靶向PCR CTC檢測(cè)技術(shù)

1、靶向PCR CTC檢測(cè)技術(shù)幫助臨床醫(yī)生更全面地評(píng)估肺癌Lung Cancer in Solid Tumor in China=？液態(tài)活檢液態(tài)活檢通過外周血中的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤基因組信息來評(píng)估腫瘤病理活檢病理活檢通過原發(fā)灶腫瘤組織來評(píng)估腫瘤 CTC ctDNA mircoRNA LNC RNAOthers 傳統(tǒng)的組織細(xì)胞學(xué)檢測(cè)液態(tài)活檢在肺癌中的應(yīng)用液態(tài)活檢在肺癌中的應(yīng)用治療策略事件肺癌待查輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)治療方案選擇療效評(píng)估耐藥機(jī)理新藥研發(fā)治療策略事件疑似肺癌輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)治療方案選擇耐藥機(jī)理新藥研發(fā)CTC的臨床應(yīng)用價(jià)值療效評(píng)估CTC(數(shù)量）(負(fù)

2、向富集+靶向PCR）ctDNA(基因變異）1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015什么是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（什么是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor CellCirculating Tumor Cell，CTCCTC）？）？腫瘤釋放如外周血中腫瘤釋放如外周血中CTCsCTCs數(shù)量的多少，數(shù)量的多少，可間接反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)可間接反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CTCCTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞和不具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞，均由原

3、發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell）CTC1CTCCTC有轉(zhuǎn)移有轉(zhuǎn)移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干細(xì)胞特征干細(xì)胞特征的DTC所形成的微形成的微轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移灶，逃避免疫識(shí)別逃避免疫識(shí)別才可能發(fā)展成為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細(xì)胞形成牙槽并侵襲周圍基質(zhì)CK+ cellsHER-2+ cells什么時(shí)候可以檢測(cè)到CTC？早期腫瘤外周血中即可檢出CTCW He, et al. Proc Natl Acad S

4、ci, 2007早期腫瘤外周血中即可檢出CTCl表達(dá)中等量FR的M109鼠肺癌細(xì)胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面l移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測(cè)到大約1.4個(gè)CTC細(xì)胞l移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測(cè)7個(gè)和18個(gè)CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升l在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象CTC富集技術(shù)密度與大小免疫磁珠（負(fù)向富集 or 陽性富集)微流體CTC檢測(cè)方法CTC檢測(cè)技術(shù)靶向PCR免疫熒光普通PCR=+“方法”“收獲”“垃圾”蟹餌沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集負(fù)向富集優(yōu)勢(shì)：回收率100%劣勢(shì)：純度略低正向富集

5、正向富集優(yōu)勢(shì)：純度高劣勢(shì)：回收率低（漏掉CTC）幸好沒貪嘴，我們逃了“方法”“收獲”“垃圾”沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集負(fù)向富集優(yōu)勢(shì)：回收率100%劣勢(shì)：純度略低大小富集（大小富集（ISETISET）優(yōu)勢(shì)：簡(jiǎn)單劣勢(shì)：漏掉小的CTC細(xì)胞幸好沒吃胖，我們逃了網(wǎng)篩CTC檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)原理負(fù)向富集負(fù)向富集靶向靶向PCRPCRFRFR陽性靶標(biāo)陽性靶標(biāo)肺癌細(xì)胞FR(葉酸受體）高度表達(dá)CTC：FR=1:50萬EMT轉(zhuǎn)化不影響FR豐度其他血細(xì)胞不表達(dá)FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自動(dòng)化靈敏度超高靈敏度超高，負(fù)向富集可滿足檢測(cè)要求信號(hào)二次放大，1個(gè)CTC信號(hào)放大1012倍無需人工經(jīng)驗(yàn)判讀，結(jié)果客

6、觀準(zhǔn)確可實(shí)現(xiàn)CTC的定量CTC檢測(cè)靶向PCR，信號(hào)放大，保證高度敏感性1個(gè)CTC信號(hào)放大1012倍CTC檢測(cè)優(yōu)勢(shì)一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細(xì)胞優(yōu)勢(shì)二：靶向探針特異性高優(yōu)勢(shì)三：PCR擴(kuò)增信號(hào)，確保高敏感性優(yōu)勢(shì)四：PCR儀判斷CTC技術(shù)，避免人為誤差3mL血1mL/3mL血3mL血1個(gè)CTC/3mL血50萬FR/1個(gè)CTC1個(gè)CTC/1slide100萬信號(hào)/1個(gè)FR1個(gè)信號(hào)/1個(gè)CTCFR靶向PCR 1個(gè)CTC細(xì)胞信號(hào)方法細(xì)胞免疫熒光 1個(gè)CTC細(xì)胞信號(hào)幾乎沒有放大Cell Search:正向富集+免疫熒光技術(shù)進(jìn)行捕獲和鑒定16EpCAM 上皮細(xì)胞粘附分子 APC 異藻藍(lán)蛋白熒光染料 CK 細(xì)胞

7、角蛋白 PE 藻紅蛋白熒光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料） 上皮細(xì)胞白細(xì)胞抗抗 EpCAM 磁流體磁流體EpCAM 抗原抗原CD45 抗原抗原CK 抗原抗原抗 CD45-APC 染料抗 CK-PE 染料熒光染料熒光染料EpCAM陰性細(xì)胞中，存在大量CTC Cell Research系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針 研究證實(shí)，EpCAM陰性的細(xì)胞中也存在CTCJiatao Lou, et al. Plos One 20132004Cell Search: 乳腺癌中檢測(cè)出，但肺癌敏感性低2011Cell Research: 采用的抗體采用的抗體(EpCA

8、M)對(duì)對(duì)EMT細(xì)胞特異性差細(xì)胞特異性差，而肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移入血需要EMT的過程3mL血6個(gè)小時(shí)得到報(bào)告檢測(cè)流程檢測(cè)流程肺癌領(lǐng)域，CTC檢測(cè)技術(shù)對(duì)比CytoploRare（格諾）CellSearchCyttelTM（北京萊爾）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy（武漢友之友)核心技術(shù)免疫磁珠負(fù)向富集靶向配體PCR技術(shù) 流式正向富集技術(shù)熒光標(biāo)記免疫磁珠負(fù)向富集、Fish技術(shù)ISET（濾膜）原位雜交RNA分析ISET（濾膜)熒光標(biāo)記特異性88%80%83%75%70%靈敏度80%30%腺癌：46%30%30%自動(dòng)化半自動(dòng)全自動(dòng)半自動(dòng)半自動(dòng)全自動(dòng)血樣體積3mL7.5mL4mL5mL10mL適

9、應(yīng)癥早、中和晚期早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌腫晚期癌腫早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未報(bào)道未報(bào)道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%報(bào)告時(shí)間6h/12樣本樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天可視化否否是是是是不同CTC計(jì)數(shù)對(duì)于肺癌診斷的特異性與敏感性CTCCTC計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)診斷肺癌敏診斷肺癌敏感性感性診斷肺癌特診斷肺癌特異性異性2.099.5%2.3%4.096.1%21.3%6.089.5%44.8%8.778.0%83.6%10.068.1%90.3%12.054.1%95.2%95.2%1

10、4.040.1%97.6%97.6%16.027.6%98.1%98.1%18.020.5%98.6%98.6%20.016.2%99.5%99.5%CTC對(duì)肺癌的診斷顯著優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物輔助診斷輔助診斷指標(biāo)指標(biāo)AUCAUC值值P P值值CTCCTC0.910.91P0.0001P0.0001CEA0.56NSE0.61CYFRA21-10.71SCCA0.49 CTC與一般腫瘤標(biāo)志物對(duì)肺癌診斷的準(zhǔn)確性（AUC值）單項(xiàng)CTC檢測(cè)的輔助診斷價(jià)值優(yōu)于多個(gè)一般腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合AUC=0.91, P16: 8/12（75%）患者）患者PR，DCR 100%l 8.7CTC16: PFS 448天天l 8.7CTC16: PFS 94天天Cut off為16cu/3ml, 高表達(dá)患者的PFS明顯優(yōu)于低表達(dá)者總結(jié) 靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)敏感度最高，反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)，可做為新一代腫瘤標(biāo)志物新一代腫瘤標(biāo)志物更