高效液相色譜柱的保護(hù)

1、高效液相色譜柱的保護(hù)1、最好用預(yù)柱。（但要注意，若有時(shí)出峰異常，要先看看是不是它有問題了）2、每次做完分析，都要進(jìn)行沖洗，分析用流動(dòng)相中若無酸、堿、鹽類物質(zhì)，建議用90甲醇沖洗3060min；若分析用流動(dòng)相中含以上物質(zhì)，要先用10甲醇（或用與分析用流動(dòng)相同比例，把含酸、堿、鹽溶液換成水）沖洗1小時(shí)左右，再梯度走到90甲醇沖洗3060min（若用多元泵）。有必要時(shí)再循環(huán)幾次，可以適當(dāng)縮短時(shí)間。若長時(shí)間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲醇或乙腈封存。3、若流動(dòng)相中用到離子對試劑，更應(yīng)該好好沖洗，且該色譜柱最好作為專用，不能再做其它物質(zhì)分析用。因色譜柱填料性質(zhì)已與原來所不同，在該柱上所摸索的色譜條件，

2、可能在其它同類柱子上得不到重現(xiàn)。4、盡量避免反沖，除非該色譜柱廠家明確說明允許。5、普通C18柱盡量避免在40以上的溫度下分析。6、定期測柱效，有下降，可以用10異丙醇甲醇沖洗色譜柱。若柱效還沒有改善，可以再生，甲醇二氯甲烷甲醇。呵呵，還有的一時(shí)想不起來了，各位有經(jīng)驗(yàn)的戰(zhàn)友請發(fā)表高見！ 1樣品要采用0.22或0.45m濾膜過濾，流動(dòng)相采用0.45m濾膜過濾并脫氣。 2大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是27.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍3避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化。4. 避免純水沖洗反相色譜柱。5每次測試完畢，要用20倍柱體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱（分析色譜柱250×4.6mm柱體積

3、3.2ml）。如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢后將柱子用純水沖洗干凈，并保存于乙腈中。 6壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號。 helen_gu wrote:1樣品要采用0.22或0.45m濾膜過濾，流動(dòng)相采用0.45m濾膜過濾并脫氣。 2大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是27.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍3避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化。4. 避免純水沖洗反相色譜柱。5每次測試完畢，要用20倍柱體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱（分析色譜柱250×4.6mm柱體積3.2ml）。如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢后將柱子用純水沖洗干凈，并保存于乙腈中。 6壓力升

4、高是需要更換預(yù)柱的信號。避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化。是不是流動(dòng)相組成改變時(shí)要有個(gè)梯度,緩慢升或緩慢降?那要多慢呢,比如說我用水和乙腈做流動(dòng)相,想從20:80升至100:0,設(shè)定多長時(shí)間比較合適呢另外,純水沖反相柱的缺點(diǎn)是什么呀?請多指教,謝謝了 說說防止色譜柱堵塞的問題吧：1：溶劑中的不溶物應(yīng)使用色譜純?nèi)軇み^濾（孔徑不超過0.45m）2：樣品中的不溶物應(yīng)對樣品進(jìn)行膜過濾（孔徑不超過0.45m）3：泵，進(jìn)樣器等中的不溶物在泵和進(jìn)樣器之間安裝內(nèi)置過濾器，在進(jìn)樣器和柱之間安裝預(yù)過濾器4：柱內(nèi)不溶物的形成：由于溶劑的不互溶而產(chǎn)生的沉淀用能溶解沉淀物的溶劑沖洗色譜柱；在不互溶溶劑中由于進(jìn)樣而產(chǎn)生

5、的沉淀檢查樣品液和流動(dòng)相是否互溶；由于溫度的改變或固定相的干涸而產(chǎn)生的沉淀將色譜柱密封緊，并保持室溫恒定！還有就是平衡色譜柱、色譜柱的再生：1 平衡色譜柱：反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。請一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運(yùn)輸過程中可能會干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用1020倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"。硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡如何平衡色譜柱？ 平衡過程中，將流速緩慢

6、地提高；用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑濃度如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）2 色譜柱的再生：進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)謙價(jià)的泵，最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱！ 偶也來參與一下，談一點(diǎn)拙見1.對于一些特殊型號的柱子，例如不同型號的手性柱應(yīng)嚴(yán)格按照柱子的相應(yīng)說明書所要求的進(jìn)行維護(hù)，并按照其規(guī)定的范圍選擇試劑的種類，比例，PH ，等等；2.盡量避免柱子進(jìn)氣泡的現(xiàn)象出現(xiàn)，如在實(shí)驗(yàn) 過程中留心流動(dòng)相的體積，同時(shí)對所需體積進(jìn)行大概的估計(jì)，以免吸空，氣泡進(jìn)柱，盡管有多種排氣泡的方法，但畢竟影響柱子的性能，尤其是比較“嬌貴”的柱子

7、； 每天用足夠的時(shí)間來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長！- 一定得做！ 新的色譜柱在使用之前應(yīng)該在您自己的液相色譜儀上進(jìn)行性能測試，即使用色譜柱附帶的檢驗(yàn)報(bào)告上測試條件和樣品來測定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應(yīng)時(shí)常對色譜柱進(jìn)行測試。 卡套柱的安裝（不加預(yù)柱） 1將卡套架套入柱芯2將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夾套（見左圖）3將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片4將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊5然后依同樣的順序連接好柱子的另一端6連接到液相色譜儀，PEEK接頭手?jǐn)Q即可；若為不銹鋼接頭應(yīng)使用專

8、用扳手注意：使用卡套柱時(shí)，兩端的卡套應(yīng)時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時(shí)候都不能將卡套取下來，否則會造成填料的流失。 卡套柱的安裝（加預(yù)柱）1將卡套架套入柱芯2將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯（見左圖）3將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片4將"子彈頭"預(yù)柱放入卡套片內(nèi)5將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊6然后依同樣的順序連接好柱子的另一端7連接到液相色譜儀，PEEK接頭手?jǐn)Q即可；若為不銹鋼接頭應(yīng)使用專用扳手 更換色譜柱濾網(wǎng)和玻璃棉過濾片（同時(shí)可以修補(bǔ)色譜柱）注意：在取出反相柱芯的濾網(wǎng)和玻璃片之前，應(yīng)該將色譜柱充分用水和甲醇/乙腈沖洗

9、，而且修補(bǔ)工具的頭部也應(yīng)該蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出濾網(wǎng)和玻璃棉濾片時(shí)帶出柱子內(nèi)的填料。 1將修補(bǔ)工具中的2套入柱芯的頂端2將修補(bǔ)工具中的3輕輕地旋入已套著2的柱芯中，并順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)到旋緊3一手握柱芯，另一只手輕輕地向外拉3，取出柱芯頂端的濾網(wǎng)4用一個(gè)小鏟子輕輕地取出濾網(wǎng)下面的玻璃棉以及被污染的填料5將新的填料用甲醇潤濕，然后填入挖去的部位，壓平6照（左圖）裝上新的玻璃棉濾網(wǎng)，并用修補(bǔ)工具中的4將玻璃棉壓入柱芯頂端7柱芯頂端套上2，然后參照（左圖）將濾網(wǎng)放入8壓緊，然后取下2，再用4將濾網(wǎng)的邊緣壓平 平衡色譜柱 反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。請一定確保您所使用的流動(dòng)

10、相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運(yùn)輸過程中可能會干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用1020倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"。硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡如何平衡色譜柱？ 平衡過程中，將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）色譜柱的再生 進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)謙價(jià)的泵，我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。 表1建議用來沖洗的溶劑體積色譜柱

11、尺寸 柱體積 所用溶劑的體積 125-4 1.6ml 30ml250-4 3.2ml 60ml 250-10 -20ml 400ml 請根據(jù)下表選擇您的再生方法：極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生：正庚烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水*非極性固定相（如反相色譜填料RP18，RP8，CN等）的再生：水乙腈氯仿（或異丙醇）乙腈水0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱注意：在對NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。 *如果簡單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.

12、05M稀硫酸沖洗非常有效。色譜柱的維護(hù) 1使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）2大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是27.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍3避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化4流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理5如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存大乙腈中6壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號 對于高效液相色譜柱的保護(hù)我也來談?wù)劙伞?.首先，溶劑、樣品要前處理，溶劑要用色譜級別的并用0.45um的濾膜過濾并脫氣，樣品要用0.22um的濾膜過濾。2.做樣前，柱子要平衡一段時(shí)間，先用甲醇平衡30-60分鐘，再用純化水平衡30-60分

13、鐘，然后用流動(dòng)相平衡，直到基線走平時(shí)，再進(jìn)樣。3.做樣結(jié)束后，柱子要用甲醇和水沖洗，沖洗順序與2步相反，最后柱子用甲醇（95%）保存。4.如果柱子里東西太多，可以用甲醇，乙腈，水反復(fù)沖洗。 談?wù)勱P(guān)于啟用新柱子(C18)的注意事項(xiàng):1、首先應(yīng)檢查一下，看是否為原裝產(chǎn)品和外觀完好情況。2、保存好供應(yīng)商隨柱提供的“關(guān)于柱性能測試報(bào)告”，其中包含了新柱子的最佳性能指標(biāo)，如在某預(yù)定色譜條件下的柱壓、柱效等。3、重現(xiàn)流動(dòng)相條件，主要觀察柱壓的變化（100%甲醇、100%乙腈、50%甲醇-50%水等），并將數(shù)據(jù)記錄在“性能報(bào)告上”，以便今后對照。4、啟用新柱子時(shí)的流動(dòng)相流速應(yīng)慢一點(diǎn)，如0.3-0.5ml/m

14、in，經(jīng)過10-15min后可以加快。5、對于25cm柱子，流速一般不超過1.0ml/min，能用慢速流量時(shí)盡量使用慢一點(diǎn)，當(dāng)然要考慮分離效果和分析時(shí)間。 加預(yù)柱嘍！ 以上大家都說了很多柱子保護(hù)方面的內(nèi)容,已經(jīng)很全了,但我想補(bǔ)充一個(gè)方面:用離子對色譜法時(shí)柱子使用的一個(gè)問題.我們知道,一般我們分析樣品時(shí),常采用有機(jī)相(甲醇,乙腈)-水體系作為流動(dòng)相,對于大部分的分析工作,這個(gè)體系就能勝任了,但是,當(dāng)我們遇到弱酸堿時(shí),比如生物堿,容易拖尾，這時(shí)候我們可以采用離子對色譜法進(jìn)行分離,常用的離子對試劑有庚烷磺酸肭和十二烷基磺酸鈉,這時(shí)候,我們常采用pH3-5的緩沖鹽體系,我們在 采用離子對色譜進(jìn)行分離時(shí)

15、,該怎么保護(hù)色譜柱呢?一個(gè)很重要的問題是,當(dāng)我們沖柱子的時(shí)候,應(yīng)該先采用有機(jī)相-水體系沖,再用水沖,然后用有機(jī)相沖，比如我們的流動(dòng)想是甲醇-0.5%的庚烷磺酸鈉(pH3.3)(50:50),我們在沖柱子的時(shí)候,應(yīng)該先用50%的甲醇水沖柱子,然后用水沖,然后用甲醇沖,這是為什么呢?我們知道,通常的洗衣粉的主要有效成分是十二烷基硫酸鈉(表面活性劑),它可以把一些脂肪油洗下來(烷烴及其衍生物),庚烷磺酸納也是表面活性劑,如果先用水沖洗,會產(chǎn)生用洗衣粉洗衣服時(shí)的效果(ODS的固定相是長鏈烷烴),會造成固定相的損失,如果我們采用有機(jī)相-水體系先沖柱子,由于表面活性劑在有機(jī)相中有一定的溶解度,并且流動(dòng)相的

16、量比較大(相對于固定相,因?yàn)榱鲃?dòng)相是在不停的流動(dòng)嘛)會使表面活性劑逐漸溶解在流動(dòng)相中而被沖出,當(dāng)表面活性劑被沖干凈之侯,我們就可以采用水沖,然后采用有機(jī)相保存柱子了. 我也說說色譜柱的保護(hù)首先要看清楚說明書，是屬于何種色譜柱，樓上各位所說都是集中在反相柱上，而正相色譜柱的保護(hù)和處理則有很大不同其次，色譜柱優(yōu)良好壞的指標(biāo)有柱效、柱壓等如果在實(shí)驗(yàn)的某一天突然發(fā)現(xiàn)柱壓升高，或者峰形脫尾等現(xiàn)象，則有必要對色譜柱進(jìn)行處理。處理方法，反相柱樓上的已經(jīng)說了很多第三，色譜柱在進(jìn)樣時(shí)一定要過濾，最好加上預(yù)柱再附上一篇英文的色譜柱保護(hù)方法colcare.pdf (100.25k) 我們的液相，既沒有在線流動(dòng)相過濾

17、器，也沒有預(yù)柱，（可能是經(jīng)濟(jì)原因不給配），所以，做樣都要萬分小心，但是，柱壓還是會莫名其妙的升高。從最初的100%甲醇600psi慢慢到最后1800psi，這個(gè)時(shí)候可能就是柱子堵了，但是出峰時(shí)間和柱效（踏板數(shù)）幾乎沒有什么變化。一般情況我們的處理辦法是，將柱子用甲醇飽和后，將柱子豎直放置，進(jìn)口端的方向豎直向上，用兩個(gè)扳手慢慢將柱子的入口端螺絲擰下，這時(shí)，會看到白白的硅膠，有時(shí)候會看見一個(gè)薄薄的篩板，將擰下的螺絲和篩板進(jìn)行超聲清洗，螺絲只需用100%甲醇或者100%乙醇和水超聲即可，篩板需要先用水，再用20%硝酸（15分鐘以上），再用異丙醇超聲，其他的超聲10分鐘左右就行。如果篩板和螺絲是一體的

18、，那么就不能用那么高濃度的硝酸了5%既可了。開口的硅膠在空氣中放置1個(gè)小時(shí)以內(nèi)是沒有任何關(guān)系的，當(dāng)超聲完畢后，按照原來的樣子重新安裝上就可以了。然后再用甲醇飽和。我的長柱子25cm和短柱子15cm的我都拆開清洗過篩板，效果非常明顯，壓力從2200psi（25cm）下降至900psi，1800psi（15cm）下降至700psi。經(jīng)過全部檢查確定壓力增大是由柱子引起的可以一試。 本人不才,看了樓上各位的高見!也斗膽在這里談?wù)勛约旱囊恍┕芤?望各位多多指教!通常我們使用得較多的柱子都是反相柱,所以在這里我就只談反相硅膠柱的一些清洗方法:清洗硅膠鍵合柱子再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)

19、并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砣コ?。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過多次操作以后的色譜柱用90100的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑）沖洗20個(gè)體積可以清除污染物。（表2列舉了不同規(guī)格的HPLC柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相應(yīng)柱子沖洗的體積。）例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會導(dǎo)致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖流動(dòng)相（即把

20、緩沖液換成水）。沖洗510個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強(qiáng)的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子樂，如果污染物是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過一個(gè)或多個(gè)另外的有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。一般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常最后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。清洗過程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個(gè)非常

21、好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。對于典型的硅膠鍵合柱來說如果沒有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列：100甲醇100乙晴75乙晴25異丙醇100異丙醇100二氯甲烷100正己烷用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑。每種溶劑至少沖洗10個(gè)柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用12ml/min的流速來沖洗，要回復(fù)原來的溶劑體系，不需

22、要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒有緩沖的流動(dòng)相，最后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜（DMSO）或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作。還有一個(gè)問題是清洗過程中是否可以把HPLC柱子反過來。因?yàn)榇蠖鄶?shù)強(qiáng)保留的污染物都會累積在柱頭，把柱子反過來可以縮短污染物被沖出柱子的移動(dòng)距離?？紤]到裝填柱子的穩(wěn)定性，現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的，因此他們

23、的柱床應(yīng)該不會受到反方向流速的影響。但是，如果頭上的燒結(jié)比尾部的燒結(jié)孔徑大的話。例如尾部燒結(jié)的孔徑是2m，他通常能夠留住平均5m孔徑里的填料。有時(shí)侯廠家會讓頭部孔徑較大以避免樣品或流動(dòng)相顆粒堵塞。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線的最小粒徑時(shí)，有些填料能穿過這些縫隙而流出色譜柱，這樣會導(dǎo)致空白出現(xiàn)。如果柱子有箭頭標(biāo)志建議的流動(dòng)方向，我建議通過操作手冊和說明書，廠家主頁或者技術(shù)支持部門等確認(rèn)是否可以把柱子反過來沖。無論你是否把柱子反方向，最好不要讓溶劑通過檢測器避免污染物和穿透縫隙的顆粒進(jìn)入檢測池，否則有可能引起污染。清洗柱子頻率主要看有多少強(qiáng)保留物質(zhì)被打入色譜柱。因?yàn)榉聪嘀袝r(shí)候在分辨率消失

24、或者鬼峰出現(xiàn)前能承受很大的污染，使用者經(jīng)常會等到出現(xiàn)了異常情況才開始注意。然而，污染物過多的累積會導(dǎo)致清洗柱子的難度加大。所以，如果你知道經(jīng)常用雜質(zhì)較多的樣品上樣時(shí)，我建議你們有規(guī)律地清洗柱子，你越是頻繁清洗柱子，就清洗起來就越不費(fèi)勁。 我覺得應(yīng)該將所有注意事項(xiàng)條例化，這樣比較簡明，下面是我的個(gè)人觀點(diǎn)：1. 采用預(yù)柱或保護(hù)柱2. 要注意樣品的前處理，如果是臟樣品，例如中藥提取液，體液等，就需要采取萃取等操作除去對柱子損壞較大的雜質(zhì)，例如色素、多糖、蛋白質(zhì)等3. 用0.45um的膜過濾流動(dòng)相和樣品4. 確保流動(dòng)相pH在28之間5. 在用含緩沖液或者酸性較強(qiáng)的流動(dòng)相時(shí)，分析完后要用水沖洗，再用純有

25、機(jī)溶劑（最好是乙腈）沖洗6. 防止柱子干癟，避免色譜柱受到強(qiáng)烈震蕩7. 定期對色譜柱進(jìn)行清洗，吸取殘留的雜質(zhì)，并對柱效進(jìn)行測定8. 對每種樣品最好采用專用色譜柱9. 避免突然改變流速，也就是流速的改變要平緩 流動(dòng)相每天的需要很大的,都用0.45um的膜不是很慢而且不經(jīng)濟(jì)啊 我的流動(dòng)相是甲醇和水按2比3的比例混合的,開始幾天每天做完后都是先用雙蒸水先沖30min,然后用甲醇沖30min,接著就保存在甲醇里到第二天再做.柱子是新的ODS碳18柱子,今天老師告訴我不要沖太久,否則會把固定相上面的固定液沖走損害柱子,因?yàn)闆]有加其他鹽類,所以可以不沖太就都可以了,那我怎么清洗柱子呢 hu_2104411

26、 wrote:我的流動(dòng)相是甲醇和水按2比3的比例混合的,開始幾天每天做完后都是先用雙蒸水先沖30min,然后用甲醇沖30min,接著就保存在甲醇里到第二天再做.柱子是新的ODS碳18柱子,今天老師告訴我不要沖太久,否則會把固定相上面的固定液沖走損害柱子,因?yàn)闆]有加其他鹽類,所以可以不沖太就都可以了,那我怎么清洗柱子呢直接用甲醇沖洗。 hu_2104411 wrote:流動(dòng)相每天的需要很大的,都用0.45um的膜不是很慢而且不經(jīng)濟(jì)啊那并不是不經(jīng)濟(jì)，因?yàn)槟み€是很便宜的，而一根柱子的價(jià)格可是20003000元，如果是一些特殊的柱子，就更貴了，例如灌注色譜、高效排阻色譜柱、手性分離柱等，所以還是不要怕

27、麻煩，這樣會給以后的實(shí)驗(yàn)帶來很大的好處。 1、 注意正確地使用和存放色譜柱，不銹鋼柱色譜柱可選用以下的溶劑保存：正相柱用烴類溶劑，反相柱用甲醇，離子交換柱用水或甲醇/水。某些專用分析色譜柱要注意制造商規(guī)定的保存條件。另外，要注意溶液的PH值，一般控制在PH28范圍內(nèi)，其硅膠柱PH8時(shí)會發(fā)生硅膠溶脫的情況，鍵合型柱PH2時(shí)會發(fā)生鍵合相斷裂。2、 色譜柱污染后可采用合適的溶劑沖洗，使柱效再生。硅膠柱可以使用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水按順序沖洗色譜柱，經(jīng)過凈化的色譜柱必須進(jìn)行水活化，即按上述相反的順序沖洗。柱再生時(shí)所需要的有機(jī)溶劑要嚴(yán)格進(jìn)行脫水處理。反相柱可以用甲醇、氯仿、正庚烷沖洗，鍵

28、合C18柱一般用甲醇沖洗，必要時(shí)可用0.5 M EDTA鈉鹽溶液沖洗，然后用水沖洗，以達(dá)到去除柱內(nèi)鹽類。鍵合型的離子交換柱可以用緩沖溶液、水、甲醇沖洗。3、 對污染嚴(yán)重的色譜柱在沖洗無效時(shí)，需將柱內(nèi)填料取出進(jìn)行處理或更換新的填料，還可以用更換柱頭填料的方法即將柱頭入口處的被污染的填料取出，重新補(bǔ)裝和柱內(nèi)同類型的填料，然后在改變柱流向進(jìn)行再生。這種逆流再生柱的方法，可以救活大部分柱子。4、 注入色譜柱的溶劑、標(biāo)液、樣品溶液都必須嚴(yán)格過濾，以去除雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱。當(dāng)用反沖洗方法無效時(shí)，可將柱口過濾裝置取下，用弱酸溶液處理，去除污物或定期更換。5、 建議：為了保護(hù)色譜柱，避免給分析帶來不必要的麻

29、煩，請使用保護(hù)柱！ 1.流動(dòng)相中含緩沖鹽的最好新鮮配制。2.流動(dòng)相的水也最好用新鮮的，而且要放在棕色瓶中。 要注意流動(dòng)相中的磷酸鹽與甲醇混合時(shí)要注意其比例，否則可能異致磷酸析出，堵塞柱子。 我覺得關(guān)于柱子的保護(hù)除了加預(yù)柱,流動(dòng)相和樣品要過濾之外,很重要的一點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)后柱子沖洗.沖洗液應(yīng)該按柱子的說明進(jìn)行.我在工作中發(fā)現(xiàn):盲目的使用沖洗液,即使沖洗的時(shí)間很長,柱子的壽命還是很短.而根據(jù)柱子說明書中不同流動(dòng)相使用不同的沖洗液進(jìn)行沖洗,能使柱子的壽命延長.在進(jìn)行柱子的再生時(shí)也是如此. 說說新手容易出錯(cuò)的地方！1、用完柱子后不沖柱子。2、用完柱子后兩端沒封口。3、堵柱子后不管三七二十一就反沖。4、只要柱

30、效不夠就要買新柱子，不看是否有挽救措施。5、流動(dòng)相含有機(jī)相用水系膜過濾。6、片劑溶解離心后不過濾。7、PH不測定就開始沖柱子。8、擰柱子時(shí)用勁太猛，導(dǎo)致接口塞在柱口。上面的情況大家可否遇到過！ "要注意流動(dòng)相中的磷酸鹽與甲醇混合時(shí)要注意其比例，否則可能異致磷酸析出，堵塞柱子。 "想請教有什么具體要求? "要注意流動(dòng)相中的磷酸鹽與甲醇混合時(shí)要注意其比例，否則可能異致磷酸析出，堵塞柱子。 "想請教有什么具體要求? 其實(shí)最好的是參照色譜柱生產(chǎn)廠家的推薦方案，別的意見只能作為平時(shí)的參考，作到心里有數(shù)！ 針對普通的反相柱的沖洗，就我經(jīng)驗(yàn)來談幾點(diǎn)吧：一般要做好一下幾

31、點(diǎn)：1.保證樣品內(nèi)盡可能的澄清，具體方法：1.1過0.45um微孔濾膜；1.2有些樣品很難濾過：我遇到過這種情況，我采用的方法是將樣品放冰箱靜置1天，然后在過0.45um微孔濾膜，結(jié)果并不影響試驗(yàn)；2.就是具體進(jìn)樣的時(shí)候：中藥的話一般最好采用預(yù)柱；化藥不用也行的；3.柱子的沖洗了：3.1如果流動(dòng)相有鹽或者離子對的話先用純水沖洗3060分鐘的樣子，然后從低濃度沖到高濃度，最后用甲醇飽和就ok了，時(shí)間一般在6090分鐘就行了 3.2如果流動(dòng)相沒有鹽或者離子對的話就直接從低濃度沖到高濃度，最后用甲醇飽和就ok了，時(shí)間一般在6090分鐘就行了。 4.就好多人說：不要用純水沖洗，我認(rèn)為并不一定的，可以用

32、水，但是不要采用高流速這是真的，我的試驗(yàn)一直是采用純水的，結(jié)果沒有什么問題。 我現(xiàn)在在做一個(gè)新的化合物，用一般的C18柱分不開，但能略微的看到是有兩個(gè)峰，調(diào)流動(dòng)相和流速都分不開，我想換柱子，但不知道用什么柱子好呢？ shaoshen :離子對試劑是很難被“逐漸融解在流動(dòng)相中重干凈”的吧？！它和C18之間的作用不能簡單的理解為表面活性劑與C18的作用吧？?。ò嚯x你的發(fā)言兩年了） xiaolan2148134 wrote:我現(xiàn)在在做一個(gè)新的化合物，用一般的C18柱分不開，但能略微的看到是有兩個(gè)峰，調(diào)流動(dòng)相和流速都分不開，我想換柱子，但不知道用什么柱子好呢？“一個(gè)化合物”還要跑出幾個(gè)峰啊？做破壞實(shí)

33、驗(yàn)嗎？跑梯度了嗎？ 我覺得目前國內(nèi)在分離度改善方面更多的是改變流動(dòng)相,而國外更專注于選擇柱子.我想可能是經(jīng)費(fèi)方面的問題吧.目前,Waters和安捷倫,HP有一系列針對不同物質(zhì)和結(jié)構(gòu)的柱子,建議選擇其中一種多研究分析.我曾成功地用普通C18柱在20分鐘時(shí)分離手性物質(zhì)(流動(dòng)相是甲醇-水體系),所以遇到分離不佳可以考慮根據(jù)結(jié)構(gòu)選柱子,而非改流動(dòng)相.具體的各公司網(wǎng)頁和產(chǎn)品說明說中有. 若柱子使用的時(shí)間較長，柱壓較高時(shí)，可采用柱子再生法處理，即按水-甲醇-四氫呋喃-二氯甲烷-四氫呋喃-甲醇-水的順序來沖洗柱子，以達(dá)到提高柱子的柱效和壽命 謝謝上面的，讓我增長見識了 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管

34、與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為15mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 以上。一般在分離前備有一個(gè)預(yù)柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣。柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑

35、的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。2.1 液相色譜柱的結(jié)構(gòu)色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3

36、16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。716英寸外螺紋與14英寸柱管(6.35mm)連接，中間放置壓環(huán)用于密封。316英寸的內(nèi)螺紋與116英寸(1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在25mm長或其他固定尺寸)。在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有

37、一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。2.2 色譜柱分類色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑25mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長 10 30cm；窄徑柱（narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1 2mm，柱長10 20cm；毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2 0.5mm；半制備柱，內(nèi)徑5mm；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20 40mm，柱長10 30cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為

38、了避免管壁效應(yīng)。2.4 柱的填充和性能評價(jià)色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度20m時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒20m時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法，Waters專利；軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。

39、柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。一份合格的色譜柱評價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。2.5 柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。1避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從

40、高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）。2應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然，流?dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理3一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。4選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解，壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號。5避

41、免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處 理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。6經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。7.避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈8進(jìn)樣樣品要提純； 9嚴(yán)格控制進(jìn)樣量； 不要超載10 每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?，最好用洗脫能力?qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖

42、洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔45天開機(jī)沖洗15分鐘。11大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是27.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍12 按說明書保存色譜柱，絕對禁止講緩沖液留在柱內(nèi)過夜，注意反相柱不能用純水長時(shí)間沖13 不建議拆開柱子，自己更換填料一般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常最后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)

43、溶劑互混。清洗過程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。當(dāng)拿到一根新色譜柱時(shí)，請搞先仔細(xì)閱讀其說明書和質(zhì)檢報(bào)告,并按報(bào)告說明進(jìn)行驗(yàn)證，以下參數(shù)必須清楚：填料類型（C18,3m,全多孔型，含炭量，100A，）    色譜柱規(guī)格（250×4.6）柱子出廠保存在何種溶液，是否平衡過

44、，否則需要在使用前以低流速平衡過夜當(dāng)色譜柱使用一段時(shí)間，柱效下降的很厲害時(shí)請根據(jù)下表選擇您的再生方法： 極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生： 正庚烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水* 非極性固定相（如反相色譜填料RP18，RP8，CN等）的再生： 水乙腈氯仿（或異丙醇）乙腈水 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱 在對NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。 *如果簡單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。 色譜柱長時(shí)間不用，存放時(shí)，

45、柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死（請按說明書的規(guī)定，采用相應(yīng)的溶劑。）還有一個(gè)問題是清洗過程中是否可以把HPLC柱子反過來。因?yàn)榇蠖鄶?shù)強(qiáng)保留的污染物都會累積在柱頭，把柱子反過來可以縮短污染物被沖出柱子的移動(dòng)距離?？紤]到裝填柱子的穩(wěn)定性，現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的，因此他們的柱床應(yīng)該不會受到反方向流速的影響。但是，如果頭上的燒結(jié)比尾部的燒結(jié)孔徑大的話。例如尾部燒結(jié)的孔徑是2m，他通常能夠留住平均5m孔徑里的填料。有時(shí)侯廠家會讓頭部孔徑較大以避免樣品或流動(dòng)相顆粒堵塞。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線的最小粒徑時(shí)，有些填料能穿過這些縫隙而流出色譜柱，這樣會導(dǎo)致空白出現(xiàn)。如

46、果柱子有箭頭標(biāo)志建議的流動(dòng)方向，我建議通過操作手冊和說明書，廠家主頁或者技術(shù)支持部門等確認(rèn)是否可以把柱子反過來沖。無論你是否把柱子反方向，最好不要讓溶劑通過檢測器避免污染物和穿透縫隙的顆粒進(jìn)入檢測池，否則有可能引起污染。對于反相柱子，不建議用表面活性劑如十二烷基磺酸鈉（SDS）和三硝基甲苯，因?yàn)檫@些化合物必然會牢固吸附在硅膠鍵合相柱子上很難除去。用表面活性劑會影響裝填表面而改變其性質(zhì)。 如果樣品含有離子化合物，變化pH可以使他們轉(zhuǎn)為非離子狀態(tài)，這樣他們就可以被水有機(jī)溶劑混合物洗脫下來。例如，強(qiáng)堿性物質(zhì)能在pH低于3時(shí)被除去，在這個(gè)條件下質(zhì)子銨變得水溶性更好。酸性物質(zhì)能在pH調(diào)整到大于其pKa時(shí)

47、被洗下來-大約時(shí)pH8或9，這個(gè)狀態(tài)酸性物質(zhì)處于離子狀態(tài)。然而，要注意硅膠柱子在長時(shí)間處于高pH條件下容易被破壞。色譜工作者經(jīng)常會討論到離子對色譜中離子對試劑對固定相的影響。顯然離子對試劑如辛烷磺酸（用于陽離子）和四烷基銨溴（用于陰離子）在一定濃度的有機(jī)修飾劑下能很強(qiáng)地吸附在硅膠鍵合柱子上。柱子因此被污染很難回復(fù)到起始狀態(tài)，因此人們都認(rèn)為任何用于離子對的柱子都會被破壞而且用于不能再用于普通的反相色譜。Bidlingmeyer不同意這種觀點(diǎn)，他認(rèn)為用于離子對色譜苛刻的pH值會通過水解鍵合相和在酸性條件下（pH1-3）硬化硅膠或在高pH條件下（pH7-8）溶解硅膠使一些柱子的性質(zhì)改變。要清除離子對

48、試劑中的磺酸，他建議首先用相同的沒有離子對的緩沖液（至少20體積）沖洗然后用沒有緩沖液的流動(dòng)相(在清洗過程中甲醇可能比乙晴更有效；如果是長鏈的離子對試劑，用四氫呋喃)。很明顯，磺酸離子對試劑和銨離子對試劑有著不同的表現(xiàn)。Bidlingmeyer和他的合作者證明了在C18柱子上用流動(dòng)相濃度大于70的甲醇，長鏈離子對試劑，SDS不會吸附在固定相上。這個(gè)發(fā)現(xiàn)跟分離組的結(jié)果一致。硅膠鍵合整體柱如Chromolith 柱子（默克公司，德國）可認(rèn)為跟別的硅膠柱一樣。色譜柱中的流動(dòng)相會排干嗎？      不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵

49、將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇

50、）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。 既然談柱子，那也談?wù)勌盍瞎潭ㄏ嗷|(zhì)（擔(dān)體） HPLC填料可以是陶瓷性質(zhì)的無機(jī)物基質(zhì)，也可以是有機(jī)聚合物基質(zhì)。無機(jī)物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁。無機(jī)物基質(zhì)剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機(jī)聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機(jī)聚合物基質(zhì)剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機(jī)基質(zhì)中，導(dǎo)致填料顆粒膨脹，結(jié)果減少傳質(zhì)，最終使柱效降低。 硅膠硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強(qiáng)度外，還

51、提供一個(gè)表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質(zhì)填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點(diǎn)是在堿性水溶性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為28。硅膠的主要性能參數(shù)有：平均粒度及其分布。平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值越大。含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強(qiáng)，對溶質(zhì)的吸附作用越大。端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的

52、峰形。幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價(jià)格較便宜，缺點(diǎn)是渦流擴(kuò)散項(xiàng)及柱滲透性差；后者無此缺點(diǎn)。硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾 硅膠的表面結(jié)構(gòu)表面積硅膠的比表面積（每克硅膠的表面積）與孔徑大小成反比。表面活性表面活性取決于硅膠表面含有的硅羥基。游離硅羥基：活性最高氫化硅羥基：活性有所降低硅氧環(huán)：活性很弱活性的調(diào)節(jié)：在硅膠中加入一定量水，利用物理吸附水降低活性。1.1.2 氧化鋁具有與硅膠相同的良好物理性質(zhì)，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。不過現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了

53、在水相中穩(wěn)定的氧化鋁鍵合相，并顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。1.1.3 聚合物以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機(jī)填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)。使用任何流動(dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng)堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質(zhì)本質(zhì)上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強(qiáng)，但它可以通過適當(dāng)?shù)墓δ芑揎椬兂捎H水性的。這種基質(zhì)不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復(fù)沖洗。所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會出現(xiàn)膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因?yàn)?/p>

54、小分子在聚合物基質(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢，所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì)。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。1. 14 基質(zhì)的選擇硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。  硅膠  氧化鋁  苯乙烯-二乙烯苯  甲基丙烯酸酯耐有機(jī)溶劑  +  +  +  +適用

55、pH范圍  +  +  +  +抗膨脹/收縮  +  +  +  +耐壓  +  +  +  +表面化學(xué)性質(zhì)  +  +  +  +效能  +  +  +  +化學(xué)鍵合固定相將有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共

56、價(jià)鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相。這類固定相的突出特點(diǎn)是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類型來改變分離的選擇性。目前，化學(xué)鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應(yīng)，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個(gè)/nm2，由于空間位阻效應(yīng)（不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有4050%的硅醇基未反應(yīng)。殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質(zhì)（特別是堿性化合物）產(chǎn)生次級化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)

57、制復(fù)雜化（使溶質(zhì)在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性。結(jié)果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進(jìn)行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動(dòng)相有更好的“濕潤”性能。由于不同生產(chǎn)廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應(yīng)條件不同，因此具有相同鍵合基團(tuán)的鍵合相，其表面有機(jī)官能團(tuán)的鍵合量往往差別很大，使其產(chǎn)品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。pH值對以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應(yīng)在pH=28的介質(zhì)中使用。鍵合相的種類化學(xué)鍵合相按鍵合官能團(tuán)的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH