如何做好Western-blot(免疫印跡)1

1、如何做好如何做好Western-blot（免疫印跡）（免疫印跡）-隨意談隨意談印記法印記法 印跡（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用探測物特異性檢測未知樣品的方法。 1975年，Southern將DNA轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素（NC）膜上，并利用DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段，后來稱這種方法為Southern印跡法。印記法Southern BlotNorthern BlotWestern BlotFar Western BlotDot BlotDNARNAProteinWestern-blot 高靈敏度、高特異性的蛋白檢測 應(yīng)用于絕大多數(shù)生物、醫(yī)學(xué)實驗室 成熟的技術(shù)、豐富的

2、方案選擇主要步驟主要步驟樣品制備電泳轉(zhuǎn)膜封閉結(jié)合抗體發(fā)光（顯色）信號檢測樣品制備樣品制備 細胞裂解 蛋白溶解（可一步完成） 蛋白定量細胞裂解細胞裂解 離子型去垢劑（SDS） 非離子型去垢劑（N-P40，TritonX-100） Tris、NaCl、疊氮化鈉、正釩酸鈉等 蛋白酶抑制劑 EDTA、PMSF、PI cocktail等 超聲 研磨 勻漿 反復(fù)凍融Laemmli Sample Buff.(161-0737 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 5% b-ME, 25%Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 變性蛋白變性蛋白N

3、ative Sample Buff.(161-0738 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 40% Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 非變性蛋非變性蛋白白35mm小盤：250ml 30mm中盤：500ml100mm大盤：1ml檢測磷酸化蛋白：再加入檢測磷酸化蛋白：再加入Na3VO4 0.1mM及及NaF 25mM 樣品制備樣品制備緩沖液緩沖液Tricine Sample Buff.(161-0739 30ml)200mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 40% Glycerol, 0.04% Coomassie blu

4、e 多肽多肽蛋白的定量 用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三種方法，其中A280法靈敏度為0.2-2 mg/ml，但核酸可引起強干擾作用；Lowry 法靈敏度為5-100 g/ml，雖相對準確，但干擾物質(zhì)多且反應(yīng)速度慢，而且含DTT溶液不宜用此法；Bradford法靈敏度為25-200 g /ml，由于相對干擾物質(zhì)較少，且反應(yīng)時間僅需2分鐘,故適合用于大多數(shù)研究的蛋白定量。 Bio-rad另有對一種適用于去垢劑增溶蛋白樣品的比色測定的試劑盒DC Protein Assay Kit，該方法類似于常規(guī)的Lowry方法，但經(jīng)過改良后，節(jié)省了操作時間。DC蛋白測

5、定只需要15分鐘的溫育時間，而且吸收值讀數(shù)保持2小時的穩(wěn)定。RC DC Protein Assay Kit蛋白測定是一種適用于含還原劑和去垢劑的蛋白測定，具有原來DC蛋白測定的特點，并能與更多的試劑兼容，簡化了復(fù)雜蛋白樣品溶液的定量測定。特殊的兼容物 - - Detergent Reducer &. Detergent樣品制備樣品制備定量定量 200800 nm Scanning mode Standard curves Kinetics Direct display PrinterSmartSpec plus SpectrophotometerProtein AssayRC DC P

6、rotein Assay Reducing agent compatible Detergent compatible電電 泳泳基質(zhì)及交聯(lián)劑基質(zhì)： 丙稀酰胺（Acrylamide）交聯(lián)劑： 基質(zhì)及交聯(lián)劑 T% C% 蛋白SDS-PAGE常用C：1：29，1：37.5 T%的線性分離范圍：%100)()()(mlgg溶液總體積交聯(lián)劑丙稀酰胺）交聯(lián)劑（丙稀酰胺（）交聯(lián)劑（100gggT線性分離范圍5572127.53694102080121260151043C=1:29非變性體系非變性體系1配方積層膠4 A/B, 0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 0. 1% AP, 0. 04%

7、TEMED分離膠T A/B, 0.625M Tris-HCl, pH 8.8, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 40% 甘油, 0.01% 溴酚藍電極緩沖液25 mM Tris, 192 mM甘氨酸, pH 8.3變性體系變性體系1配方積層膠4 A/B, 0.125M Tris-HCl pH 6.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分離膠T A/B, 0.625M Tris-HCl pH 8.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液62.5 m

8、M Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 25% 甘油,0.01% 溴酚藍電極緩沖液25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 0.1% SDS, pH 8.3適合小分子蛋白分離的適合小分子蛋白分離的Tris-Tricine 體系體系1配方積層膠4 A/B, 0.745M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分離膠10 A/B*, 1M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液200mM Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 40% 甘油, 0.0

9、4% 考馬斯亮藍G-250電極緩沖液100mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1% SDS*建議選用C%=2.6%*可將陽極緩沖液換成0.2M Tris, 0.1% SDS預(yù)混電泳緩沖液預(yù)混電泳緩沖液Premixed Electrophoresis Buffers161-0732 10 x Tris/Glycine/SDS, 1 L161-0772 10 x Tris/Glycine/SDS, 5 L cube161-0734 10 x Tris/Glycine, 1 L161-0771 10 x Tris/Glycine, 5 L cube161-0744 10 x Tri

10、s/Tricine/SDS, 1 LSDS-PAGE主要設(shè)備主要設(shè)備Precision Plus ProteinTM 蛋白標準品 條帶窄而清晰，分子量準確（經(jīng)質(zhì)譜驗證），可用于蛋白分子量測算； 未預(yù)染的條帶標記鏈親和素(Streptavidin)親和肽，可進行Western雜交檢測； 包括未預(yù)染(161-0363)，預(yù)染全藍(161-0373)，雙色(161-0374)和彩染(161-0375) 每種標準品含10個條帶，跨度從10KD250KD。未染標準品分子量測定Fig. 1. Approach for MW determination of an unknown protein. Lane

11、 1, 10 l of Precision Plus Protein unstained standards; lanes 27, a dilution series of an E. coli lysate containing a hypothetically unknown protein (GFP). Proteins were separated by Criterion 420% Tris-HCl gel and stained with Bio-Safe Coomassie stain. Precision Plus ProteinTM 預(yù)染標準品預(yù)染標準品r20.996轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 印

12、印印跡膜 硝酸纖維素硝酸纖維素(NC)膜：歷史悠久，蛋白結(jié)合力不強，膜：歷史悠久，蛋白結(jié)合力不強，載量較低載量較低Nitrocellulose:載量載量80-100mg/cm2，孔徑，孔徑0.2/0.45 mm 聚偏四氟乙烯聚偏四氟乙烯(PVDF)膜：蛋白結(jié)合力強，載量膜：蛋白結(jié)合力強，載量較大，使用廣泛較大，使用廣泛Immuno-BlotTM :載量載量150-160mg/cm2，適于反復(fù)洗脫?？讖剑m于反復(fù)洗脫。孔徑0.2mmSequi-BlotTM ：載量：載量170-200mg/cm2，蛋白結(jié)合更牢固，可用，蛋白結(jié)合更牢固，可用于蛋白測序或小分子轉(zhuǎn)印，孔徑于蛋白測序或小分子轉(zhuǎn)印，孔徑0

13、.2mm 尼龍尼龍(Nylon)膜膜: 帶正電荷，結(jié)合力最強，載量最帶正電荷，結(jié)合力最強，載量最大，尤其適于很小分子轉(zhuǎn)印和生物素顯色大，尤其適于很小分子轉(zhuǎn)印和生物素顯色 Zeta-Probe: 載量載量480mg/cm2，蛋白結(jié)合最牢固，封閉只需，蛋白結(jié)合最牢固，封閉只需5脫脂奶粉脫脂奶粉緩沖液 Towbin 緩沖液: 25mM Tris, 192mM 甘氨酸, 20% (v/v) 甲醇. Towbin緩沖液+SDS: 25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 20% (v/v)甲醇. CAPS緩沖液: 10mM CAPS, 10%甲醇. 乙酸緩沖液: 0.7%乙酸不同蛋白

14、須用不同緩沖體系和膜蛋白測序Towbin,CAPSNC,PVDF高分子蛋白Towbin-SDS,CAPSNC,pH!小分子蛋白或肽 Towbin,CAPSNC,PVDF堿性蛋白(pI9)在SDS-PAGECAPS,碳酸-Bjerrum S-NielsenNC,PVDF堿性蛋白(pI9)在native-PAGE0.7% HACNC,PVDF糖蛋白Towbin,CAPS-SDS/-,碳酸鹽, Bjerrum ,S-NielsenNC,PVDF槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（濕轉(zhuǎn)）槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（濕轉(zhuǎn)）1.Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽2. Criterion轉(zhuǎn)印儀3.Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽4.Trans-

15、Blot Plus轉(zhuǎn)印槽半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)1.Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)印槽微量過濾及篩選系統(tǒng)微量過濾及篩選系統(tǒng)1.Bio-Dot 和 Bio-Dot 微量過濾器2.Mini-Protean II多道篩選儀真空轉(zhuǎn)印系統(tǒng)真空轉(zhuǎn)印系統(tǒng)1.785 型真空轉(zhuǎn)印儀 (DNA & RNA 轉(zhuǎn)印至尼龍膜)轉(zhuǎn)印設(shè)備轉(zhuǎn)印設(shè)備電電 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 印印電轉(zhuǎn)印+- 電場強度決定轉(zhuǎn)印的效率電場強度決定轉(zhuǎn)印的效率 場強越高，轉(zhuǎn)印越快場強越高，轉(zhuǎn)印越快 電場強度又取決于電極間距離電場強度又取決于電極間距離 距離越短，場強越高距離越短，場強越高.半干轉(zhuǎn)印特有的不連續(xù)轉(zhuǎn)印半干轉(zhuǎn)印特有的不連續(xù)轉(zhuǎn)印 緩沖液被隔絕，允

16、許正、負極間緩沖液緩沖液被隔絕，允許正、負極間緩沖液不同不同 陰極陰極(膠面膠面)緩沖液含緩沖液含0.1%SDS，不含甲，不含甲醇，利于轉(zhuǎn)印醇，利于轉(zhuǎn)印 陽極陽極(膜面膜面)緩沖液不含緩沖液不含SDS，含，含20甲甲醇，防止轉(zhuǎn)過醇，防止轉(zhuǎn)過 配合配合PVDF膜可提高轉(zhuǎn)膜效率，減少損失膜可提高轉(zhuǎn)膜效率，減少損失*5儲液：36.34 g Tris, 44.26 g CAPS, 加水至 1 L一個新型不連續(xù)轉(zhuǎn)膜體系 緩沖液： 1.5mA/cm2 (電壓不超過25V)，轉(zhuǎn)印30-60min陰極緩沖液陽極緩沖液5Tris-CAPS儲液*20ml20ml10% SDS1ml-Methanol-15mlH2

17、O79ml65ml巧妙的改進，出色的結(jié)果 左：10%SDS PAGE后用前述不連續(xù)緩沖體系半干轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印后印跡膜用考馬斯藍R250染色；中：轉(zhuǎn)膜后凝膠考染；右：Western Blot檢測該印跡膜上p47蛋白。泳道1、2分別為Kaleidoscope 蛋白標準品和細胞全蛋白 1 2 1 2 216kD132kD特殊轉(zhuǎn)印要求下儀器和試劑的選擇應(yīng)用應(yīng)用轉(zhuǎn)印緩沖液轉(zhuǎn)印緩沖液印跡膜印跡膜推薦儀器推薦儀器蛋白測序CAPSPVDF/NC槽式轉(zhuǎn)印大分子蛋白Towbin with SDS, 不連續(xù)體系PVDF/NC槽式轉(zhuǎn)印小分子蛋白或多肽Towbin，CAPSPVDF槽式轉(zhuǎn)印堿性(pI9), 變性膠CAPSN

18、C/PVDF槽式/半干轉(zhuǎn)印堿性(pI9), 非變性膠0.7% 乙酸NC/PVDF槽式轉(zhuǎn)印糖蛋白Towbin(with SDS), CAPSNC/PVDF槽式/半干轉(zhuǎn)印蛋白多糖TowbinNC/PVDF槽式/半干轉(zhuǎn)印兩種轉(zhuǎn)印系統(tǒng)的比較半干轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)每塊每塊mini膠所膠所需緩沖液的量需緩沖液的量20ml500700ml所需時間所需時間30分鐘分鐘(大分子量蛋大分子量蛋白應(yīng)適當(dāng)延長白應(yīng)適當(dāng)延長)3060分鐘分鐘(很大分子很大分子量蛋白適當(dāng)延長量蛋白適當(dāng)延長)冰浴冰浴不需要不需要需要需要適用范圍適用范圍150KD無限制無限制電壓,電流,功率 設(shè)置恒電壓時,電阻下降,電流加大,會產(chǎn)高熱,須降溫(

19、半干除外) 設(shè)置恒電流時,電壓和功率隨電阻下降而下降,產(chǎn)熱也會降低,以后隨場強下降,轉(zhuǎn)印速度也會下降. 設(shè)置恒功率時,電流隨電阻下降而升高,升高的速度較恒電壓時低,所以設(shè)置恒功率近似恒電流Semi-dry blot Transfer mini gels for 1530 minutes at 1015 V. Large gels can be transferred for 30 minutes to 1 hour at 1525 V. Do not exceed 25 V with this instrument. A current limit (3 mA/cm2 for large ge

20、ls; 5.5 mA/cm2 for mini gels) is recommended to prevent excessive heating during the run.濕轉(zhuǎn)用Bio-Dot 或 Bio-Dot SF進行斑點或狹縫印跡 直接真空抽濾上樣至印跡膜 方便快速，可高溫消毒，適于高通量篩選轉(zhuǎn)膜后檢測 麗春紅麗春紅S S染色染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。 印度墨汁染色印度墨汁染色只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探針的Western印跡過程。 注：染色法不適合蛋白結(jié)合力較強的注：染色法不適合蛋白結(jié)合力較強的PVDF膜和尼龍膜膜和尼龍膜封閉 目

21、的：封閉膜上多余的蛋白結(jié)合位點，減目的：封閉膜上多余的蛋白結(jié)合位點，減少非特異性反應(yīng)少非特異性反應(yīng) 封閉液封閉液脫脂奶粉或脫脂奶粉或BSA (5) 溶于溶于TBST (100mmol/L Tris-Cl, 9g/L NaCl, 5g/L Tween 20)溶液中溶液中 封閉時間：封閉時間：37一小時，一小時，4過夜過夜常用封閉液試劑膜濃度備注明膠NC1-3%明膠加熱溶解脫脂奶,BLOTTONC,PVDF0.5-5%PVDF所需濃度要高BSANC,PVDF1-5%PVDF所需濃度要高TWEEN20NC0.05-0.3%可能有雜帶一抗、二抗孵育 根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉液配制的

22、一抗液與濾膜溫育。37一小時，4 過夜 倒掉一抗溶液，用TBST液濾膜3次，每次5min 加入用封閉液配制的二抗溶液，37一小時，4過夜 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3-5次，每次10min。印跡膜檢測全蛋白檢測負離子染色 主要有考馬斯亮藍主要有考馬斯亮藍-R250和氨基黑和氨基黑 優(yōu)點：廉價、快速，缺點：靈敏度優(yōu)點：廉價、快速，缺點：靈敏度低，膜易變形低，膜易變形 氨基黑染色背景較低，脫色容易，氨基黑染色背景較低，脫色容易，優(yōu)于考馬斯藍優(yōu)于考馬斯藍 常用的有Sypro Ruby等 靈敏度高(2-8ng)，線性范圍寬，超過1000倍 可用于蛋白測序等 價格相對昂貴，需要UV成像儀或激光掃描儀全蛋白檢測熒光染色化學(xué)發(fā)光底物被HRP或AP分解后發(fā)光，被X光片或成像系統(tǒng)