基因工程第八章克隆基因的表達

1、人粒細胞集落刺激因子 Lac啟動子遺傳信息從遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)到蛋白質(zhì)的傳遞過程的傳遞過程中心法則中心法則（central dogma）。）。 外源基因在宿主細胞中表達。外源基因在宿主細胞中表達。外源基因外源基因表達載體表達載體重組載體重組載體導入宿主細胞導入宿主細胞在宿主細胞中在宿主細胞中 表達出蛋白質(zhì)表達出蛋白質(zhì)提取蛋白提取蛋白宿主細胞：宿主細胞：原核細胞或真核細胞。原核細胞或真核細胞。用原核生物作宿主。用原核生物作宿主。A dividing E. coli 原核或噬菌體啟動子原核或噬菌體啟動子MCSSD序列序列終止子終止子識別原核細胞的識別原核細胞的啟動子啟動子，催化所有的，催化所

2、有的RNA合成。合成。數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個表達的協(xié)同單位。成一個表達的協(xié)同單位。2. 以操縱子為單位以操縱子為單位1. 只有一種只有一種RNA多聚酶多聚酶有意義鏈有意義鏈5 反意義鏈反意義鏈3 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA5 3 翻譯翻譯蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)NC5 3 4. 不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5. 調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。原核生物中起始密碼子原核生物中起始密碼子AUG上游上游712個核個核苷酸序列因其與苷酸序列因其與16SrRNA 3末端反向互補末端反向互補而被認為在核糖體而被認為在核糖體-

3、mRNA的結(jié)合過程中起的結(jié)合過程中起作用，叫作用，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列。6. mRNA具有具有核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點SD序列序列 外源基因不能帶有內(nèi)含子。外源基因不能帶有內(nèi)含子。2. 真核生物不能用基因組真核生物不能用基因組DNA ，必須用，必須用cDNA 。3. 必須利用原核細胞的調(diào)控元件（啟動子等）必須利用原核細胞的調(diào)控元件（啟動子等）4. 防止外源基因產(chǎn)物對宿主細胞的毒害。防止外源基因產(chǎn)物對宿主細胞的毒害。是是DNA上的能與上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。 大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致大腸桿菌的所

4、有啟動子中都有兩段一致順序（順序（consensus sequence）。 1. 啟動子啟動子-35 Box 和和 -10 Box（1） 啟動子序列啟動子序列 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACA TATAAT 轉(zhuǎn)錄起始位點轉(zhuǎn)錄起始位點17bp5 核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點RNA聚合酶聚合酶 亞基的識別位點亞基的識別位點 。核糖體結(jié)合位點（核糖體結(jié)合位點（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上與核糖體上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。結(jié)合的序列。ribosome binding sitemRN

5、A 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCAS-DS-D序列距離序列距離AUGAUG的距離也影響翻譯的距離也影響翻譯AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）位于位于SD序列下游。序列下游。全酶是一個全酶是一個5 5聚體，含有兩個聚體，含有兩個小亞基小亞基，和，和2 2兩個大亞基（兩個大亞基（和和），一個），一個亞基。亞基。 大腸桿菌只有一種類型的大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和和mRNA。（1 1）結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu)內(nèi)終止子內(nèi)終止子 intrinsic terminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有位置有一段

6、一段反向回文順序反向回文順序，其后緊接一串，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。在表達載體克隆位點的下游一般設(shè)計一在表達載體克隆位點的下游一般設(shè)計一段轉(zhuǎn)錄終止子。段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動子啟動子操縱子操縱子S-D序列序列目的基因目的基因終止子終止子由于莖環(huán)由于莖環(huán)3段緊接一串段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。延續(xù)。 反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了數(shù)

7、降低，整個減弱了RNA 與與DNA的互作的互作 莖環(huán)結(jié)構(gòu)莖環(huán)結(jié)構(gòu) 多聚多聚A/UA/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊折疊mRNAmRNA折疊折疊 U CU CC C U GU GGCGCAUAUCGCGCGCGGCGCCGCGCGCGGCGCA A A A CCCAC UUUU3 CCCAC UUUU3 DNARN

8、A聚合酶聚合酶脫落脫落大腸桿菌偏愛大腸桿菌偏愛UAA。一般安置上。一般安置上全部的三個全部的三個終止密碼終止密碼UAA，UAG，UGA，防止核糖體跳防止核糖體跳躍（躍（skipping）。）。Translation enhancer能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。中的表達效率的特殊序列。T7噬菌體基因噬菌體基因10前導序列（簡稱前導序列（簡稱g10-L序列）序列）; 大腸桿菌大腸桿菌atpE基因基因mRNA5-UTR（非翻譯區(qū)）（非翻譯區(qū)）中富含中富含U的區(qū)段。的區(qū)段。 必須是一種強啟動子必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細

9、胞能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的總蛋白的10%-30%以上。以上。 應呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄應呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄便于表達毒性蛋白等。便于表達毒性蛋白等。應是可誘導型的應是可誘導型的用溫度或化學試劑誘導。用溫度或化學試劑誘導。來自大腸桿菌的來自大腸桿菌的乳糖操縱子。乳糖操縱子。用乳糖或其類似用乳糖或其類似物物IPTG充當誘導充當誘導物，與阻遏蛋白物，與阻遏蛋白結(jié)合，解除抑制。結(jié)合，解除抑制。Plac O目的基因目的基因四聚體的四聚體的阻遏物阻遏物單體的阻遏物單體的阻遏物阻遏物作用區(qū)阻遏物作用區(qū) CAP作用區(qū)作用區(qū) cAMP +CRP= CAPRNA聚合酶作用區(qū)聚合酶作用區(qū)組成：組成：長度

10、：長度：205bp的的HaeIII片段片段 （包括（包括-半乳糖苷酶的前半乳糖苷酶的前8個密碼）。個密碼）。IPTGIPTG有毒、昂有毒、昂貴貴Sigma 636.00元元 /gIPTG =異丙基硫異丙基硫代代-D半乳糖半乳糖 人粒細胞集落刺激因子 人粒細胞集落刺激因子 重組大腸桿菌染色體 trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1P2啟動子；啟動子；O操縱基因；操縱基因； 衰減子衰減子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。色氨酸合成相關(guān)基因色氨酸合成相關(guān)基因5個，編碼個，編碼3種酶。種酶。trpRP1O trpEt

11、rpDP2trpCtrpB trpA鄰氨基苯甲鄰氨基苯甲 酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油 硼酸合成酶硼酸合成酶色氨酸色氨酸 合成酶合成酶 鏈鏈 鏈鏈 分支酸分支酸鄰氨基鄰氨基 苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基 鄰氨基苯甲酸鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘 油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄（P1P1是主要啟動子，是主要啟動子，P2P2的作用只有的作用只有3%3%。）。）沒有色氨酸沒有色氨酸時，阻遏蛋白不能與操縱基因時，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。苯氨基磷酸脫氧核酮糖苯氨基磷酸脫氧核酮糖 trpRP1O trpEtrpD

12、P2trpCtrpB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸結(jié)合結(jié)合不轉(zhuǎn)錄不轉(zhuǎn)錄用于表達載體的用于表達載體的trp啟動子一般還附帶操縱基因、啟動子一般還附帶操縱基因、和部分和部分trpE基因?；颉1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸有色氨酸時，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與時，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與操縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)操縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)錄。錄。 （色氨酸稱為（色氨酸稱為corepressor輔阻遏物）輔阻遏物）是從是從 噬菌體中得到的一類啟動子，比噬菌體中得到的一類啟動子，比lac啟動啟動子的活性高子的活性高8-10倍，比倍，比trp啟動子活性高。啟

13、動子活性高。 cIII NPL/OLcI PMOR/PRCro PEcIIN:抗終止蛋白；抗終止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的）；裂解必需的）；cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；阻遏蛋白； P:啟動子；啟動子；O:操縱子。操縱子。R:右；右；L:左左cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII阻遏物阻遏物轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄當當cI合成后，與合成后，與OL和和OR結(jié)合阻止結(jié)合阻止RNA聚合聚合酶，則左右基因都受到抑制。但促進酶，則左右基因都受到抑制。但促進PM使使cI進一步轉(zhuǎn)錄。進入溶原期。進一步轉(zhuǎn)錄。進入溶原期。 早期左邊早期左邊早期右邊早期右

14、邊表達載體常用的噬菌體啟動子是表達載體常用的噬菌體啟動子是PL。調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因cI 則是選擇了一個溫度敏感性的則是選擇了一個溫度敏感性的突變基因突變基因cI857。 整合在宿主基因組里，或克隆到載體上。整合在宿主基因組里，或克隆到載體上。44-45oC時阻遏蛋白失活，外源基因大量轉(zhuǎn)錄時阻遏蛋白失活，外源基因大量轉(zhuǎn)錄PL外源基因外源基因32oC時阻遏時阻遏PL，外源基因不轉(zhuǎn)錄。，外源基因不轉(zhuǎn)錄。1. 細胞質(zhì)中表達細胞質(zhì)中表達（1）包涵體（）包涵體（inclusion body）是存在于細胞質(zhì)中的一種是存在于細胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白不溶性蛋白質(zhì)質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物

15、。形成原理未知。形成原理未知。例：例：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞不損害寄主細胞回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。 缺點缺點 優(yōu)點優(yōu)點（1）周質(zhì)（）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結(jié)構(gòu)部分。的細胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)的復雜蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)的復雜機理目前不完全清楚機理目前不完全清楚優(yōu)點：優(yōu)點： 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。被降解的少。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-

16、內(nèi)酰胺酶（內(nèi)酰胺酶（lactamase）、）、 腸毒素（腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等 大腸桿菌的信號肽：大腸桿菌的信號肽：能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達周質(zhì)。但以后需能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。要正確切割掉。（2）信號肽（）信號肽（signal peptide）一般位于一般位于N N端。端。鼠源鼠源RNase、人生長激素信號肽。、人生長激素信號肽。也能在細菌中起作用。也能在細菌中起作用。胡蘿卜歐氏桿菌的胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。蛋白。金黃色葡萄球菌的蛋白金黃色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶 （endoglucan

17、ase）。）。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。太理想。用用溶血素溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；融合蛋白；溶血素溶血素(hemolysin)是一種可使紅血球細胞溶解的毒是一種可使紅血球細胞溶解的毒素素(cytolytic toxin)。在許多病原菌被證明與致病相關(guān)。在許多病原菌被證明與致病相關(guān)。 使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白分分泌到細胞外泌到細胞外的培養(yǎng)基中。的培養(yǎng)基中。或與細菌素釋放蛋白（或與細菌素釋放蛋白（b

18、acteriocin release protein)共表達。共表達。載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG優(yōu)點優(yōu)點1. 非融合型表達載體非融合型表達載體產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細胞體內(nèi)的蛋產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點：缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。哈佛大學的哈佛大學的Gilbert實驗室建立的。實驗室建立的。表達能力強。表達能力強。組成結(jié)構(gòu)：組成結(jié)構(gòu)： 強啟動子強啟動子: tac（trp-lac）:trp的的-35區(qū)

19、區(qū)lacUV5的的-10區(qū)區(qū)lac操縱基因操縱基因操縱基因：操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。乳糖操縱子系統(tǒng)。終止子：終止子：調(diào)節(jié)基因：調(diào)節(jié)基因：Lac I宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。 如如JM105菌。菌。rrnB（rRNA操縱子的強終止子）操縱子的強終止子）S-D插入位點區(qū)插入位點區(qū)S-D序列和插入位點區(qū)：序列和插入位點區(qū)：tac PLac O S-D 插入位點區(qū)插入位點區(qū)rrnB T宿主宿主lac I載體的其余部分：載體的其余部分：來自來自pBR322質(zhì)粒。質(zhì)粒。表達誘導物：表達誘導物： IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）（乳糖的類似物，不會被降解）阻遏物阻

20、遏物IPTG必須選擇一個有必須選擇一個有l(wèi)acI的宿主菌。的宿主菌。條件：條件：載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。質(zhì)中。如：如：pIN III系列：系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）組成結(jié)構(gòu)）組成結(jié)構(gòu)Ipplac P lac O S-D/ATG ompa 插入位點插入位點Ipp（脂蛋白基因啟動子）和（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。啟動子。調(diào)節(jié)基因：調(diào)節(jié)基因：lac I S-D序列和起始密碼序列和起始密碼

21、ATG。 分泌信號肽：分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。插入位點區(qū)（多克隆位點）。插入位點區(qū)（多克隆位點）。 強啟動子：強啟動子：以以pBR322為為基礎(chǔ)構(gòu)建的?；A(chǔ)構(gòu)建的。 調(diào)節(jié)基因不必調(diào)節(jié)基因不必借助于宿主的借助于宿主的lacI.表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。體上的菌體蛋白連接在一起的。啟動子：啟動子：tac 操縱基因：操縱基因：lacP 調(diào)節(jié)基因：調(diào)節(jié)基因：lacI S-D序列序列（1）優(yōu)點）優(yōu)點（2）組成結(jié)構(gòu)）組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。便于融合蛋白的分離和純化。lacItac lac

22、O S-D/ATG GST 插入位點插入位點 TGAlacPori：pBR322 ori 融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST融合蛋白用融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖凝谷胱甘肽瓊脂糖凝膠膠(Glutathione Sepharose)親和層析柱親和層析柱分分離純化。離純化。用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從因子可以把外源蛋白從谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶GST上切下來。上切下來。柱（柱（column） GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶 外源蛋白外源蛋白柱（柱（column） GSTGST洗脫洗脫柱（柱（column）可再利用可再利用插入?yún)^(qū)：插入

23、區(qū)：pGEX-1 TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG A

24、TC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子因子pGEX-2X的插入?yún)^(qū)：的插入?yún)^(qū)：pGEX-3X的插入?yún)^(qū)：的插入?yún)^(qū)：Sma ISma IHis-tag（組氨酸標簽）：（組氨酸標簽）：在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6個組氨酸個組氨酸（His）。）。His-tag序列可與帶二價正電的陽離子相序列可與帶二價正電的陽離子相螯，螯，His-tag能與能與Ni2+ +柱柱結(jié)合，但很容易結(jié)合，但很容易被被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可（或咪唑

25、溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。以純化蛋白質(zhì)。溴化氰溴化氰Cyanogen bromide：由于半乳糖苷酶可以和其底物類似物ABTG結(jié)合，但不能使之分解，因此可以ABTG為配體進行親和層析純化融合蛋白。 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）1. 啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響RNA聚合酶聚合酶 亞基的識別位點亞基的識別位點（1）一致順序）一致順序間隔為間隔為17bp時，啟動子最強。時，啟動子最強。（3） -35區(qū)和區(qū)和-10區(qū)的堿基順序區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動子越強。越接近一致順序，啟動子越強。5-T

26、TGACA TATAAT 一致順序一致順序lactrp PL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box5-AGGAGGU-3 S-D序列后面的序列后面的4個堿基：個堿基： 如果是如果是A（T）, 翻譯效率最高；翻譯效率最高； 如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。（1）S-D序列序列？AUG左側(cè)的三個堿基也有影響。左側(cè)的三個堿基也有影響。 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA

27、中：中： AUG左側(cè)如果是左側(cè)如果是UAU或或CUU時，最時，最為有效；為有效； 如果是如果是UUC、UCA或或AGG時下降時下降20倍。倍。3. 啟動子與外源基因之間的距離啟動子與外源基因之間的距離轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須不會轉(zhuǎn)錄非必須基因基因，不必浪費源量和能量、不會干擾正常，不必浪費源量和能量、不會干擾正常的表達。的表達。增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達效率。數(shù)目。增加表達效率。5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響外源蛋白

28、在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響但過度的外源基因的表達會影響宿主的正常生長。但過度的外源基因的表達會影響宿主的正常生長。 選擇強啟動子序列，如選擇強啟動子序列，如tac 等等2. 調(diào)整調(diào)整S-D序列與序列與AUG堿的距離堿的距離距離過長或過短都影響真核基因的表達。距離過長或過短都影響真核基因的表達。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為一般為5-9bp。能提高翻譯的起始效率。能提高翻譯的起始效率。4. 增加增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重復性基因

29、外重復性基因外回文序列回文序列”能防止能防止mRNA受到受到35外外切酶的攻擊。切酶的攻擊。5. 減輕宿主細胞的代謝負荷減輕宿主細胞的代謝負荷合理地調(diào)節(jié)代謝負荷與外源基因高效表合理地調(diào)節(jié)代謝負荷與外源基因高效表達的關(guān)系。達的關(guān)系。將宿主生長代謝與外源基因表達分開。將宿主生長代謝與外源基因表達分開。（1）誘導表達）誘導表達 一般采用溫度誘導或藥物誘導。一般采用溫度誘導或藥物誘導。cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL啟動子，啟動子，外源基因不表達，宿主大量生長。外源基因不表達，宿主大量生長。32C:42C:cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL啟動子啟動，外啟動子啟動，外源基因高水

30、平表達，宿主生長受到限源基因高水平表達，宿主生長受到限制。制。cI857PL外源基因外源基因PO調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。始終產(chǎn)生阻遏物。無無IPTG:阻遏物與阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。有有IPTG:阻遏物與阻遏物與IPTG結(jié)合，結(jié)合，lac操縱基因解操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。抑制。將宿主的生長與載體的復制分開。將宿主的生長與載體的復制分開。當宿主大量當宿主大量生長后生長后，再誘導載體質(zhì)粒的

31、，再誘導載體質(zhì)粒的復制，增加拷貝數(shù)。復制，增加拷貝數(shù)。當需要宿主大量當需要宿主大量生長時生長時，抑制載體質(zhì)，抑制載體質(zhì)粒的復制。粒的復制。C37CN末端：由原核基因編碼一段多肽，末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。這是避免被降解的最好措施。這是避免被降解的最好措施。質(zhì)粒基因產(chǎn)物質(zhì)粒基因產(chǎn)物 目的基因產(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割切割6. 提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。 ZUV5載體載體:lac ZG AATTCCTTAA G外源基因外源基因 Z2載體載體:lac ZGGG AATTCCCCTTAA

32、 G外源基因外源基因 Z3載體載體:lac ZGG AATTCCCTTAA G外源基因外源基因提供三種融合插入閱讀框。提供三種融合插入閱讀框。使用次黃嘌呤核苷（使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。減少宿主菌的蛋白酶合成。 大腸桿菌的大腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶基因突變也減少蛋白酶的降解作用。的降解作用。 T4噬菌體的噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細菌的蛋基因產(chǎn)物能抑制細菌的蛋白酶?？砂寻酌??？砂裵in增加到載體上。增加到載體上。減少宿主菌本身的蛋白酶的表達。減少宿主菌本身的蛋白酶的表達。細胞質(zhì)細胞質(zhì)外膜外膜內(nèi)膜內(nèi)膜周間質(zhì)周間質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒染色體染色

33、體“外排外排”： 蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。 “分泌分泌”： 蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。位于位于N端，一般為端，一般為15-30aa 。真核與原。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似核的結(jié)構(gòu)相似, 功能相似，可以互換。功能相似，可以互換。 堿性氨基酸堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)疏水氨基酸核心區(qū)切割位點切割位點Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號肽酶信號肽酶外源蛋白外源蛋白 有信號肽。有信號肽。 細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制。細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制。真核細胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中真核細胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表

34、達；很好地分泌表達； 但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。信號肽酶信號肽酶I、信號肽酶、信號肽酶II等近等近20多種多種蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)的參與。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)內(nèi)內(nèi)有與有與分泌相關(guān)的分泌相關(guān)的aaaa 序列。序列。 為蛋白指明目的地。為蛋白指明目的地。colE ori lacI intein CBD MCS T7Promotor AmprM13 ori rop 維持拷貝數(shù)維持拷貝數(shù)pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12 幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域1. pTYB1，pTYB2: intein在在C端端內(nèi)含肽內(nèi)含肽內(nèi)含肽內(nèi)含肽內(nèi)含肽內(nèi)含肽內(nèi)含肽內(nèi)含肽

35、內(nèi)含肽內(nèi)含肽Intein與與Chitin柱結(jié)合柱結(jié)合DTT(二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇)或或-巰基乙醇或半巰基乙醇或半胱氨酸能夠誘導內(nèi)含肽胱氨酸能夠誘導內(nèi)含肽Intein的自我的自我裂解活性裂解活性單柱一步純化蛋白。單柱一步純化蛋白。無需蛋白酶作用即可將無需蛋白酶作用即可將目的蛋白從融合蛋白分目的蛋白從融合蛋白分離離 IPTG誘導的誘導的T7啟動子啟動子分離純化出天然蛋白，分離純化出天然蛋白，不帶有載體蛋白殘基。不帶有載體蛋白殘基。分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異構(gòu)酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。構(gòu)酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。1. 形成正確的二硫鍵形成正確的二

36、硫鍵 抗體分子抗體分子人血紅蛋白分子人血紅蛋白分子亞鐵血紅素如信號肽、內(nèi)含肽（如信號肽、內(nèi)含肽（intein）等序列的切割。）等序列的切割。（1 1）O-糖基化（糖基化（Ser, Thr）糖基糖基（2）N-糖基化（糖基化（Asn）Dol：長醇：長醇Mannose：甘露糖：甘露糖Glucose：葡萄糖：葡萄糖 N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖甲基化、羰基甲基化、羰基化、磷酸化、化、磷酸化、乙?；?、硫酸乙?；⒘蛩峄?、丙烯酸化、化、丙烯酸化、豆冠酸化、軟豆冠酸化、軟脂化脂化羥脯氨酸羥脯氨酸甲基組氨酸甲基組氨酸羥賴氨酸羥賴氨酸羧基谷氨酸羧基谷氨酸缺乏蛋白質(zhì)的加缺乏蛋白質(zhì)的加工。工。 （

37、如糖基化、氨（如糖基化、氨基酸修飾等）?；嵝揎椀龋＝湍妇?、植物原生質(zhì)體、動物培養(yǎng)細胞等。酵母菌、植物原生質(zhì)體、動物培養(yǎng)細胞等。真核或病毒啟動子真核或病毒啟動子 MCS PolyA信號信號 終止子終止子外源基因外源基因 能在能在E.coli中克隆和擴增。中克隆和擴增。1. 酵母克隆載體酵母克隆載體Leu2+ +、His+ +、Ura3+ +、Trp1+ +; 有合適的克隆位點。有合適的克隆位點。 有酵母的選擇標記有酵母的選擇標記Ori 有有大腸桿菌的選擇標記大腸桿菌的選擇標記Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast)

38、cells由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段（選片段（選擇標記）構(gòu)成。擇標記）構(gòu)成。ColE1 酵母酵母Leu 2+ +如如 PYeleu10:轉(zhuǎn)化率低（轉(zhuǎn)化率低（110轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/微克微克DNA）。）。載體上只有細菌的復制區(qū)，沒有載體上只有細菌的復制區(qū)，沒有酵母的自主復制區(qū)。酵母的自主復制區(qū)。可與受體細胞的染色體可與受體細胞的染色體DNA同源重組，同源重組，隨染色體一起復制。隨染色體一起復制。不能在酵母細胞中自主復制不能在酵母細胞中自主復制整合到酵母的染色體上整合到酵母的染色體上不能從酵母細胞中提取載體。不能從酵母細胞中提取載體。由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的由大腸桿菌質(zhì)粒和酵

39、母的DNA片斷片斷(選擇標記選擇標記和酵母和酵母DNA自主復制順序自主復制順序ARS）構(gòu)成。）構(gòu)成。大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒 酵母酵母ARS 酵母選擇標記酵母選擇標記 ARS（automously replicating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守區(qū)保守區(qū)轉(zhuǎn)化率高（轉(zhuǎn)化率高（102-103轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/微克微克DNA) 。不穩(wěn)定，容易丟失。不穩(wěn)定，容易丟失?？蓮拇竽c桿菌和酵母中提取質(zhì)粒?？蓮拇竽c桿菌和酵母中提取質(zhì)粒。既能在大腸桿菌中復制，又能在酵母既能在大腸桿菌中復制，又能在酵母細胞中自主復制。細胞中自主復制。穿梭載體（穿梭載體（shuttle vec

40、tor）在在YRp質(zhì)粒中插入酵母染色體的質(zhì)粒中插入酵母染色體的著絲粒著絲粒區(qū)區(qū)。特點：特點：YRp質(zhì)粒質(zhì)粒 酵母著絲粒酵母著絲粒不易從細胞中提取。不易從細胞中提取。行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。 單拷貝存在。單拷貝存在。由大腸桿菌質(zhì)粒、由大腸桿菌質(zhì)粒、2 m質(zhì)粒質(zhì)粒及酵母染色體及酵母染色體DNA選擇標記構(gòu)成。選擇標記構(gòu)成。 大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒酵母選擇標記酵母選擇標記 2 m質(zhì)粒質(zhì)粒如如pYF92:pBR3222 m酵母酵母his 3+ +釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長度是釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長度是2 m 。含有自主。含有自主復制起始區(qū)復制起始區(qū)ori和和STB序列（使質(zhì)粒在

41、供體中維序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。持穩(wěn)定）。(1)它們是封閉環(huán)狀的雙鏈它們是封閉環(huán)狀的雙鏈DNA分子，周長約分子，周長約2m(6kb左左右右)，以高拷貝數(shù)存在于酵母細胞中，每個單倍體基因，以高拷貝數(shù)存在于酵母細胞中，每個單倍體基因組含組含60-100個拷貝，約占酵母細胞總個拷貝，約占酵母細胞總DNA的的30%； (2)各含約各含約600bp長的一對反向重復順序；長的一對反向重復順序； (3)由于反向重復順序之間的相互重組，使由于反向重復順序之間的相互重組，使2m質(zhì)粒質(zhì)粒 在在細胞內(nèi)以兩種異構(gòu)體細胞內(nèi)以兩種異構(gòu)體(A和和B)形式存在。形式存在。 (4)該質(zhì)粒只攜帶與復制和重組有關(guān)的該質(zhì)粒只

42、攜帶與復制和重組有關(guān)的4個蛋白質(zhì)基因個蛋白質(zhì)基因(REP1、REP2、REP3和和FLP)，不賦予宿主任何遺傳表，不賦予宿主任何遺傳表型，屬型，屬隱蔽性質(zhì)粒隱蔽性質(zhì)粒。2 m質(zhì)粒特點質(zhì)粒特點很高的轉(zhuǎn)化活性（很高的轉(zhuǎn)化活性（103-105轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/微克微克DNA）。）?？截悢?shù)多（拷貝數(shù)多（25-100拷貝拷貝/細胞）。細胞）。 比比YRp穩(wěn)定。穩(wěn)定。2 m oripMB1 oriLeu- - 酵母酵母原生質(zhì)體原生質(zhì)體感受態(tài)感受態(tài)酶去壁酶去壁CaCl2、 PEG整合到染色體上，整合到染色體上， 或獨立在酵母細胞內(nèi)或獨立在酵母細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化Leu營養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型缺陷型 培養(yǎng)基培養(yǎng)基篩選篩選轉(zhuǎn)化子克

43、隆生長轉(zhuǎn)化子克隆生長酵母載體酵母載體大腸桿菌大腸桿菌提取提取插入外源基因插入外源基因鑒定克隆鑒定克隆發(fā)酵表達發(fā)酵表達外源基因產(chǎn)物外源基因產(chǎn)物分離、純化分離、純化 （1）優(yōu)點）優(yōu)點 對其遺傳學和生理學的研究比較深入。對其遺傳學和生理學的研究比較深入。 小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應器中都能生長。小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應器中都能生長。 已經(jīng)分離出很強的啟動子。已經(jīng)分離出很強的啟動子。 有有翻譯后的加工翻譯后的加工。 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的純本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的純 化。化。 安全性高（安全性高（FDA確認的安全生物），不確認的安全生物），不 需要宿主的安全性檢驗。需要宿主的安全性檢驗。美國食

44、品和藥物管理局(Food and Drug Administration)簡稱FDA 常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。 重組蛋白常常超糖基化重組蛋白常常超糖基化表達量普遍低。表達量普遍低。每個每個N-寡糖鏈上含有寡糖鏈上含有100多個甘露糖，多個甘露糖，分泌困難。分泌困難。正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有8-138-13個甘露糖。個甘露糖。分泌型蛋白有時會留在分泌型蛋白有時會留在壁膜壁膜間隙，間隙，（1）細胞質(zhì)內(nèi)表達）細胞質(zhì)內(nèi)表達 例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表達：在酵母中表達：超氧化物超氧化物H+ +H2O2H2O過氧化物酶過氧化物酶表達出的表達出的SOD修

45、飾正確：修飾正確：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉， 第二個氨基酸丙氨酸也被乙?；５诙€氨基酸丙氨酸也被乙?；OD(SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) )宿主：宿主： 亮氨酸合亮氨酸合成缺陷型成缺陷型酵母。酵母。GAPD： 甘油醛磷甘油醛磷酸脫氫酶酸脫氫酶在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。糖基化。 需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。方法：方法：在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類型因子配類型因子a1的前導肽，與重組蛋白的的前導肽，與重組蛋白的N端通過端通過Ly

46、s(賴氨酸）賴氨酸）-Arg（精氨酸）（精氨酸）相連。相連。前導肽（前導肽（leader peptide）：）：蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時，酵母菌的蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶內(nèi)切蛋白酶識別這個切點信號，把重識別這個切點信號，把重組蛋白正確切下來。組蛋白正確切下來。前導肽前導肽 Lys-Arg 重組蛋白（水蛭素）重組蛋白（水蛭素）內(nèi)切蛋白酶內(nèi)切蛋白酶（1 1）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表達乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表達在大型發(fā)酵反應器中容易生長；在大型發(fā)酵反應器中容易生長； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇時，表達的有甲醇時，表達的乙醇氧化

47、酶乙醇氧化酶高達胞內(nèi)高達胞內(nèi)總蛋白的總蛋白的40%！嗜甲醇酵母（嗜甲醇酵母（Pichia pastoris）的特點）的特點HBsAg: 乙肝表面抗原?？梢宰鳛橐呙纭Ｒ腋伪砻婵乖?。可以作為疫苗。 Aox1啟動子：啟動子：乙醇氧化酶基因乙醇氧化酶基因1啟動子（受甲醇激活調(diào)控）。啟動子（受甲醇激活調(diào)控）。 His4：組氨酸合成所需的：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶組氨酸脫氫酶基因?；颉?Aox1啟動子和啟動子和3-aox1：整合到特定染色體的位點序列。：整合到特定染色體的位點序列。誘導物：甲醇。誘導物：甲醇。產(chǎn)量：產(chǎn)量： 9106劑疫苗劑疫苗/240L發(fā)發(fā)酵罐。酵罐。乙肝表面抗原乙肝表面抗原乙肝表面

48、抗原乙肝表面抗原作為飼料作為飼料添加劑促添加劑促進反芻動進反芻動物消化。物消化。產(chǎn)量：產(chǎn)量：10L，200h連續(xù)發(fā)連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)出酵產(chǎn)出50g溶菌酶。溶菌酶。乙醇氧化酶乙醇氧化酶基因基因1乙醇氧化酶基因乙醇氧化酶基因11. 桿狀病毒（桿狀病毒（Baculovirus）廣泛侵染包括許多昆蟲在內(nèi)的無脊椎動物。廣泛侵染包括許多昆蟲在內(nèi)的無脊椎動物。（1）侵染周期：）侵染周期：兩種形式兩種形式單獨病毒粒子形式單獨病毒粒子形式病毒病毒 粒子粒子宿主細胞宿主細胞病毒病毒 粒子粒子侵染侵染釋放釋放病毒病毒 粒子粒子宿主細胞宿主細胞侵染侵染宿主細胞宿主細胞侵染侵染合成多合成多角體蛋白角體蛋白裂解裂解釋放釋放多面體

49、溶解多面體溶解一般使用苜蓿銀紋夜蛾細胞核型多角體病毒一般使用苜蓿銀紋夜蛾細胞核型多角體病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）感染后感染后36-48h，病毒開始合成大量的，病毒開始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白。多角蛋白的啟動子特別強。多角蛋白的啟動子特別強。 多角蛋白基因可以被替換掉而不影響多角蛋白基因可以被替換掉而不影響 病毒的繁殖。病毒的繁殖。多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面體

50、。成多面體。通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。源自草地夜蛾的細胞株，在這種細胞中，源自草地夜蛾的細胞株，在這種細胞中，多角蛋白的多角蛋白的啟動子特別活躍啟動子特別活躍。（1 1）轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒，插入兩段，插入兩段AcMNPV序列以供同源重組。序列以供同源重組。桿狀病毒的基因組太大（桿狀病毒的基因組太大（13kb環(huán)狀環(huán)狀DNA），），不能直接插入。不能直接插入。必須使用同源重組的辦法。必須使用同源重組的辦法。多角蛋白的啟動子和終止子及多角蛋白的啟動子和終止子及polyA加加尾信號。尾信號。啟動子與終止子之間插入多克隆位點啟動

51、子與終止子之間插入多克隆位點 轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因 轉(zhuǎn)移載體與野生型轉(zhuǎn)移載體與野生型AcMNPV DNA共同轉(zhuǎn)共同轉(zhuǎn)染宿主細胞染宿主細胞 轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換 外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中 重組病毒侵染宿主重組病毒侵染宿主4-5天后即可收獲重天后即可收獲重組蛋白。組蛋白。桿狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內(nèi)表達外桿狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內(nèi)表達外源蛋白，成為源蛋白，成為“低成本蛋白工廠低成本蛋白工廠”。 2222只粉只粉蚊夜蛾幼蟲蚊夜蛾幼蟲4 4天后表達的人腺苷酸脫氫酶占幼天后表達的人腺苷酸脫氫酶占

52、幼蟲總蛋白的蟲總蛋白的2%-5%2%-5%。共產(chǎn)出。共產(chǎn)出9mg9mg很純的產(chǎn)物。很純的產(chǎn)物。（1）壽命短）壽命短感染感染4-5天后宿主細胞裂解或幼蟲死亡。天后宿主細胞裂解或幼蟲死亡。（2）共同轉(zhuǎn)染率低）共同轉(zhuǎn)染率低重組率更低。重組率更低。0.1%-1%。利用利用AcMNPV的一個早期基因的一個早期基因IE1的啟動子。的啟動子。 IE1基因的轉(zhuǎn)錄不依賴于病毒的其他基因產(chǎn)基因的轉(zhuǎn)錄不依賴于病毒的其他基因產(chǎn)物，而且在昆蟲細胞中表達正常。物，而且在昆蟲細胞中表達正常。 把外源把外源基因插入到基因插入到IE1啟動子和啟動子和IE1終止子之間。終止子之間。構(gòu)成整合型載體。構(gòu)成整合型載體。 載體轉(zhuǎn)染宿主細

53、胞后隨載體轉(zhuǎn)染宿主細胞后隨即整合到宿主染色體上，實現(xiàn)外源蛋白的持即整合到宿主染色體上，實現(xiàn)外源蛋白的持續(xù)表達。續(xù)表達。載體載體IE1啟動子啟動子外源基因外源基因IE1終止子終止子載體載體根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時這種質(zhì)粒會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤），所以稱時這種質(zhì)粒會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤），所以稱此質(zhì)粒為此質(zhì)粒為Ti質(zhì)粒（質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）。）。環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相當于細菌染色體的相當于細菌染色體的3%-5%）。）。 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移DNA，編碼

54、冠癭堿的合成，能隨機整，編碼冠癭堿的合成，能隨機整合到植物的染色體上。長度一般為合到植物的染色體上。長度一般為12-24kb，是是Ti質(zhì)粒最重要的部分。質(zhì)粒最重要的部分。左邊界左邊界右邊界右邊界生長素生長素 基因基因細胞分裂細胞分裂 素基因素基因冠癭堿冠癭堿 合成合成生長素基因生長素基因:iaaM（tms1）和）和iaaH（tms2）編碼合成）編碼合成吲哚吲哚乙酸乙酸（植物生長激素）的酶（植物生長激素）的酶iaaM: 色氨酸色氨酸-2-單加氧酶單加氧酶iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶色氨酸色氨酸吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚乙酸吲

55、哚乙酸t(yī)mr（ipt）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶, 催化：催化：二磷酸異戊烯（二磷酸異戊烯（IPP）異戊烯酰嘌呤單異戊烯酰嘌呤單磷酸（磷酸（IPA）5-AMPiaaM: 色氨酸色氨酸-2-單加氧酶單加氧酶章魚堿（章魚堿（octopine)胭脂堿（胭脂堿（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg與丙酮酸縮合成與丙酮酸縮合成Arg與與 酮戊二醛縮合成酮戊二醛縮合成農(nóng)桿堿（農(nóng)桿堿（agropine）冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來的，冠癭堿是在冠癭瘤

56、內(nèi)合成并分泌出來的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠癭堿。微生物都不能利用冠癭堿。Glu 谷氨酸谷氨酸的二環(huán)糖衍生物。的二環(huán)糖衍生物。決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和T-DNA的的轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移， 進入和整合進入和整合。毒性基因（毒性基因（vir）的產(chǎn)物能誘導）的產(chǎn)物能誘導Ti質(zhì)粒產(chǎn)生質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫質(zhì)粒脫離后，可與離后，可與vir的產(chǎn)物的產(chǎn)物VIR D2蛋白結(jié)合，并蛋白結(jié)合，并在在VIR D4和和VIR B蛋白的幫助下穿過農(nóng)桿菌蛋白的幫助下穿過農(nóng)桿菌內(nèi)

57、膜、外膜、壁和植物細胞壁、細胞膜及核內(nèi)膜、外膜、壁和植物細胞壁、細胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。膜，最后整合到植物染色體上。單鏈的單鏈的3和和5端分別是端分別是左邊界左邊界和和右邊界右邊界區(qū)區(qū)域，含有域，含有25bp重復序列，參與整合。重復序列，參與整合。章魚堿代謝基因和胭脂堿代謝基因：章魚堿代謝基因和胭脂堿代謝基因： 不相容性基因不相容性基因控制控制Ti質(zhì)粒的不相容性。質(zhì)粒的不相容性。分別編碼代謝這兩種冠癭堿分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長。的酶。維持農(nóng)桿菌生長。（1）第一步）第一步:植物受傷植物受傷植物受傷后能分泌植物受傷后能分泌酚類化合物酚類化合物（如乙（如乙酰丁香酮、

58、酰丁香酮、 羥基乙酰丁香酮），誘導羥基乙酰丁香酮），誘導Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的毒性基因表達毒性基因表達。（1）第二步）第二步 感染植物感染植物（3）第三步）第三步 毒性基因（毒性基因（vir）表達）表達T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過量的生長上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過量的生長素和細胞分裂素，形成植物冠癭瘤。素和細胞分裂素，形成植物冠癭瘤。農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔ＾r(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。在莖的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步）第四步 T-DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移T-DNA被被vir基因產(chǎn)物切下來，并運送到植基因產(chǎn)物切下來，并運送到植物細胞核里，整合到植物基因組

59、中。物細胞核里，整合到植物基因組中。（5）第五步）第五步 誘導冠癭瘤誘導冠癭瘤（6）第六步）第六步 土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。乙酰丁香酮、乙酰丁香酮、 羥基乙酰丁香酮羥基乙酰丁香酮根據(jù)所編碼的冠癭堿（根據(jù)所編碼的冠癭堿（opine），分為），分為（1）章魚堿（）章魚堿（octopine)型質(zhì)粒型質(zhì)粒（3）農(nóng)桿堿（）農(nóng)桿堿（agropine）型質(zhì)粒）型質(zhì)粒裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子葉裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子葉植物（玉米）。植物（玉米）。（1）能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。）能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。 （2）能轉(zhuǎn)化多種植物。）能轉(zhuǎn)化多種植物。 （3）

60、強啟動子）強啟動子5. Ti質(zhì)粒作為載體的可能性質(zhì)粒作為載體的可能性T-DNA的的opine合成酶基因上有一個強合成酶基因上有一個強啟動子，能啟動外源基因的表達。啟動子，能啟動外源基因的表達。（1）分子量太大（）分子量太大（200kb）?。?（2）限制性酶切位點太多。）限制性酶切位點太多。 （3）被轉(zhuǎn)化的植物細胞成為腫瘤，不能）被轉(zhuǎn)化的植物細胞成為腫瘤，不能 再分化。再分化。 （4）在大腸桿菌中不能復制。）在大腸桿菌中不能復制。（4）冠癭堿合成對于植物無意義。應剔除掉。）冠癭堿合成對于植物無意義。應剔除掉。（5）加入大腸桿菌的加入大腸桿菌的ori和選擇標記和選擇標記。（6）加上真核生物的）加