實驗二超氧化物歧化酶的活性測定

1、超氧化物歧化酶的活性測定 酶工程實驗二酶工程實驗二實驗背景實驗背景按按金屬輔基成分的不同可分成金屬輔基成分的不同可分成3種類型種類型 ： 銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD) 藍綠色 存在于真核細胞的細胞質(zhì)中，在高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi) 以及線粒體膜間隙 錳離子(Mn-SOD) 粉紅色 存在于真核細胞的線粒體和原核細胞中，以及植物的葉綠體基質(zhì)和 類囊體膜上 Fe-S0D 黃色或黃褐色 存在于原核細胞中，近來發(fā)現(xiàn)有一些真核藻類甚至某些高等植物中 也有存在。 實驗原理實驗原理SOD的活力測定方法 : 化學法:黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學發(fā)光法，腎上腺素法，N BT-還原法，光化學擴增法，Cy

2、te還原法等 免疫法 等電點聚焦法 本實驗采用鄰苯三酚自氧化法鄰苯三酚自氧化法 鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應開始后反應液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結(jié)果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時間成線性關(guān)系，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長出有強烈光吸收。當有SOD存在時，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過計算即可求出SOD的酶活性。 實驗原理實驗原理酶活力單位定義： 在25恒溫條件

3、下，每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。試劑和器材試劑和器材1、試劑（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 稱取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右， 用HCl調(diào)節(jié)pH =8.20（用pH計校正），最后定容至100mL。（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L鄰苯三酚 稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。（4）SOD樣液試劑和器材試劑和器材1、試劑（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 稱取Tris 0.61g，EDT

4、A-2Na 0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右， 用HCl調(diào)節(jié)pH =8.20（用pH計校正），最后定容至100mL。（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L鄰苯三酚 稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。（4）SOD樣液試劑和器材試劑和器材2、器材（1）恒溫水浴槽（2）紫外分光光度計（3）試管、刻度吸管、微量注射器方法和步驟方法和步驟 1、鄰苯三酚自氧化速率的測定 取兩支試管按下表加入25預熱過的緩沖液,然后加入預熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325n

5、m波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。 方法和步驟方法和步驟 試劑空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.020.0150 mmol/L鄰苯三酚-0.01方法和步驟方法和步驟 2、SOD樣液的活性測定 樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。方法和步驟方法和步驟 試劑空白管（mL）樣品管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.02-SOD樣液-0.015