卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計(jì)說(shuō)明

1、 燕山大學(xué)課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計(jì)學(xué)院（系）：年級(jí) 專業(yè)： 0 學(xué) 號(hào)：學(xué)生 ：指導(dǎo) 教師：教師 職稱：燕山大學(xué)課程設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書院（系）： 基層教學(xué)單位： 學(xué) 號(hào)學(xué)生專業(yè)（班級(jí)）設(shè)計(jì)題目卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響設(shè)計(jì)主要容1.卵丘細(xì)胞存在對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響2.卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響設(shè)計(jì)要求1.提出設(shè)計(jì)方案前應(yīng)充分查閱各種文獻(xiàn)資料，2.要有明確設(shè)計(jì)的目的,設(shè)計(jì)合理的操作方式3.設(shè)計(jì)出合理的測(cè)定指標(biāo)4.設(shè)計(jì)的容要與題目基本一致5.設(shè)計(jì)總結(jié)與分析工作量1.至少閱讀15篇以上的相關(guān)科技文獻(xiàn)2.設(shè)計(jì)文字至少在15000字以上工作計(jì)

2、劃12.28-12.31 查閱資料1.1-1.3 整理文獻(xiàn)1.4-1.8 設(shè)計(jì)方案1.9-1.11 撰寫說(shuō)明書1.12 檢查容準(zhǔn)備答辯參考資料1 大元. 受精生物學(xué)M. 科學(xué), 2000, 51: 147-148.2 王海, 曾申明, 朱士恩. 培養(yǎng)介質(zhì)、卵丘細(xì)胞和卵泡直徑對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響J. 中國(guó)畜牧雜志, 2002, 38: 15-16.3 錢云, 丁家桐, 紅林. 卵母細(xì)胞成熟的形態(tài)學(xué)特征與其調(diào)控J. 國(guó)外畜牧科技, 2001, 26: 26-30.指導(dǎo)教師簽字基層教學(xué)單位主任簽字說(shuō)明：學(xué)生、指導(dǎo)教師、基層教學(xué)單位各一份。年 月 日 燕山大學(xué)課程設(shè)計(jì)成績(jī)?cè)u(píng)定表設(shè)計(jì)者: 學(xué)號(hào):設(shè)

3、計(jì)題目: 說(shuō)明書成績(jī)?cè)u(píng)定（滿分100分）： 得分設(shè)計(jì)容的切題程度：滿分20分 （ ）設(shè)計(jì)容立題合理性：滿分10分 （ ）設(shè)計(jì)容的規(guī)程度：滿分10分 （ ）設(shè)計(jì)書前后容完整：滿分20分 （ ）設(shè)計(jì)說(shuō)明說(shuō)排版成績(jī)：滿分20分 （ ）設(shè)計(jì)說(shuō)明書的工作量：滿分10分 （ ）設(shè)計(jì)過(guò)程平時(shí)成績(jī)： 滿分10分 （ ）總分成績(jī)：指導(dǎo)教師：年 月 日答辯成績(jī)?cè)u(píng)定：（滿分100分） 得分儀表成績(jī)：滿分20分 （ ）口語(yǔ)表達(dá)：滿分20分 （ ）幻燈質(zhì)量：滿分20分 （ ）設(shè)計(jì)分析：滿分40分 （ ） 總分： 教師：年 月 日設(shè)計(jì)撰寫成績(jī)（70%）答辯成績(jī)（30%）合計(jì)教師簽字：年 月 日2010-2011 秋季學(xué)期

4、生物工程專業(yè)課程設(shè)計(jì)結(jié)題論文卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計(jì)學(xué)院（系）：年級(jí) 專業(yè)：學(xué) 號(hào)：學(xué)生 ：指導(dǎo) 教師：教師 職稱：摘 要卵丘細(xì)胞是影響卵母細(xì)胞成熟的重要因素，尤其是包裹在卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞。本設(shè)計(jì)主要探討卵丘細(xì)胞對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。設(shè)計(jì)容主要分為兩部分：卵丘細(xì)胞存在對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計(jì)；卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計(jì)。第一部分設(shè)計(jì)擬定探索出卵丘細(xì)胞的存在能夠提高卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟；第二部分設(shè)計(jì)是在第一部分的基礎(chǔ)上分析卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)母細(xì)胞成熟的影響。通過(guò)本次設(shè)計(jì)，擬定探討卵丘細(xì)胞的存在和不同形態(tài)對(duì)豬卵母細(xì)胞的成熟率的影響。為提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量，

5、使體外受精、細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因與胚胎干細(xì)胞等技術(shù)研究的順利進(jìn)行，而作為這些研究基礎(chǔ)環(huán)節(jié)的卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)尤為重要。關(guān)鍵詞：卵丘細(xì)胞；豬卵母細(xì)胞；體外成熟17 / 25目 錄第一部分文獻(xiàn)綜述11.哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟研究進(jìn)展11.1卵母細(xì)胞體成熟的生理機(jī)理11.2卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)理12. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素22.1影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的生理性因素22.1.1卵巢來(lái)源豬的年齡、品種與健康狀況22.1.2所采集卵巢所處的性周期22.1.3采集卵巢離體時(shí)間與保存溫度32.1.4采集卵母細(xì)胞的方法32.2影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的物理性因素32.2.1體外成熟培養(yǎng)條件42.2.2體

6、外成熟培養(yǎng)時(shí)間42.2.3體外成熟培養(yǎng)方式42.3影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的化學(xué)性因素42.3.1成熟培養(yǎng)基42.3.2激素52.3.3血清52.3.4卵泡液62.3.5細(xì)胞生長(zhǎng)因子63.卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展73.1卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系73.2卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響83.3卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響93.4去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中的超微結(jié)構(gòu)變化10第二部分課程設(shè)計(jì)部分111.實(shí)驗(yàn)材料111.1 卵巢111.2 實(shí)驗(yàn)用的儀器111.3 實(shí)驗(yàn)試劑122.方法122.1 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）的收集122.2豬卵

7、母細(xì)胞的分級(jí)122.3卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)132.4各組卵母細(xì)胞的成熟觀察133. 設(shè)計(jì)133.1卵丘細(xì)胞存在對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響133.2卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響134.分析與總結(jié)144.1卵丘細(xì)胞存在對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響144.2卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響145.設(shè)計(jì)體會(huì)15參考文獻(xiàn)16第一部分 文獻(xiàn)綜述1.哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟研究進(jìn)展1.1卵母細(xì)胞體成熟的生理機(jī)理卵母細(xì)胞成熟是指卵母細(xì)胞恢復(fù)和完成第一次減數(shù)分裂，進(jìn)入并停滯于第二次減數(shù)分裂中期，此間伴隨著胞漿成熟，即卵母細(xì)胞的成熟包括其核成熟和胞漿成熟兩個(gè)方面v。核成熟是核膜破裂，同源染色體分離和排出第一極

8、體；胞漿成熟是胞漿各種蛋白組成達(dá)到一定水平與線粒體的有效重排。1.2卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)理卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）是指在體外人工給定的條件下，哺乳動(dòng)物次級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的生長(zhǎng)發(fā)育最終形成有受精能力的成熟卵母細(xì)胞的過(guò)程。卵母細(xì)胞的體外成熟包括細(xì)胞核的成熟、細(xì)胞質(zhì)的成熟、卵丘細(xì)胞的成熟、透明帶的成熟以與其卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的發(fā)育成熟等一系列復(fù)雜的變化過(guò)程，主要表現(xiàn)在細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟兩個(gè)方面。在形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)為紡錘體形成，核仁致密化，染色質(zhì)高度濃縮成染色體，第一極體釋放，細(xì)胞器重組，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、膨脹和透明帶軟化等一系列生理變化vii。細(xì)胞核成熟即卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，發(fā)生生發(fā)泡破裂(

9、genninal vesiclebreakdown，GVBD)并發(fā)育到第一次減數(shù)分裂中期；與此同時(shí)，卵母細(xì)胞進(jìn)一步跨越第一次減數(shù)分裂中期，排出第一極體(第一極體含有極微量的細(xì)胞質(zhì)，不久就退化)并停止于第二次減數(shù)分裂的中期，直到受精(或激活)后才完成第二次減數(shù)分裂并排出第二極體。細(xì)胞質(zhì)的成熟包括細(xì)胞器的變化和細(xì)胞基質(zhì)的變化，皮質(zhì)顆粒在胞質(zhì)合成后，逐漸遷移到質(zhì)膜下的皮質(zhì)區(qū)。高爾基復(fù)合體最初位于核的周圍，成熟過(guò)程中移向皮質(zhì)，皮質(zhì)顆粒完全形成后，高爾復(fù)合體在皮質(zhì)中消失。發(fā)育早期的線粒體為圓形或橢圓形等，主要分布于皮質(zhì)部，卵母細(xì)胞成熟后，線粒體又移向核周圍，形成幼稚型線粒體。隨著卵母細(xì)胞的成熟，粗面質(zhì)網(wǎng)

10、減少，而滑面質(zhì)網(wǎng)增多，到成熟晚期，滑面質(zhì)網(wǎng)變得很少。胞質(zhì)成熟一個(gè)非常重要的特點(diǎn)是積累一些穩(wěn)定的mRNA，并在卵母細(xì)胞成熟到一定階段進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。有些細(xì)胞質(zhì)成熟過(guò)程依賴于細(xì)胞核成熟。 透明帶軟化也是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志。透明帶是一層糖蛋白膜，受精時(shí)可以結(jié)合并誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，并阻止多精受精。在卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中，有很多化學(xué)物質(zhì)與因子參與反應(yīng)，因此，只有當(dāng)體外成熟條件與體卵母細(xì)胞發(fā)育所需要的環(huán)境非常接近時(shí)，才能獲得較高的成熟率，從而為進(jìn)一步的科研工作提供優(yōu)質(zhì)大量成熟的卵母細(xì)胞。2. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素2.1影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的生理性因素2.1.1 卵巢來(lái)源豬的年齡、品種與健康狀

11、況同一種動(dòng)物在不同年齡段其卵母細(xì)胞在體外成熟的情況也有所不同。從初情期前的青年母豬卵巢中獲得的豬卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外成熟培養(yǎng)后可得到IVP 后代，但是，成功的效率不如經(jīng)產(chǎn)母豬卵巢體外成熟的卵母細(xì)胞。不同的國(guó)家和地區(qū)之間，豬的品種必定存在著遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境和氣候條件等等的因素而帶來(lái)品質(zhì)上的差異，從而影響豬卵母細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)而對(duì)體外成熟培養(yǎng)也產(chǎn)生一定的影響。而即使是從同一品種和統(tǒng)一地區(qū)的豬種所獲得的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，其培養(yǎng)效果也會(huì)因豬的健康情況和卵巢質(zhì)量等的影響而有很大的不同，比如，處在育齡盛期的健康母豬，其卵巢的體積大，表面卵泡多而且直徑在3-6mm 的卵泡相對(duì)比例就會(huì)較高，抽得的卵母細(xì)胞形態(tài)完

12、好，裸卵少，相對(duì)體外成熟培養(yǎng)效果也好。反之，取自仔豬、處女豬、老母豬與老弱病殘豬的卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)效果則較差。2.1.2所采集卵巢所處的性周期所采集的卵巢所處的性周期同樣影響卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)采集卵巢所處的性周期，將其分為卵泡期和黃體期，再將黃體期卵巢分為有黃體期卵巢和無(wú)黃體期卵巢。無(wú)黃體期卵巢上的卵母細(xì)胞比黃體期卵巢上卵母細(xì)胞成熟效果要好。亞利等認(rèn)為豬卵泡期卵母細(xì)胞的培養(yǎng)效果要高于黃體期，但差異不顯著。輝等研究表明，在牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)中，有著同樣的結(jié)果，即卵泡期卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)結(jié)果要高于黃體期xxvi。因此，卵巢所處性周期不同，卵泡的能量物質(zhì)、激素濃度等也會(huì)隨

13、之而發(fā)生變化，進(jìn)而影響了體外成熟培養(yǎng)的結(jié)果。2.1.3采集卵巢離體時(shí)間與保存溫度一般而言，卵巢離體的時(shí)間要求在24h ，時(shí)間越短，所獲得的卵母細(xì)胞的質(zhì)量越好，體外成熟培養(yǎng)的效果也越好。文國(guó)藝等xxvii研究認(rèn)為，豬卵巢離體時(shí)間越短，其卵母細(xì)胞的卵裂率越高，并且隨著離體時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。相對(duì)于其他哺乳動(dòng)物而言，豬卵母細(xì)胞對(duì)溫度的敏感度較高，較高或較低都會(huì)直接影響到體外成熟的效果，一般來(lái)講，豬卵巢的保存溫度在2835，文國(guó)藝等研究表明，當(dāng)卵巢的保存溫度低于25，豬卵母細(xì)胞體外成熟收到明顯的影響并進(jìn)而影響到受精的結(jié)果。2.1.4卵泡的大小與卵丘細(xì)胞目前，普遍認(rèn)為進(jìn)行體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞在38mm，培

14、養(yǎng)效果較好。Yoon等研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自38mm直徑卵泡的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于小于3mm的卵泡卵母細(xì)胞(91%vs 58%)。毅冰等也證明小直徑卵泡卵母細(xì)胞(<12 mm)成熟率不如大直徑卵泡卵母細(xì)胞（26mm）。但在特別大的卵泡中有些卵母細(xì)胞有嚴(yán)重退化的現(xiàn)象。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞被卵丘細(xì)胞包裹形成COCs）。排卵之前，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，合成大量胞外基質(zhì)，并富含透明質(zhì)酸（Hyaluronic：HA），有利于排卵后進(jìn)入輸卵管，同時(shí)保證了卵母細(xì)胞正常的受精和胚胎發(fā)育潛力，所以，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)對(duì)卵母細(xì)胞成熟，特別是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟起著重要作用。根據(jù)卵母細(xì)胞外面包裹的卵丘細(xì)胞的層數(shù)將其分成三級(jí)。A 級(jí)

15、：卵丘細(xì)胞在3 層或3層以上。B 級(jí)：卵丘細(xì)胞為12 層；或卵丘細(xì)胞雖在3 層或3 層以上，但是不完整，部分為12 層。C 級(jí)：裸卵或卵丘細(xì)胞雖為12 層或多層，但是不完整，部分裸露。A 級(jí)卵母細(xì)胞的培養(yǎng)效果要優(yōu)于B 級(jí)和C 級(jí)。2.1.4采集卵母細(xì)胞的方法目前，常用的采集豬卵母細(xì)胞的方法有三種即抽吸法、切割法和刺破法，相對(duì)于刺破法和切割法而言，抽吸法較為常用，但是所獲得的卵母細(xì)胞質(zhì)量較差，甚至出現(xiàn)較多的裸卵，進(jìn)而間接地影響了體外培養(yǎng)的效果。2.2影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的物理性因素2.2.1體外成熟培養(yǎng)條件溫度 不同動(dòng)物的卵母細(xì)胞所需要的體外成熟培養(yǎng)溫度因動(dòng)物種類的不同而不同，豬所需要的溫度一

16、般為3839較為適宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于細(xì)胞的發(fā)育。濕度在IVM 時(shí)一般采用的是飽和濕度，目的是減少培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，從而維持培養(yǎng)基中卵母細(xì)胞所需要的各種物質(zhì)的濃度與保持滲透壓。通常在培養(yǎng)基上面覆蓋一層石蠟油或礦物油，以使在培養(yǎng)箱或離箱操作時(shí)維持培養(yǎng)基的氣相、濕度與pH 值。此外，培養(yǎng)箱所用的水的純度和高度無(wú)菌也是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵性因素。氣相環(huán)境目前卵母細(xì)胞常用的培養(yǎng)氣相有兩種即是5%CO2、5%O2、90%N2和5%CO2、95%的空氣xxxii。在這兩種氣相中，CO2的含量很關(guān)鍵。多數(shù)培養(yǎng)基在配制前都已將pH 值調(diào)好，并具有一定的緩沖能力，因此，5%CO2 則剛好是維持pH 所必需。另外，要

17、保證所用氣體的無(wú)毒。2.2.2體外成熟培養(yǎng)時(shí)間不同動(dòng)物的卵母細(xì)胞所需要的體外成熟培養(yǎng)時(shí)間因動(dòng)物種類的不同而有所不同，大多數(shù)哺乳動(dòng)物所需要的體外培養(yǎng)時(shí)間為2224h，但是對(duì)豬而言，卻需要更長(zhǎng)的時(shí)間，一般，豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間為44h。Sosnowki 等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4048 h 與3036 h 對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟率差異顯著，但是分析染色體核型發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，染色體異常率會(huì)隨之增加。2.2.3體外成熟培養(yǎng)方式目前，常用的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方式有微滴培養(yǎng)法、套皿培養(yǎng)法與普通的單皿培養(yǎng)法。相對(duì)于普通的單皿培養(yǎng)法而言，微滴培養(yǎng)法和套皿培養(yǎng)法可以更好的保持細(xì)胞發(fā)育所需要的微環(huán)境

18、，同時(shí)減少微生物的污染?？〉妊芯空J(rèn)為在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中，套皿培養(yǎng)法可以代替微滴培養(yǎng)法中礦物油的作用，從而可以減少礦物油對(duì)細(xì)胞的危害。2.3影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的化學(xué)性因素2.3.1成熟培養(yǎng)基成熟基礎(chǔ)液的構(gòu)成,直接影響到卵母細(xì)胞的成熟率與以后的受精和胚胎發(fā)育。豬卵母細(xì)胞的IVM 液有Whitten's medium，NCSU-23，TCM-199NCSU-37。目前豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液以TCM-199和NCSU-23使用較多。成熟培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液不同卵母細(xì)胞成熟后GSH 的含量存在顯著差異，IVF后雄原核形成率也不同。Wang等人的研究顯示在NCSU-23 中成熟的卵

19、母細(xì)胞IVF 后囊胚發(fā)育率顯著高于在TCM-199 和改良Whitten's 液中Lalantha等人認(rèn)為在不添加蛋白質(zhì)添加物的情況下TCM-199 更有利于卵母細(xì)胞的核成熟，而在Waymouth基礎(chǔ)液中成熟的卵母細(xì)胞其核成熟率雄原核形成率和囊胚發(fā)育率較低。王海等研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞在兩種培養(yǎng)液中的成熟率差異不顯著。但葉華虎等研究發(fā)現(xiàn)，受精后胚胎發(fā)育能力NCSU-23占明顯優(yōu)勢(shì)。2.3.2激素在卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中，F(xiàn)SH、LH 有利于改變卵丘細(xì)胞的代機(jī)能，并阻斷卵丘細(xì)胞通過(guò)胞間連接向卵母細(xì)胞分泌減數(shù)分裂抑制因子的途徑，從而使卵母細(xì)胞恢復(fù)成熟分裂過(guò)程 。在豬卵母細(xì)胞體外成熟研究中，許

20、多學(xué)者都選擇添加PMSG,有人還認(rèn)為添加PMSG 和hCG 的組合對(duì)豬卵母細(xì)胞核成熟的促進(jìn)作用優(yōu)于添加FSH 和LH。尤其對(duì)于LH 的添加存在爭(zhēng)議，有研究者認(rèn)為L(zhǎng)H 在卵母細(xì)胞培育過(guò)程中并未發(fā)揮作用，Izadyar 等認(rèn)為在不含血清的成熟培養(yǎng)液中，只有FSH 能影響卵母細(xì)胞的成熟，而LH 沒(méi)有作用；Bevers 等認(rèn)為小于8mm 的牛卵泡中，顆粒細(xì)胞上只有FSH 受體mRNA，而沒(méi)有LH 受體mRNA。但禮繁等卻認(rèn)為L(zhǎng)H 對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的促進(jìn)效果要強(qiáng)于FSH。在早期的研究中，促性腺激素多數(shù)存在于整個(gè)體外培養(yǎng)過(guò)程，但1994 年，F(xiàn)unashi 等的研究表明，在豬卵母細(xì)胞IVM 時(shí)，培養(yǎng)前

21、20 h 加入PMSG、hCG、E2，而在培養(yǎng)后20 h 去除，可增加卵母細(xì)胞的成熟率，同時(shí)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和胞質(zhì)的成熟，而且有利于卵母細(xì)胞的發(fā)育和受精。蔡令波等在培養(yǎng)后期去除促性腺激素也得出了相似結(jié)果。2.3.3血清自20 世紀(jì)80 年代血清應(yīng)用于卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)以來(lái)，血清在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)并利用，血清中含有許多成分包括能量物質(zhì)、氨基酸、維生素、激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等等能夠促進(jìn)原始卵泡卵母細(xì)胞生長(zhǎng)啟動(dòng)，并提供生長(zhǎng)所需的一種或幾種因子，因而，培養(yǎng)液中添加動(dòng)物血清可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中，用得最廣泛的是在成熟培養(yǎng)液中添加10%的胎牛血清（F

22、etal bovine serum，F(xiàn)BS）。蔡令波等曾研究表明發(fā)情牛血清（Estrus cows serum，ECS）較新生犢牛血清（Newborn Calf Serum，NCS）更有利于豬卵母細(xì)胞體外成熟。近年來(lái)，許多研究者又在豬的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加一定比例的豬血清，其中包括:新生仔豬血清，母豬發(fā)情的血清等。雖然血清對(duì)于豬卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)有較好的促進(jìn)作用，但是血清也有其本身固有的不利因素，如血清中所含有的激素、維生素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子，以與許多未知物質(zhì)，并且容易被支原體感染。此外血清的來(lái)源不同、批次不同均會(huì)導(dǎo)致血清中所含組分與組分間比例不同，從而導(dǎo)致了卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和

23、體外培養(yǎng)的不穩(wěn)定。因此，尋找比較適宜的血清替代品成為當(dāng)前的一大研究熱點(diǎn)，目前用來(lái)代替血清的替代品有牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin ， BSA) 、聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol ， PVA) 、聚乙烯毗咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)等大分子有機(jī)物質(zhì)。2.3.4卵泡液豬卵泡液(pig follicular fluid，pFF)是豬卵母細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有著重要的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)在提高豬卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量并增加胚胎的發(fā)育能力。Naito 等xlv的研究認(rèn)為：在體外成熟培養(yǎng)中，PFF 可以促進(jìn)豬卵母細(xì)胞胞質(zhì)的成熟，并顯

24、著提高豬卵母細(xì)胞受精后的原核形成率。Yashida 等報(bào)道在成熟培養(yǎng)基中添加豬卵泡液可顯著提高豬卵母細(xì)胞的核成熟率、正常受精率與卵裂率。Vatzias 等研究發(fā)現(xiàn)冷凍卵泡液在促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟、降低多精受精方面優(yōu)于新鮮卵泡液，孟慶剛等認(rèn)為在激素存在的條件下，pFF 具有促進(jìn)豬小腔卵泡卵母細(xì)胞體外成熟的作用。2.3.5細(xì)胞生長(zhǎng)因子與卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子主要包括表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast Growth Factor，

25、FGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF )與神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)等，這些細(xì)胞生長(zhǎng)因子之間相互作用，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟、受精與卵裂起著重要作用。目前已經(jīng)證實(shí)，EGF 可以促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的核成熟。Abeydeera的研究表明，EGF 能提高卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)的合成，從而提高卵母細(xì)胞胞質(zhì)的質(zhì)量，IGF 對(duì)細(xì)胞具有促分裂、分化與促代等生物學(xué)功能，是一個(gè)具有多種生理功能的生長(zhǎng)因子，因此，同樣能促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的成熟，并能提高所得胚胎的發(fā)育能力。TGF-，在結(jié)構(gòu)上和功能上與EGF 相似，因而也可以與EGF受體結(jié)合，誘

26、導(dǎo)豬卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散，促進(jìn)卵母細(xì)胞核成熟。NGF 也是豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，能影響豬卵母細(xì)胞成熟的動(dòng)力學(xué)，加快進(jìn)入M11 期。3.卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展卵母細(xì)胞的體外成熟可以為細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因等胚胎工程的研究提供大量卵母細(xì)胞。在排卵前，由于促性腺激素的作用，卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂的同時(shí)，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（4C4D）的卵丘發(fā)生擴(kuò)展，4C4D在體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中也發(fā)生類似的變化。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞、卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟之間的關(guān)系很復(fù)雜。本文主要對(duì)卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中的作用加以闡述，進(jìn)而對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)加以改進(jìn)。3.1卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞在卵母

27、細(xì)胞成熟過(guò)程中的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟與其周圍的卵泡細(xì)胞的作用是分不開(kāi)的。原始卵泡由位于中心的卵母細(xì)胞和其周圍的一層扁平卵泡細(xì)胞組成。此時(shí)卵母細(xì)胞處于第一次減數(shù)分裂前期，以后隨著卵母細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)，卵泡細(xì)胞迅速增殖，由單層變?yōu)槎鄬?。在這些卵泡細(xì)胞，線粒體和粗面質(zhì)網(wǎng)豐富。卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞伸出突起穿過(guò)透明帶互相聯(lián)系。到有腔卵泡時(shí)，卵泡細(xì)胞分為兩部分：一部分為壁層顆粒細(xì)胞，與基膜相連：另一部分為包圍卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。壁層顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間，卵丘細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間以與卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間，存在著廣泛的縫隙連接。卵泡中的縫隙連接使壁層顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞共同形成一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能上

28、的合胞體1。處于成熟階段的卵母細(xì)胞，卵丘細(xì)胞通過(guò)大量充滿肌纖維蛋白的帶狀結(jié)構(gòu)緊密包裹著透明帶，保持卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間縫隙聯(lián)系，進(jìn)行離子交換和一些小的代物質(zhì)的交換。卵母細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)依賴卵丘細(xì)胞提供，兩者間通過(guò)縫隙連接進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟。裸卵僅能夠利用周圍介質(zhì)中的丙酮酸和三羧循環(huán)的中間產(chǎn)物，不能直接利用葡萄糖卵丘細(xì)胞可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育提供能量。如果兩者間縫隙連接過(guò)早破壞，卵母細(xì)胞可能停止發(fā)育2。卵丘細(xì)胞合成的一些蛋白質(zhì)啟動(dòng)和抑制卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟。體外成熟過(guò)程中卵丘細(xì)胞的構(gòu)成蛋白和新生蛋白都有明顯改變，如果在培養(yǎng)過(guò)程中去除卵丘細(xì)胞將明顯

29、降低牛卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育能力3?？傊?，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育是必需的。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的作用機(jī)制先前認(rèn)為是一些生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子（EFG）、胰島素樣生長(zhǎng)因（IGF-1）通過(guò)卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞行使促成熟影響，但目前證明生長(zhǎng)因子對(duì)牛和鼠的裸卵也有促成熟作用，卵母細(xì)胞也存在IGF-1受體mRNA。因而卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞成熟的啟動(dòng)似乎并不起主導(dǎo)作用，應(yīng)該只能認(rèn)為是起加強(qiáng)或減弱的輔助作用。這可能是由于牛卵母細(xì)胞在體外大部分可自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育至成熟。盡管如此，據(jù)報(bào)道卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞受精后至囊胚的發(fā)育是必不可少的。S.Hashimoto等人

30、報(bào)道培養(yǎng)液中，添加卵丘細(xì)胞(1.6×106個(gè)mL)可以促進(jìn)牛有完整放射冠的卵母細(xì)胞的發(fā)育，但在培養(yǎng)液中，添加與COCs中卵丘細(xì)胞濃度一樣的卵丘細(xì)胞數(shù)（4.2×106個(gè)mL）對(duì)于裸卵的發(fā)育無(wú)作用，1.63.2×106個(gè)卵丘細(xì)胞mL對(duì)于帶有完整縫隙連接的卵母細(xì)胞的體外成熟效果最好。可見(jiàn)卵丘細(xì)胞是影響卵母細(xì)胞體外成熟的重要因素之一。3.2卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，卵丘細(xì)胞也隨之成熟而充分?jǐn)U展，從而中斷了卵丘細(xì)胞之間以與卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的緊密連接狀態(tài)，進(jìn)而疏通了這些細(xì)胞之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的通道。卵母細(xì)胞也可能通過(guò)分泌特殊因子或通過(guò)促卵泡素（

31、FSH）和EGF刺激卵丘透明質(zhì)酸酶的合成，調(diào)節(jié)卵丘擴(kuò)散，從而解除卵丘-卵母細(xì)胞的異源連接，促使減數(shù)分裂恢復(fù)。卵丘細(xì)胞是否成熟是卵母細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志，只有兩者均成熟時(shí)，精子才能有效地穿透卵子并進(jìn)而發(fā)生卵裂10。卵丘擴(kuò)展常用作判斷卵母細(xì)胞體外成熟的特征，Hunter和Moor根據(jù)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況制定了牛卵母細(xì)胞體外成熟的判斷標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)成熟卵為“卵丘細(xì)胞完全擴(kuò)展”；卵丘細(xì)胞團(tuán)至少擴(kuò)展-倍于裸卵直徑（300µm）；,級(jí)成熟卵為“卵丘細(xì)胞中等擴(kuò)展”，卵丘細(xì)胞向外擴(kuò)展約,倍于裸卵直徑（200µm）；-級(jí)成熟卵為“卵丘細(xì)胞輕度擴(kuò)展”，卵丘細(xì)胞仍緊緊地粘貼在透明帶上。一般絕大多數(shù)的1級(jí)成

32、熟卵和多數(shù)的2,級(jí)成熟卵均已達(dá)到成熟狀態(tài)，排出第一極體.卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟之間的關(guān)系很復(fù)雜。在小鼠，去除卵母細(xì)胞的COCs即使在含有FSH的培養(yǎng)液中卵丘也不能擴(kuò)展，說(shuō)明卵丘擴(kuò)展依賴于卵母細(xì)胞；但是如果在小鼠的COCs培養(yǎng)基中加入硫酸胺G和肝素，雖能抑制FSH或EGF誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)展，但對(duì)卵母細(xì)胞成熟卻無(wú)影響，說(shuō)明卵母細(xì)胞成熟不一定依賴于卵丘擴(kuò)展。興參等實(shí)驗(yàn)中卵丘擴(kuò)展良好或不好對(duì)卵母細(xì)胞核成熟沒(méi)有明顯的影響，得出豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展不依賴于卵母細(xì)胞4。在體卵丘擴(kuò)展可促進(jìn)精子獲能，保證正常受精和合子發(fā)育。但最近的報(bào)道對(duì)=>:過(guò)程中卵丘擴(kuò)展在支持胚胎發(fā)育上提出質(zhì)疑。卵丘擴(kuò)展對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟不是

33、必需的。卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞核成熟沒(méi)有明顯影響。至少與細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步成熟無(wú)直接關(guān)系。因此，需要進(jìn)一步研究來(lái)確定卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟是否有關(guān)系.3.3卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞層數(shù)是影響卵母細(xì)胞成熟的重要因素。不同的研究者對(duì)卵母細(xì)胞的分類不盡一致。目前的研究中，回收的大部分卵母細(xì)胞都有完整的卵丘細(xì)胞包圍（致密或分散）。卵丘細(xì)胞的形態(tài)不依賴于供體的類型，擁有完整多層并且擴(kuò)散的卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞的比例最大（39.346），其次是帶有致密多層的卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞（26.928），裸卵的比例小于7。這些結(jié)果與Abdoon的報(bào)道一致，他也發(fā)現(xiàn)大部分的卵母細(xì)胞有5層或更多層的卵

34、丘細(xì)胞，并且具有均勻致密的卵質(zhì)。H.Tomer實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，具有多層的卵丘細(xì)胞（致密或分散）的卵母細(xì)胞55以上到達(dá)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)雙線期，具有體外發(fā)育完全的最大潛力。榮鳳等實(shí)驗(yàn)，以皮層顆粒（CG）單層分布于質(zhì)膜下做為卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的指標(biāo)，分別于成熟培養(yǎng)前后觀察各類卵子的CG分布情況。結(jié)果證實(shí)裸卵成熟培養(yǎng)后CG完全消失或卵子本身形態(tài)出現(xiàn)異常?？梢?jiàn)，裸卵是一類尚未成熟即趨于退化的卵子，不能正常受精與進(jìn)一步發(fā)育。卵丘細(xì)胞已擴(kuò)散成蜘蛛網(wǎng)狀的卵子成熟培養(yǎng)前后的質(zhì)成熟率均顯著高于多卵丘細(xì)胞和少卵丘細(xì)胞卵，而其受精后的發(fā)育潛力（囊胚發(fā)育率3.40）卻明顯不與后兩者（囊胚發(fā)育率28.70和23.10）。結(jié)果還表明，

35、卵泡直徑與卵丘細(xì)胞多少具有相關(guān)性，卵泡越大，多卵丘細(xì)胞卵所占的比率越高11。綜上所述，在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中，卵丘細(xì)胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。體外成熟培養(yǎng)時(shí)，需選擇從直徑大于2mm卵泡吸出的卵丘細(xì)胞致密的多卵丘細(xì)胞卵進(jìn)行培養(yǎng)。盡管目前卵丘擴(kuò)展程度可作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志之一，但卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟不是必需的。對(duì)于卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞聯(lián)系的在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。3.4 去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中的超微結(jié)構(gòu)變化去除卵丘細(xì)胞會(huì)降低小鼠卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。利用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察去卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的超微結(jié)構(gòu)變化，目的是在亞細(xì)胞水平上尋找由于卵丘細(xì)胞的去除而導(dǎo)致卵母

36、細(xì)胞質(zhì)量降低的原因。(1) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中微絨毛由細(xì)長(zhǎng)到短粗，由倒伏到直立均與卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟過(guò)程中微絨毛變化規(guī)律相符。(2) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中線粒體由簇狀分布逐漸變?yōu)樯⒉加诼奄|(zhì)，該過(guò)程與卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟過(guò)程中線粒體變化規(guī)律相符。(3) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中，皮質(zhì)顆?？赡艽嬖诶^發(fā)性生成障礙或者數(shù)量異常，該結(jié)果可能是去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞存在體外受精障礙的原因之一。第二部分 課程設(shè)計(jì)部分卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響獲取高質(zhì)量的體外成熟卵母細(xì)胞是成功進(jìn)行人類體外受精、動(dòng)物胚胎生產(chǎn)和克隆的關(guān)鍵。盡管動(dòng)物

37、卵母細(xì)胞能夠在體外自發(fā)完成細(xì)胞核成熟，但卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量遠(yuǎn)不如體成熟卵母細(xì)胞，其受精后胚胎發(fā)育能力較差。目前認(rèn)為，這可能是由于體外成熟的卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟不充分造成的。研究表明，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)與受精率和囊胚發(fā)育率有強(qiáng)相關(guān)性。所以，繼續(xù)深入認(rèn)識(shí)卵母細(xì)胞的成熟規(guī)律、改善體外成熟培養(yǎng)環(huán)境、建立一種完善的卵母細(xì)胞體外成熟系統(tǒng)是當(dāng)前胚胎工程研究的重要容之一。盡管研究證明，卵泡細(xì)胞在卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟過(guò)程中起到了重要的作用，但對(duì)于不同類型細(xì)胞發(fā)揮的具體作用以與作用機(jī)制的理解還比較匱乏。本研究主要目的有兩點(diǎn)：第一，深入探討卵丘細(xì)胞支持卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的作用機(jī)制；第二，通過(guò)改善體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，最大限度

38、的提高裸卵的體外成熟與發(fā)育能力，為生發(fā)泡移植和GV期卵母細(xì)胞冷凍保存等技術(shù)提供有效的裸卵成熟方法。因此，本研究通過(guò)對(duì)機(jī)械裸卵和COCs進(jìn)行體外成熟，經(jīng)體外培養(yǎng)而探討卵丘細(xì)胞存在和不同形態(tài)卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟與孤雌發(fā)育能力的影響。1.試驗(yàn)材料1.1 卵巢豬卵巢采集自省市海濱區(qū)新店子屠宰場(chǎng)。豬宰殺剖腹后，立即無(wú)菌剪下卵巢，挑選黃體期和紅體較少，卵泡直徑約35 mm、大小均勻的卵巢，使用37的PBS緩沖液沖洗干凈，置于37的PBS緩沖液4h帶回實(shí)驗(yàn)室。1.2 試驗(yàn)用的儀器儀器廠商型號(hào)體式顯微鏡日本NikonSMZ熒光顯微鏡日本NikonE600全自動(dòng)高壓消毒鍋日本YamatoSM-51CO2培

39、養(yǎng)箱美國(guó) BINDER低溫臺(tái)式高速離心機(jī)德國(guó) Eppendorf自動(dòng)數(shù)字天平ADEK-120A液氮罐Taylar-Wharton1.3試驗(yàn)藥品藥品廠商TCM199GIBCOHepesSIGMAFCSSIGMAFSH市激素制品LH市激素制品PFF自制青霉素美羅大藥廠鏈霉素美羅大藥廠蔗糖生物優(yōu)先公司GlySIGMADMSOSIGMA0.25ml細(xì)管耀北生物技術(shù)公司四孔板耀北生物技術(shù)公司2.方法2.1豬卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)的收集從屠宰場(chǎng)收集卵巢后，放入35雙抗生理鹽水中，用保溫瓶在3h 運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，去除血污。然后用帶有18G針頭的一次性注射器，抽吸直徑2 10 mm卵泡中的卵泡液。吸卵液

40、為TCM199+25 mmol/L HEPES+10g/mL肝素+4.0 g/L BSA。吸出液收集在35 mm一次性培養(yǎng)皿中，靜置510 min后，在實(shí)體顯微鏡下挑選形態(tài)與顏色正常的、細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。2.2 豬卵母細(xì)胞的分級(jí)收集的未成熟豬卵母細(xì)胞以卵丘細(xì)胞層數(shù)為準(zhǔn)分為三級(jí)：A級(jí)：卵丘細(xì)胞在3層或3層以上。B級(jí)：卵丘細(xì)胞為12層；或卵丘細(xì)胞雖在3層或3層以上，但是不完整，部分為12層。C級(jí)：裸卵或卵丘細(xì)胞雖為12層或多層，但是不完整，部分裸露。2.3卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞采用微滴培養(yǎng)法.檢出的COCS用含體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的DPBS洗滌3次，然后用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，最后按實(shí)驗(yàn)設(shè)

41、計(jì)分別移入含有成熟培養(yǎng)液滴的直徑35mm培養(yǎng)皿中。每個(gè)液滴50L并覆蓋石蠟油，每滴放COCs1015枚。液滴預(yù)先在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡2h以上。成熟培養(yǎng)條件39,5%的CO2與飽和濕度，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2224 h。成熟培養(yǎng)液為見(jiàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。2.4各組卵母細(xì)胞的成熟觀察成熟24 h時(shí)，將各組卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體移入含O25透明質(zhì)酸酶的M199(Sigma，M4530)中，移液槍輕輕吹打移除卵丘細(xì)胞，體視鏡下用玻璃針撥動(dòng)卵母細(xì)胞檢查第一極體排出的情況(第一極體排出作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志)，并記錄各組成熟卵母細(xì)胞數(shù)與成熟率。3. 設(shè)計(jì)3.1 去除卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響先將包裹3層以上卵丘

42、細(xì)胞且包裹緊密的COCs隨機(jī)分為2組：A組, COCs經(jīng)機(jī)械吹打脫除卵丘細(xì)胞成為機(jī)械裸卵(Dos)，B組, 包裹卵丘細(xì)胞3層以上的且包裹緊密的卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體記為(COCs)，各自單獨(dú)培養(yǎng)。 3.2卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響根據(jù)包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞的完整性分為3組:A組，有3層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍的卵母細(xì)胞復(fù)合體記為(COCs)；B組，有3層卵丘細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞記為(COCs)；C組，有12層卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞記為(NOs)，3組分別放于一樣且適宜條件下培養(yǎng)。探索卵丘細(xì)胞層數(shù)的多少對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響的大小。4.分析與總結(jié)4.1去除卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響本

43、研究中將包裹5層以上卵丘細(xì)胞的COCs經(jīng)機(jī)械脫除卵丘細(xì)胞層后，其體外成熟與孤雌胚胎發(fā)育能力顯著低于正常的COCs，這與Geshi等試驗(yàn)結(jié)果類同。這可能是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞成熟過(guò)程中，卵丘細(xì)胞通過(guò)與卵母細(xì)胞間的緊密縫隙連接為卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育提供物質(zhì)和能量，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。Antezak等和Goud等提出卵泡液和卵丘細(xì)胞層可儲(chǔ)存和釋放某些生長(zhǎng)因子和特定蛋白，這些因子和蛋白在卵母細(xì)胞的成熟與胚胎發(fā)育過(guò)程中按一定順序或選擇性地發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的作護(hù)包裹在卵母細(xì)胞外的卵丘細(xì)胞層，以提高卵母細(xì)胞的體外成熟與后期胚胎發(fā)育的潛力。4.2 卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞層數(shù)

44、是影響卵母細(xì)胞成熟與后期胚胎發(fā)育的重要因素。酷等根據(jù)卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)綿羊進(jìn)行分類成熟培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)卵丘細(xì)胞包裹3層以上和包裹1-3層疏松卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞成熟率分別為824和806，其試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)卵母細(xì)胞體外成熟結(jié)果基本一致，這在一定程度上說(shuō)明卵丘細(xì)胞層包裹程度對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟后體外成熟率并沒(méi)有顯著的影響。不同類型COCs的孤雌胚胎發(fā)育能力卻不同，這可能是包裹卵丘細(xì)胞較少的卵母細(xì)胞在體外成熟后已有老化的趨勢(shì)，卵裂后發(fā)育至囊胚的能力下降，但包裹3層以上卵丘細(xì)胞與附帶FSP的COCs在體外成熟后孤雌激活時(shí)正處于發(fā)育的較佳時(shí)期，能夠很好的發(fā)育至囊胚期。本研究結(jié)果表明，包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞層的存在與其層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟和孤雌激活后胚胎發(fā)育的能力具有重要作用。本設(shè)計(jì)重點(diǎn)研究了卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的作用，初步篩選了有卵丘細(xì)胞和無(wú)卵丘細(xì)胞兩種情況下，卵母細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，并且進(jìn)一步研究卵丘細(xì)胞的不同形態(tài)對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響，為提高卵母細(xì)