位/類型 與腫瘤鄰近正常組織/良性病變 腫瘤組織（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）結(jié)腸0/45（0）22/23（95.6%）肝1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）腎0/55（0）40/55（72.7%）神經(jīng)母細(xì)胞瘤 0/17（0）94/100

18、（94%）血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%）腦6/8（75%）其它（頭頂部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合計(jì) 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8) 近年來，針對(duì)端粒酶為作用靶點(diǎn)的抗腫瘤研究非常活躍，其研究目標(biāo)就是尋找各種有效的途徑來抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性，目前主要的途徑有以下幾種： 阻斷端粒酶的模板作用，包括： 1、反義、反義寡核苷酸、錘頭狀核酶和肽苷酸等； 2、針對(duì)端粒酶催化亞基的抑制劑：抑制劑、端粒酶蛋白抗體、調(diào)節(jié)劑等； 3、其他抑制劑。 端粒酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和端粒酶陽性的正常細(xì)胞的作用是不同的: 腫瘤細(xì)胞對(duì)

19、端粒酶抑制劑很敏感,作用一定時(shí)間后細(xì)胞出現(xiàn)生長抑制或凋亡; 生殖細(xì)胞在端粒酶抑制劑的作用下,端粒長度稍有縮短,然后繼續(xù)生長,端粒不再縮短。一、以粒酶酶一、以粒酶酶RNA為靶標(biāo)為靶標(biāo)通過阻斷端粒酶通過阻斷端粒酶RNA的模板作用對(duì)端粒酶活性的抑的模板作用對(duì)端粒酶活性的抑制制 1、反義寡核苷酸是端粒酶抑制劑研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn),它是與靶RNA 配對(duì)的一段短鏈DNA。按堿基配對(duì)原理與靶RNA 形成雜合體,被動(dòng)和主動(dòng)地抑制RNA 的逆轉(zhuǎn)錄。 2、核酶對(duì)端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸內(nèi)切酶活性的小分子RNA，通過催化中心的反義序列識(shí)別靶位。核酶有望成為廣譜，低毒，高效的抗癌新藥。 二、抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

20、活性二、抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性1、hTERT 突變突變 在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,hTERT 突變后端粒酶活性均明顯被抑制。2、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑( reverse transcriptase inhibitors ,RTI) 由于端粒酶是RNA 依賴的DNA聚合酶,所以RTI可以成為腫瘤治療藥物。其中對(duì)于齊多夫定的研究最多。3 3、靶向、靶向hTERThTERT mRNA mRNA的的ASODNASODN 針對(duì)hTERTmRNA 設(shè)計(jì)的ASODN 能選擇性地與靶基因雜交,阻斷靶基因的表達(dá)。三、三、G四聯(lián)體的穩(wěn)定四聯(lián)體的穩(wěn)定 端粒3端突出鏈富含鳥苷,在體外可形成四鏈DNA 結(jié)構(gòu),稱為G四

21、聯(lián)體。形成G四聯(lián)體后端粒酶活性受到抑制。因此,能穩(wěn)定G四聯(lián)體的藥物就可能是有效的端粒酶抑制劑。已發(fā)現(xiàn)很多此類化合物,這些藥物可以抑制端粒酶,但尚無縮短端粒的報(bào)道。四、小分子抑制劑四、小分子抑制劑 通過分子結(jié)構(gòu)模擬軟件進(jìn)行擬合分析，或通過其他高通量模式快速篩選端粒酶的小分子抑制劑是近年來發(fā)展較快的一個(gè)領(lǐng)域,此方法是基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)策略去搜尋先導(dǎo)化合物,用這一策略已發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)端粒酶抑制劑(例如FJ5002) ,但其作用機(jī)制尚不清楚。 Although much work has been done investigating cellular aging and telomere leng

22、th, the connection between telomere length and organismal longevity is not straightforward. Formulated by Harley, the telomere hypothesis of cellular aging postulated that telomeres serve as an internal mitotic clock in telomerase negative mammalian somatic cells and when telomere length is exhauste

23、d cellular senescence and the eventual death ensues. Multiple studies have found varying results in terms of telomere length and overall organismal longevity . Studies involving C. elegans,秀麗線蟲 a well-established model for molecular biology of aging, have demonstrated that overall telomere length do

24、es not affect or predict the organismal longevity . Danio rerio 鮐魚類shows high levels of telomerase activity throughout its lifespan and maintains telomere length even into late stages of life. No telomere shortening with increasing age is seen in wild-derived mouse 小鼠strains, as well as in the marin

25、e bird海鳥 Oceanodroma leucorhoa. 甲殼類的端粒始終保持不變，或許有更復(fù)雜的因素導(dǎo)致衰老和死亡 The crustacean甲殼類, Homarus americanus (lobster)龍蝦, was investigated to determine overall telomere length and telomerase activity during aging. These organisms display such extensive lifespans that some predict would be nearly immortal if

26、provided with optimal environment. Lobsters display telomerase activity throughout their lifespan with a relatively unchanged telomere length. Although cellular aging may be well defined by the telomere hypothesis of cellular aging, organismal aging is a multifactor process with a more complicated r

27、elationship between telomere length and organismal longevity 機(jī)體衰老是由于氧化損傷而非端粒長度 Organismal aging is a multifaceted process and the ability to respond to and survive the proteotoxic stress 氧化激化is an important factor in determining the longevity of an organism. There are several theories of aging; howe

28、ver, studies have shown that the pathologies and phenotypes associated with aging may stem from damaged proteins and the inability to repair or eliminate these damaged molecules from cells Although there are many different aspects of the aging process, it is possible that the ability to respond to p

29、roteotoxic stress is a better determinant of organismal life span instead of overall length of the telomeres. 應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的能力是與長壽命有關(guān)的 In other words, the cellular damage arising from being unable to respond appropriately to proteotoxic stress may lead to death before the telomere length declines. In addit

30、ion to heat stress, oxidative damage to proteins also causes proteotoxicity and in multiple organisms investigated, better ability to respond to oxidative stress is correlated with longer lifespans. In the marine crustacean, Acartia tonsa, oxidative damage was found to be greater in the shorter live

31、d male individuals of the species indicating that oxidative damage may play a role in the overall lifespan of this crustacean. 蜜蜂的卵黃蛋白原蛋白保護(hù)和端粒長度以外的因素導(dǎo)致了短壽命 A study done in honeybees identified vitellogenin as a protein that protects the organism from oxidative stress and contributes to longevity. Da

32、phnia contain a vitellogenin homolog that could be investigated for any differences in D. pulex vs D. pulicaria for its role in protection from oxidative damage. As Daphnia is emerging as a model system in aging studies our results reveal a non-concordance between telomerase activity, telomere length and the overall organismal aging and indicate that factors other than telomere length maintenance contribute to stri