基因工程原理與技術(shù)思考題

1、Chapter I Introduction1) 什么是基因？基因有哪些主要特點(diǎn)？基因是一段可以編碼具有某種生物學(xué)功能物質(zhì)的核苷酸序列。不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ).基因是可以切割的?；蚴强梢赞D(zhuǎn)移的。多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系。遺傳密碼是通用的?；蚩梢酝ㄟ^復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。2) 翻譯并解釋下列名詞genetic engineering遺傳工程gene engineering基因工程：通過基因操作，將目的基因或DNA片段與合適的載體連接轉(zhuǎn)入目標(biāo)生物獲得新的遺傳性狀的操作。gene manipulation基因操作：對基因進(jìn)行分離、分析、改造、檢測、表達(dá)、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱。rec

2、ombinant DNA technique重組DNA技術(shù)gene cloning基因克隆：是指對基因進(jìn)行分離和擴(kuò)大繁殖等操作過程，其目的在于獲得大量的基因拷貝，在技術(shù)上主要包括載體構(gòu)建、大腸桿菌遺傳轉(zhuǎn)化、重組子篩選和擴(kuò)大繁殖等環(huán)節(jié)。molecular cloning分子克隆3) 什么是基因工程？簡述基因工程的基本過程？p2 p44) 簡述基因工程研究的主要內(nèi)容？p55) 簡述基因工程誕生理論基礎(chǔ)p2和技術(shù)準(zhǔn)備有哪些p3？6) 基因表達(dá)的產(chǎn)物中，氨基酸序列相同時(shí)，基因密碼子是否一定相同？為什么？否，密碼子簡并性7) 舉例說明基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。醫(yī)學(xué):人胰島素和疫苗農(nóng)業(yè):

3、抗蟲BT農(nóng)藥工業(yè):工程釀酒酵母Chapter The tools of trade1) 什么是限制性核酸內(nèi)切酶？簡述其主要類型和特點(diǎn)？是一種核酸水解酶，主要從細(xì)菌中分離得到。類型特點(diǎn)p11 2) II型核酸內(nèi)切酶的基本特點(diǎn)有哪些p12-14？簡述影響核酸內(nèi)切酶活性的因素有哪些p14？ 3) 解釋限制酶的信號(hào)活性？抑制星號(hào)活性的方法有哪些？4) 什么是DNA連接酶p15？有哪幾類p16？有何不同p16？5) 什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何應(yīng)用價(jià)值？同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)、切割位點(diǎn)均相同，來源不同。在載體構(gòu)建方面往往可以取得巧妙的應(yīng)用。應(yīng)用較多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它們均識(shí)別CC

4、CGGG，但前者切后產(chǎn)生鈍末端，后者切后產(chǎn)生粘性末端同尾酶：來源各異，識(shí)別序列各不相同，但切割后產(chǎn)生相同的粘性末端。由 同尾酶(isocaudomer)產(chǎn)生的 DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用彼此連接起來的。6) 什么是DNA聚合酶？根據(jù)DNA聚合酶使用的模板不同，可將其分為哪兩類？各有什么活性？p17-18聚合酶：在引物和模板的存在下，把脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。 依賴于DNA的DNA聚合酶 依賴于RNA的DNA聚合酶7) Taq DNA聚合酶：是一種從水生嗜熱菌中分離得到的一種耐熱的dna聚合酶，具有5-3聚合酶活性和3-5

5、外切酶活性，在分子中主要用于PCR。逆轉(zhuǎn)錄酶：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，8) Klenow片段的特性和用途有哪些？舉例說明。p179) 名詞解釋：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、甲基化酶: 甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主 DNA 不被相應(yīng)的限制酶所切割。10) 什么是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶？舉例說明其應(yīng)用之一。P19加p11) 什么是堿性磷酸酶？其在基因工程領(lǐng)域中有哪些用途？p19減p12) 質(zhì)粒單酶切點(diǎn)的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？目的基因片段與載體由相同的單一限制性核酸內(nèi)切酶消化酶切后，兩者的兩端均具有相同的黏性末端，成為單

6、酶切位點(diǎn)的黏性末端。 為了防止載體的自我環(huán)化，通常用堿性磷酸酶去除載體的粘性末端的5p以抑制DNA的自我環(huán)化。 若構(gòu)建表達(dá)載體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組，以便定向克隆。13) gap缺口和nick裂口的區(qū)別？14) 用寡核苷酸和銜接物DNA的短片段連接時(shí)為使基因內(nèi)部的切點(diǎn)保護(hù)，常用何種辦法解決？15) 哪些酶可用于DNA片段的末端標(biāo)記？KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在對 DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平反應(yīng)或末端的置換反應(yīng)時(shí)可 引入標(biāo)記的核苷酸。Chapter Host and vectors1) 根據(jù)來源和性質(zhì)不同，可將基因工程載體分為哪些

7、種類？質(zhì)粒載體、噬菌體載體、黏粒載體、噬菌粒載體、病毒載體、人工染色體2) 什么是克隆質(zhì)粒載體？什么是表達(dá)質(zhì)粒載體？什么是穿梭質(zhì)粒載體？ 克隆載體是指專用于基因或DNA片段無性繁殖的質(zhì)粒載體。表達(dá)質(zhì)粒載體是指專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。穿梭質(zhì)粒載體是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可以在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。3) 基因工程中對載體的基本要求? 具有復(fù)制子，能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自我復(fù)制。具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。具有合適的選擇標(biāo)基因。具有較多的拷貝數(shù)，易于宿主細(xì)胞的染色體DNA分開，便于分離提純。具有較小的相對分子質(zhì)量，

8、易于操作。4) 什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒分哪幾種？有哪兩種復(fù)制類型，質(zhì)粒的分子生物學(xué)特性有哪些？質(zhì)粒是染色體外能自我復(fù)制的小型DNA分子。嚴(yán)緊型和松弛型。不親和性轉(zhuǎn)移性5) 質(zhì)粒存在的三種形式是什么？ 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA線性DNA6) 解釋質(zhì)粒的不親和性和轉(zhuǎn)移性？不親和性：兩種不同質(zhì)粒不能夠在同一宿主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存。轉(zhuǎn)移性：質(zhì)粒從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的特性。接合型質(zhì)粒和非接合型質(zhì)粒。7) 接合性質(zhì)粒和非接合性質(zhì)粒有何區(qū)別？接合型質(zhì)粒：相對分子量大，除了攜帶自我復(fù)制遺傳信息外，還帶有一套控制細(xì)菌和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，嚴(yán)緊型質(zhì)粒。非接合型質(zhì)粒：相對分子量小，不能攜帶接合轉(zhuǎn)移基因。8) 理

9、想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備哪些條件？ 具有較小的相對分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。具有多個(gè)單一限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。具有兩種以上標(biāo)記基因。具有安全性。9) 簡述pBR322質(zhì)粒載體的主要特征？P2510) 構(gòu)建噬菌體載體的主要內(nèi)容有哪些？為什么野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?該如何改造？p28插入型和取代型 基因組大而復(fù)雜 11) 何為-互補(bǔ)，在載體構(gòu)建中有何作用？-互補(bǔ)：指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū) 段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半 乳糖苷酶（-galactosidase，由1024個(gè)氨基酸 組成）陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。-互補(bǔ)是基于 在

10、兩個(gè)不同的缺陷-半乳糖苷酶陰性的突變體之 間可實(shí)現(xiàn)的功能互補(bǔ)而建立的。  將缺失編碼第11-41位氨基酸的-半乳糖苷酶基 因稱為lacZM15基因而將半乳糖苷酶基因(lacZ)  的調(diào)控序列和編碼-半乳糖苷酶N端140個(gè)氨基酸 的序列稱為lacZ.這兩個(gè)基因的產(chǎn)物單獨(dú)存在時(shí) 都無酶學(xué)活性,但混合在一起時(shí)卻有酶學(xué)活性.所以 在載體上加lacZ/(MSC),并在受體菌中引入lacZ M15即可實(shí)現(xiàn)-互補(bǔ).IPTG是lac操縱子的誘導(dǎo) 物,底物X-gal被-半乳糖苷酶分解后可以產(chǎn)生藍(lán) 色.如果質(zhì)粒載體

11、中插入了外源DNA, lacZ的產(chǎn) 物則不能與lacZM15基因的產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)-互補(bǔ)，在 IPTG誘導(dǎo)下不能產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，菌 落便不可能呈現(xiàn)藍(lán)色。白色菌落便是含有插入了外 源DNA的重組質(zhì)粒。因此可利用菌落顏色變化來篩 選插入外源DNA的重組質(zhì)粒。  這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來篩選重組體。主 要是在載體的非必要區(qū)插入一個(gè)帶有大腸桿菌  -半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的  載體轉(zhuǎn)入lac的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）平板上形成白色的

12、噬  菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌斑。12) 將外源性DNA克隆到b-半乳糖苷酶失活的插入型入噬菌體上后，如何篩選重組噬菌體？13) 簡述單鏈DNA噬菌體M13在基因工程中的主要用途？14) 什么是Cos質(zhì)粒？簡述其基本特點(diǎn)。15) 什么是酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體、哺乳動(dòng)物人工染色體？從哺乳動(dòng)物中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒及著絲粒構(gòu)建載體可以克隆大于1000Kb的DNA16) 什么叫插入失活，舉例說明之。名稱來源特點(diǎn)用途M13噬菌體載體M13mp1是構(gòu)建的第一個(gè)M13噬菌體載體，隨后構(gòu)建的一系列M13載體都是在此基礎(chǔ)上經(jīng)改建派生出來的?？捎脕砜寺【哂胁煌拗颇┒说耐庠碊NA片段

13、，而且克隆片段插入方向是固定的。1.可以制備單鏈DNA進(jìn)行DNA序列分析。2.可以制備只與外源DNA的任意一條鏈互補(bǔ)的DNA探針。3.可以在寡核苷酸介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變來制備含有目的基因的單鏈DNA模板。黏粒載體（cosmid vector）先用特定的限制性核酸內(nèi)切酶局部消化真核生物的DNA，產(chǎn)生出高相對分子質(zhì)量的外源DNA片段，與經(jīng)同樣的限制性核酸內(nèi)切酶切割過的黏粒載體線性DNA分子驚醒體外連接反應(yīng)。1.具有噬菌體的體外包裝、高效感染特性。2.具有質(zhì)粒載體的易于克隆操作。3.具有高容量的克隆能力。4.具有與同源序列的智力進(jìn)行重組的能力。可以克隆外源DNA分子比較大的。酵母人工染色體由酵母的自主

14、復(fù)制序列、著絲粒、四膜蟲的端粒、以及酵母的選擇性標(biāo)記組成的能自我復(fù)制的酵母線性克隆載體。目前克隆最大DNA片段的載體。目前克隆最大DNA片段的載體。細(xì)菌人工染色體以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的細(xì)菌克隆載體。除去了F因子的轉(zhuǎn)移去及整合區(qū)等非復(fù)制必須片段，并引入了多克隆位點(diǎn)及選擇標(biāo)記BAC克隆容量可以達(dá)到300kb.可用于真核生物重要基因及全基因組物理作圖、重要性狀基因的圖位克隆、基因結(jié)構(gòu)及功能分析。Chapter The technical principle of genetic manipulation1) 簡述提取基因組DNA的主要步驟和原理？2) 分離純化質(zhì)粒的方法有哪幾種？簡述CsCl密度梯

15、度分離法、堿變性法的原理，如何選擇合適的分離方法？3) 簡述提取RNA常用的兩種方法和相關(guān)原理？4) 列舉三種常用的核酸檢測方法和基本原理？5) 簡述瓊脂糖-EB電泳法分離純化DNA的基本原理？6) 名詞解釋：分子雜交、核酸雜交探針7) 切口平移標(biāo)記探針的主要步驟有哪些？8) 簡述Southern印跡雜交的基本原理及其主要步驟？9) 簡述Northern印跡雜交的基本原理及其應(yīng)用？10) 簡述Western印跡的基本原理及其主要步驟？11) 簡述Sanger堿基順序分析法的基本原理？12) 簡述酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和在基因工程中的應(yīng)用？13) 簡述酵母單雜交技術(shù)的基本原理和操作過程？14)

16、 什么是噬菌體展示技術(shù)？簡述其基本操作過程？15) 什么是DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)？簡述其基本原理？16) 什么是DNase I足跡實(shí)驗(yàn)？簡述其基本原理？Chapter Polymerase Chain Reaction Technology and Application1) 什么是PCR技術(shù)？簡述其基本原理？2) 簡述PCR 反應(yīng)體系的主要成分與反應(yīng)流程？3) 簡述PCR引物設(shè)計(jì)的目的和一般原則？4) 簡述提高PCR反應(yīng)特異性的因素和措施？5) 什么是巢式PCR、降落PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR？它們分別有哪些應(yīng)用？6) 簡述熒光定量PCR的基本原理？為什么在定量PCR中要引入Ct值的概念？Chapt

17、er RNAi and miRNA regulation1) 什么是RNA干擾技術(shù)？2) 簡述利用RNA干擾技術(shù)沉默基因的基本原理和一般操作流程？3) 什么是siRNA？如何選擇siRNA靶位點(diǎn)？4) 簡述獲得siRNA的途徑有哪些？Chapter Obtaining of target gene1) 目的基因克隆時(shí)常用哪些方法分離和獲得基因？2) 什么是基因文庫？簡述構(gòu)建基因文庫常用的載體有哪些？3) 什么是基因組文庫？ 簡述構(gòu)建基因組文庫的一般步驟？4) 什么是cDNA文庫？簡述構(gòu)建cDNA文庫的主要步驟？5) 目的基因與載體的連接方法有哪些？各有哪些優(yōu)點(diǎn)？基因重組時(shí)在兩個(gè)酶切位點(diǎn)中其中有

18、一個(gè)不相匹配時(shí)，你如何解決連接問題？6) 如果目的基因的基因結(jié)構(gòu)中有內(nèi)含子存在，而且要采用原核表達(dá)系統(tǒng)，你應(yīng)如何分離克隆基因？Chapter Recombination and gene transfer 1) cDNA克隆較之基因組克隆的優(yōu)越性體現(xiàn)在哪里?2) 試述T-A克隆法的原理和用途？3) 基因工程宿主菌必需具備哪些特性？4) 名詞解釋：受體細(xì)胞、感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)5) 簡述將重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞的方法有哪些？6) 簡述將重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞導(dǎo)的方法有哪些？7) 外源基因?qū)胫参锏姆椒ǎ?) Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)？Ti 質(zhì)粒介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)移的過程？Chapter Scre

19、ening and identification of recombinant clones 1) 如何從所克隆到的基因重組載體中鑒定目的基因的存在和正確性2) 重組子的篩選與鑒定主要有哪些方法？3) 重組子的遺傳學(xué)檢測法主要包括哪兩類？4) 簡述根據(jù)載體表型特征進(jìn)行重組子篩選的常用方法及其基本原理？5) 如何利用抗性標(biāo)記基因篩選陽性克?。?) 名詞解釋：插入失活效應(yīng)7) LacZ 基因通常用于構(gòu)建質(zhì)粒載體的目的和原理？如何利用LacZ標(biāo)記基因篩選陽性克?。?) 報(bào)告基因檢測法篩選重組子對報(bào)告基因有哪些基本要求?舉例說明重用的報(bào)告基因有哪幾種？Chapter Expression of cloning gene1) 大腸桿菌作為基因工程受體菌有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？2) 實(shí)現(xiàn)真核基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的正確表達(dá)需要哪些基本條件？3) 名詞解釋：啟動(dòng)子、終止子、SD序列、包涵體4) 蛋白質(zhì)包含體復(fù)性的方法有哪些？5) 可使外源基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)