液相色譜定量方法指導原則.

1、液相色譜定性定量方法液相色譜定性定量方法1 有關色譜峰的基本概念（一）有關色譜峰的基本概念（一） 峰底峰底(CD):峰的起點與終點之間連接的直線 峰高峰高(h):峰最大值到峰底的距離 峰寬峰寬(KL):在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離 半高峰寬半高峰寬(W1/2):通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側相交兩點之間的距離 峰面積（峰面積（A）:峰與峰底之間的面積,又稱響應值 拖尾峰（拖尾峰（Tailing peak）:后沿較前沿平緩的不對稱峰 前伸峰（前伸峰（Leading peak）:前沿較后沿平緩的不對稱峰 基線（基線（Baseline):在正常操作條件下，僅由流動相所

2、產(chǎn)生的響應信號的曲線 基線噪聲（基線噪聲（N）:由各種因素所引起的基線波動 基線漂移基線漂移(Baseline drift):基線隨時間定向的緩慢變化1 有關色譜峰的基本概念（二）有關色譜峰的基本概念（二）2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)（一通過測量和計算得到的色譜參數(shù)（一） 死時間死時間(dead time，t0)不保留組分的保留時間，即流動相（溶劑）通 過色譜柱的時間。 死體積死體積(dead volume，V0)由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定 相所占據(jù)的空間。V0Ft0（F為流速） 保留時間保留時間(retention time，tR)從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間

3、。 保留體積保留體積(retention volume，VR)從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積，又稱洗脫體積。VRFtR。 調(diào)整保留時間調(diào)整保留時間(adjusted retention time，tR)扣除死時間后的保留時間。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，tR只決定于組分的性質(zhì)，因此tR（或tR）可用于定性。tRtRt0 調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，VR)扣除死體積后的保留體積VRVRV0或VRFtR2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(二）二） 柱效能柱效能：色譜柱在分離過程中主要有動力學

4、參數(shù)決定的分離效能。通常用理論板數(shù)或有效板數(shù)表示。 理論板數(shù)： 若應用調(diào)整保留時間 tR計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)( n有效或 neff ) 有效板數(shù)：2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(三）三） 分離度：分離度：兩個相鄰色譜峰的分離程度，以兩個組分保留值之差與其平均峰寬之比表示。 分離度圖示分離度圖示 響應值：響應值：組分通過檢測器系統(tǒng)產(chǎn)生的信號值。 相對響應值：相對響應值：單位量物質(zhì)與單位量參比物質(zhì)的響應值之比。2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(四）四） 校正因子（校正因子（f）：）：相對響應值的倒數(shù)，它與峰面積的乘積正比

5、于物質(zhì)的量。 定量限（定量限（LOQ）：）：是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度和精密度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(五）五） 檢測限（檢測限（LODLOD）：）：系指試樣中的被測物能被檢查的最低量，是鑒別試驗的靈敏度指標。其越低，反應的靈敏度越高。3 液相色譜的定性分析液相色譜的定性分析 1、與已知物直接對照 2、已知物峰高增加法 3、二極管陣列檢測器的三維圖譜定性 4、與其他儀器聯(lián)用定性4 色譜法定量的依據(jù)色譜法定量的依據(jù) 在一定的操作條件下，檢測器的響應信號（色譜峰的峰面積或峰

6、高）與進入檢測器組分的量成正比。 即即：mi = fi Ai 或或 mi = fi hi式中：mi組分的量 fi比例常數(shù)這就是色譜法定量的依據(jù)。5 峰面積峰面積 A 的測量方法（一）的測量方法（一）（1）峰高）峰高 h 乘半峰寬乘半峰寬 w1/2 法法 將色譜峰視為等腰三角形，得到的面積為實際面積的0.94倍，故實際面積應為：（適合于對稱峰） A 1.065 h w1/2（相對計算可略去前面系數(shù)）（2）峰高乘平均峰寬法）峰高乘平均峰寬法 不對稱峰不能作前述近似，可于峰高0.15及0.85處測得峰寬，取其平均值進行計算： A = h (w0.15+w0.85)/25 峰面積峰面積 A 的測量方法

7、（的測量方法（二）二）（3）峰高乘保留時間法）峰高乘保留時間法 難以量度半峰寬的狹窄峰或半峰寬以上重疊的峰可用下式計算： A 1.065h b tR （相對計算可略去1.065和常數(shù)b）（4）剪紙稱重法）剪紙稱重法 對于不對稱或分離不完全的峰，可將峰剪下，以質(zhì)量代其面積，使用較少。（5）自動積分法）自動積分法 將記錄儀與自動積分儀連接，可直接準確、快速地測出峰的面積。（6）以峰高代替峰面積定量法）以峰高代替峰面積定量法 當各種實驗條件嚴格保持不變時，一定進樣范圍內(nèi)色譜峰的半峰寬不變，即可用峰高代替峰面積定量，特別對于狹窄的峰，較面積定量法更為準確。5 峰面積峰面積 A 的測量方法（的測量方法（

8、三）三）6 定量校正因子（一）定量校正因子（一） 檢測器對不同物質(zhì)的響應值不同，故相同質(zhì)量的不同物質(zhì)通過檢測器時，產(chǎn)生的峰面積不等，因而不能直接應用峰面積計算組分含量。 為此引入“定量校正因子”以校正峰面積，使之能更真實地反映組分含量。 前面已知：mi fi Ai 即：fi mi / Ai6 定量校正因子（二）定量校正因子（二） fi 稱絕對校正因子，定量分析中常用的是相對校正因稱絕對校正因子，定量分析中常用的是相對校正因子子f i，定義為組分的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕，定義為組分的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕對校正因子之比：對校正因子之比： v mi、ms用質(zhì)量單位時，用質(zhì)量單位時，f w稱

9、相對質(zhì)量校正因子稱相對質(zhì)量校正因子v mi、ms用摩爾為單位時，用摩爾為單位時，f M稱相對摩爾校正因子稱相對摩爾校正因子v 注意：應用中一般地略去注意：應用中一般地略去“相對相對”兩字兩字isiisssiisiSmAmAAmAmfff1/6 質(zhì)量校正因子的測定方法（三）質(zhì)量校正因子的測定方法（三） 準確稱取一定量待測組分的純物質(zhì)和標準物質(zhì)的純物質(zhì)混和后，取一定量（在檢測器的線性范圍內(nèi)）在實驗條件下注入色譜儀，出峰后分別測出兩者峰面積，由前式可求得校正因子。isiisssiisiSmAmAAmAmfff1/7 常用的幾種定量測定方法（一）常用的幾種定量測定方法（一）（1）歸一法 當試樣中的全部

10、組分都出峰（即都反映在色譜圖上）時，可以從校正后每峰峰面積占全部色譜峰總面積的分數(shù)，求得該組分的質(zhì)量分數(shù)。niiiiiAfAf1x i% = 100 （可以為質(zhì)量百分含量或摩爾百分含量）7 常用的幾種定量測定方法（二）常用的幾種定量測定方法（二） 歸一法的特殊情況 若試樣中各組分的相對校正因子很接近（如同系物中沸點接近的組分），上式則可簡化為：niiiAA1x i % = 100 當測量參數(shù)為峰高時，也可以用峰高歸一法計算組分含量。（用峰高校正因子，以峰高代峰面積代入前頁算式即可，）歸一法具有簡便、準確的特點歸一法具有簡便、準確的特點不足之處在于僅可使用于所有組分都出峰的情況不足之處在于僅可使

11、用于所有組分都出峰的情況7 常用的幾種定量測定方法（三）常用的幾種定量測定方法（三） （2）內(nèi)標法使用條件：試樣中各組分不能全部出峰、各組分含量懸殊、僅需測定其中部分組分 操作步驟：a. 準確稱取一定量的試樣；b. 加入一定量的選定標準物（內(nèi)標物）；c. 混勻后進樣，進行色譜分析；d. 根據(jù)內(nèi)標物和試樣質(zhì)量以及色譜圖上相應的峰面積，計算待測組分的量。7 常用的幾種定量測定方法（四）常用的幾種定量測定方法（四）內(nèi)標法待測組分含量計算式如下（由前可推得）:（各符號意義同上） 內(nèi)標法中常以內(nèi)標物為基準，即：f s 1 ，也可用峰高代替峰面積，做法同上。%100樣品mAfAfmxssiisi內(nèi)標法注意

12、事項a.內(nèi)標物應是試樣中不存在的純物質(zhì)；b.加入的內(nèi)標物量與試樣中待測組分量相近；c.內(nèi)標物的色譜峰應位于待測組分色譜峰附近或幾個待測組分色譜峰之間。7 常用的幾種定量測定方法（五）常用的幾種定量測定方法（五）內(nèi)標法優(yōu)缺點 優(yōu)點：定量準確，對試樣含有不出峰的組分情況下，也不影響測定。 缺點：每次測定都必須準確稱取樣品和內(nèi)標物質(zhì)量，不適于快速分析。7 常用的幾種定量測定方法（六）常用的幾種定量測定方法（六）內(nèi)標曲線法 若以 Ci % 對 Ai / As作圖，則可得一條通過原點的直線內(nèi)標標準曲線。sf樣品mfmis為一常數(shù)，上式則可化為：常數(shù)siAAx i % =用內(nèi)標法待測組分含量計算式 若固定

13、試樣稱取量，加入內(nèi)標物也恒定，則有：7 常用的幾種定量測定方法（七）常用的幾種定量測定方法（七）%100樣品mAfAfmxssiisi內(nèi)標標準曲線的繪制內(nèi)標標準曲線的繪制a. 將待測組分的純物質(zhì)配成不同濃度的標準溶液（系列）；b. 取固定量的標準溶液和內(nèi)標物，混合后進樣分析，測出 Ai 和 As；c. 用 Ai / As 對標準溶液濃度作圖，可得一組通過原點的直線（內(nèi)標標準曲線）。7 常用的幾種定量測定方法（八）常用的幾種定量測定方法（八） 樣品測定與組分定量樣品測定與組分定量a. 稱取與繪制標準曲線相同量的試樣和內(nèi)標物，測出其峰面積比，由標準曲線即可查出待測組分的含量。b. 內(nèi)標標準曲線法應

14、用在生產(chǎn)過程控制分析上，不須計算校正因子，對液體樣品也可量取體積，具有簡便快速的特點。7 常用的幾種定量測定方法（九）常用的幾種定量測定方法（九）（3）外標標準曲線法a. 取被測組分的純物質(zhì)，配制成一系列不同濃度的標準溶液；b. 分別取一定體積上述溶液注入色譜柱；c. 得到色譜圖后測出峰面積或峰高；d. 繪出峰面積（或峰高）對濃度的關系曲線（標準曲線）。標準曲線的繪制7 常用的幾種定量測定方法（十）常用的幾種定量測定方法（十）外標法 樣品測定（一）a.在同樣操作條件下注入同樣量（一般為體積）的待測試樣，從色譜柱上測得峰面積或峰高，在標準曲線上即可查出待測組分的濃度。b. 外標法也用于生產(chǎn)過程的

15、控制分析，操作簡便，計算簡單，但分析結果準確性取決于操作條件的穩(wěn)定性和進樣的重現(xiàn)性。7 常用的幾種定量測定方法（十一）常用的幾種定量測定方法（十一）外標法 樣品測定（二）c.當試樣中待測組分濃度變化不大時，可不必作標準曲線，而用單點校正法。即配制一個與被測組分含量接近的標準樣，分別取相同量體積進樣，測定標準樣和待測樣的峰面積，按下式計算組分含量: Ci% = Ai/As Cs%7 常用的幾種定量測定方法（十二）常用的幾種定量測定方法（十二）（4）標準加入法（一） 標準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標法，以欲測組分的純物質(zhì)加入到待測樣品中，分別測定加入前后的峰面積，從而計算欲測組分在樣品中的含量。

16、a. 可以單點加入，色譜條件完全相同的情況下，按以下公式計算：7 常用的幾種定量測定方法（十三）常用的幾種定量測定方法（十三）)()(iiiiihAhAXXX標準加入法（二） b.可以加入一系列濃度，按標準曲線外推法計算出欲測物在樣品中的含量。 優(yōu)點：不需要另外的內(nèi)標物，不必要進樣非常準確；操作簡單；若在前處理過程加入，可補償被測組分在處理過程中的損失。 缺點：色譜條件要求完全一致，否則會帶來分析誤差。7 常用的幾種定量測定方法（十四）常用的幾種定量測定方法（十四） 7 常用的幾種定量測定方法（十五）常用的幾種定量測定方法（十五） 標準加入法（三）標準加入法標準曲線繪制 將一系列已知量待測物分

17、別加入到幾等份的樣品中，配制成濃度為(cx+0), (cx+c1), (cx+c2), (cx+c3). 和樣品有相同基體的標準系列溶液(加標，spiking)； 通過儀器分別測量以上系列溶液的響應值S0，S1，S2，S3，S4； 以響應信號S對濃度c作圖，再將直線外推與濃度軸相交于一點(下圖)，求得樣品中待測物濃度cx。cx0.00.20.0102030-10濃度，濃度，cSS2S3S4S10.40.60.81.01.2 當樣品量很少時，可在一份樣品中加標，加一次作一次測量，可得到上述當樣品量很少時，可在一份樣品中加標，加一次作一次測量，可得到上述 方法相同的結果；方法相同的結果； 當覺得上述過程麻煩時，可只加標一次，分別測量樣品和加標樣品的儀器當覺得上述過程麻煩時，可只加標一次，分別測量樣品和加標樣品的儀器 響應，再直接通過公式進行計算。響應，再直接通過公式進行計算。 優(yōu)點優(yōu)點：基體：基體(matrix)相近，或者說基體干擾相同；相近，或者說基體干擾相同； 缺點缺點：麻煩，適于小數(shù)量的樣品分析。：麻煩，適于小數(shù)量的樣品分析。8 影響定量準確度的因素影響定量準確度的因素 1、樣品制備 -衍生化成可氣化的或有紫外吸收或帶熒光的，轉(zhuǎn)化率要高 -溶劑