分子生物學(xué)第五章---DNA分子基本操作技術(shù)

1、第五章第五章 DNADNA分子基本操作技術(shù)分子基本操作技術(shù)1220132013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 北京時(shí)間10月7日下午5點(diǎn)30分，美國、德國三位科學(xué)家詹姆斯-E.羅斯曼、蘭迪-W.謝克曼及托馬斯-C.蘇德霍夫因在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸系統(tǒng)領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)而獲得今年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。諾獎(jiǎng)委員會(huì)說，三人發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞囊泡交通的運(yùn)行與調(diào)節(jié)機(jī)制。3 膜融合的發(fā)現(xiàn)表明蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間進(jìn)行傳遞，細(xì)胞可以用這一過程來阻止它們的活動(dòng)并且避免混亂。這一突破性發(fā)現(xiàn)解釋了為什么胰島素釋入血液時(shí)會(huì)有變化、神經(jīng)細(xì)胞之間的信息傳達(dá)，以及病毒感染細(xì)胞的方式。4 生物體內(nèi)細(xì)胞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)有賴于讓

2、合適的分子在合適的時(shí)間抵達(dá)合適的位置。一部分分子，如胰島素，需要被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞之外，而其他分子則需要被在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行運(yùn)輸。細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的分子被包裹于囊泡之中（圖中藍(lán)色表示），但是這些囊泡具體是如何達(dá)成這種精準(zhǔn)的運(yùn)輸?shù)?？這一點(diǎn)一直沒有被理解。5 Randy W. Schekman發(fā)現(xiàn)基因控制下的蛋白質(zhì)在這種囊泡運(yùn)輸機(jī)制中起到重要作用。正如這里的圖上所展示的那樣，通過對比正常酵母菌細(xì)胞（左）和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制缺陷的細(xì)胞（右），他成功識(shí)別出操控這一轉(zhuǎn)運(yùn)過程的基因。6 James E. Rothman發(fā)現(xiàn)一種蛋白質(zhì)化合物（圖中橘色表示）可以讓囊泡實(shí)現(xiàn)與目標(biāo)細(xì)胞膜的融合。囊泡上的蛋白質(zhì)物質(zhì)會(huì)與目標(biāo)細(xì)胞膜上的特定蛋

3、白質(zhì)之間發(fā)生結(jié)合，從而讓囊泡可以在正確的位置上釋放其所運(yùn)載的特殊“分子貨物”。7 Thomas C. Sdhof研究了大腦中神經(jīng)細(xì)胞之間是如何互相傳遞信號的，以及鈣離子在這一過程中所起的作用。他識(shí)別出一種分子機(jī)制（圖中用紫色表示），其可以對進(jìn)入的鈣離子發(fā)生反應(yīng)并觸發(fā)囊泡融合，從而解釋了囊泡輸運(yùn)機(jī)制中時(shí)間的精確性是如何達(dá)成的，以及其所攜帶的信號分子物質(zhì)是如何能做到受控釋放。8約翰約翰. .戈登戈登 山中伸彌山中伸彌獲獎(jiǎng)理由：獲獎(jiǎng)理由：發(fā)現(xiàn)成熟細(xì)胞可被重編程變?yōu)槎嗄苄?20122012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第五章第五章 DNADNA分子基本操作技術(shù)分子基本操作技術(shù)10從20世

4、紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。11本章內(nèi)容本章內(nèi)容 第一節(jié) 核酸凝膠電泳技術(shù) 第二節(jié) 核酸分子雜交 第三節(jié) PCR 第四節(jié) 轉(zhuǎn)化 第五節(jié) 基因組文庫構(gòu)建 第六節(jié) RNA操作技術(shù) 第七節(jié) 基因克隆12 一、常規(guī)電泳 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 二、脈沖凝膠電泳第一節(jié)第一節(jié) 核酸凝膠電泳技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)13一、常規(guī)電泳一、常規(guī)電泳自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核

5、酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視?；驹恚荷锎蠓肿釉谝欢╬H條件下，通常會(huì)帶電荷。將其放置到電場中，就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強(qiáng)度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)。根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種

6、成分彼此分離。14 在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。大分子量的DNA移動(dòng)的慢小分子量的DNA移動(dòng)的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔1516171、瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝

7、膠電泳是一種簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖 低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為6265，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等181 1）凝膠濃度選擇）凝膠濃度選擇瓊脂糖濃瓊脂糖濃度度(%)線型線型DNA分子的分分子的分離范圍離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍19 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越

8、高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 2 2）電泳緩沖液）電泳緩沖液 常用三種緩沖液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀 TAE：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價(jià)陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解201010TBETBE緩沖液的配制緩沖液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH應(yīng)為8.08.2 臨用時(shí)

9、用水稀至0.5TBE（20倍稀釋）213 3）核酸電泳的指示劑）核酸電泳的指示劑 指示劑：溴酚蘭二甲苯青 溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠濃度膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率遷移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb22核酸電泳的指示劑核酸電泳的指示劑 二甲苯青：水溶液呈蘭色 電泳時(shí)，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率遷移率2Kb1.6Kb234 4）載樣緩沖液）載樣緩沖液 指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液 作用：增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電

10、泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便24 溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖 凝 膠 電 泳 中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。255 5）核酸電泳的染色劑）核酸電泳的染色劑在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidium bromide，簡稱EtBr）染料對核酸分子進(jìn)行染色，然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNADNA分子發(fā)出熒光分

11、子發(fā)出熒光26瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間27稱樣溶解加熱制板倒膠6 6）核酸電泳操作基本程序）核酸電泳操作基本程序28取樣點(diǎn)樣電泳檢測核酸電泳操作基本程序核酸電泳操作基本程序29結(jié)果結(jié)果30根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小31Agarose gel electrophoresis322 2、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長度僅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分離33聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙

12、烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個(gè)堿基對到1000個(gè)堿基對之間34聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N，N，N，N一四甲基乙二胺）和過硫酸銨（AP）的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠 聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的351 1）不同濃度丙烯酰胺和）不同濃度丙烯酰胺和DNADNA有效分離范圍有效分離范圍 丙烯酰胺丙烯酰胺（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）溴酚蘭溴酚蘭*二甲苯青二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0

13、604004516012.040200307015.025150156020.0101001245362 2）材料）材料 電泳儀器： 電泳儀 垂直電泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亞甲基雙丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml裝于棕色瓶內(nèi)，4可保存二個(gè)月372）材料）材料 10%過硫酸銨 過硫酰銨，1克，加水至 10 ml4可保存一周，-20可保存一個(gè)月 1TBE電泳緩沖液 TEMED（四甲基乙烯基二胺）383 3）聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳）聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 配膠：根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃

14、板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出 將裝好的玻璃電泳板傾斜成4560角 按表配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù) 加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止39 立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì) 室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1TBE緩沖液40 小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則

15、 將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡41 接好電極，電壓為1-8V/cm，進(jìn)行電泳 電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，1530min后取出水洗，紫外儀下觀察結(jié)果 聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng以上量的DNA條帶（要求更高的靈敏度，可用銀染）4243電泳結(jié)果分析電泳結(jié)果分析 DNA MarkerDNA Marker DNA DNA 人工片段人工片段 100 bp ladder100 bp ladder44酶切分析酶切分析 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶

16、切 酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段 此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究4546PCR-RFLP46二、脈沖凝膠電泳二、脈沖凝膠電泳(PFGE)(PFGE) 普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。超過一定大小的線狀DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（50Kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，在常規(guī)電泳凝膠中彼此擠壓，形成單一DNA遷移帶。1984年Schwartz和Cantor首次利用脈沖凝膠電脈沖凝膠電泳（泳（pulsed-field gel electrophoresi

17、s, PEGE ）解決了這一問題。4748PFGE PFGE 工作的基本原理工作的基本原理PFGE PFGE 工作的基本原理工作的基本原理 這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場周期性交替進(jìn)行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時(shí)間取決于它的大小，小分子小分子DNA比大分子比大分子DNA更容易在凝膠中重新定位更容易在凝膠中重新定位，因而遷移速度更快。該法可分離長至10Mb的DNA分子。B+A-+A-B49A-+AB-+B正交交變電泳凝膠電泳(OFAGE)電場逆轉(zhuǎn)凝膠電泳(FIGE)夾角等值均一電場(CHEF)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+PEGE類型50影響PFGE分辨率

18、的因素1、脈沖時(shí)間（脈沖時(shí)間（0.1s-1000s）：）：增加脈沖時(shí)間分離較大分子，減少脈沖時(shí)間分離較小分子。2、電壓：、電壓：若固定脈沖時(shí)間，增加電場強(qiáng)度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致較小片段泳動(dòng)的紊亂。3、電場夾角：、電場夾角：電場方向的夾角常為110O - 120O，研究證實(shí)90O夾角也非常有效。4、溫度：、溫度：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖電泳基本在室溫進(jìn)行，PFGE一般應(yīng)在4進(jìn)行。較高的溫度DNA泳動(dòng)較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動(dòng)截留和明顯的條帶變寬。51第二節(jié)第二節(jié) 核酸分子雜交核酸分子雜交核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（Cavnegie Ins

19、titute of Washington）的Roy Britten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。 52核酸的分子雜交核酸的分子雜交 將帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。53 不同溫度下DNA的構(gòu)型變化一54 不同溫度下DNA的構(gòu)型變化二55 雜種核酸分子：雜種核酸分子： 彼此退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，而形成的雙鏈分子。 DNA/DNA的雜交作用 檢測

20、特定生物有機(jī)體之間的親源關(guān)系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。56一、核酸雜交常用幾種膜的性能比較一、核酸雜交常用幾種膜的性能比較571 1、硝酸纖維素膜、硝酸纖維素膜 不能滯留小于150bp的DNA片段，不能同RNA結(jié)合。 改進(jìn)：應(yīng)用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對小片段DNA的滯留能力。 RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。58 尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： 1. 核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細(xì)管作用 2. 印跡雜交： 將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的DNA/RNA進(jìn)行雜交。

21、592 2、SouthernSouthern（薩瑟恩）（薩瑟恩）DNADNA印跡印跡雜交雜交 根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E. Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫Southern DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。 60SouthernSouthern印跡分析基本流程印跡分析基本流程濾紙NC膜凝膠濾紙電泳電泳 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 雜交，顯影雜交，顯影酶切酶切DNADNA樣品上樣樣品上樣 DNADNA印跡印跡重物緩沖液61雜交模式

22、圖雜交模式圖放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交62Southern 雜交(Southern bloting)的主要步驟 待測DNA樣品的制備、酶切 待測DNA 樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳 凝膠中DNA的變性：堿變性 Southern轉(zhuǎn)膜： 硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜 毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法 探針的制備 Southern雜交 雜交結(jié)果的檢測6364（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的同探針同源雜交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝膠轉(zhuǎn)移凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)雜交技

23、術(shù)656667Southern DNA Southern DNA 印跡雜交之印跡雜交之X X光顯像圖片光顯像圖片 水稻（水稻（Oryza sativa LOryza sativa L.) .)的葉綠體的葉綠體DNADNA分別用核酸內(nèi)切限制酶分別用核酸內(nèi)切限制酶Bgl(A-C)Bgl(A-C)、BamHBamH（D-FD-F）、）、EcoREcoR（G-IG-I）、和）、和HindHind（J-LJ-L）消化，加樣在含有）消化，加樣在含有EtBrEtBr染料的染料的1%1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同3232P P標(biāo)記的玉米標(biāo)記的玉米psbApsbA探

24、針作探針作SouthernSouthern雜交。雜交。X X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶 ，表明含有水稻的，表明含有水稻的psbApsbA基因序列?；蛐蛄?。68Southern BlottingSouthern Blotting的過程的過程1.1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNADNA2.2.通過電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的通過電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的DNADNA3.3.固定膠中的固定膠中的DNADNA4.4.預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測）預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測）5.5.結(jié)果檢測結(jié)果檢測69 在理想條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射

25、自顯影技術(shù)在理想條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每帶電泳條帶僅含有，即便每帶電泳條帶僅含有2ng的的DNA也能被清晰地檢測出來。由于放射也能被清晰地檢測出來。由于放射性同位素對人體的危害，近年來又發(fā)展了熒光法檢測雜交信號的技術(shù)性同位素對人體的危害，近年來又發(fā)展了熒光法檢測雜交信號的技術(shù)，雖，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實(shí)驗(yàn)變得更為安全。然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實(shí)驗(yàn)變得更為安全。常用的熒光染料：常用的熒光染料：C5、C3等等703 3、諾賽恩、諾賽恩RNARNA印跡技術(shù)（印跡技術(shù)（Northern Northern blottingblotti

26、ng）1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northern blotting）。 而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Western blotting）。71 1、Northern blot基本原理和基本過程與 Southern blot基本相同 2、用于鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測樣

27、品為總RNA或mRNA72Northern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點(diǎn)印跡的不同點(diǎn) 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保 持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳 中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，Southern 印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理 3、靶核酸為RNA73Step 1. Antibody Recognitionof target protein/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color Development744 4、斑點(diǎn)

28、印跡雜交和狹線印跡雜交、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交 斑點(diǎn)印跡雜交（dot blotting）和狹線印跡雜交（slot blotting ）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的兩種類似的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)于核酸樣品的定量檢測。75 1、斑點(diǎn)印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀 3、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個(gè)樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量76斑點(diǎn)印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交 將RNA或DNA直接點(diǎn)樣

29、于NC膜或尼龍膜上，可做半定量分析 優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、可同時(shí)檢測多個(gè)樣品 一張膜上可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。 DNA斑點(diǎn)雜交 RNA斑點(diǎn)雜交 完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交7778（1 1）DNADNA斑點(diǎn)雜交：斑點(diǎn)雜交： 先將膜在水中浸濕，再放到15SSC中。 將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每個(gè)樣品一般點(diǎn) 5l(210g DNA)。 將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?（2 2）

30、RNARNA斑點(diǎn)雜交：斑點(diǎn)雜交：與上法類似，每個(gè)樣品至多加10g總RNA（經(jīng)酚/ 氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5l DEPC水，加5l 甲醛/SSC緩沖液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然 后取5-8l點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。（3 3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類似檢測細(xì)菌菌落的方法，可以對細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)

31、本，因?yàn)樗辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。 794 4、菌落雜交、菌落雜交也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。 鑒定重組子。80檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)81821）定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA

32、雜交83 保持組織細(xì)胞的形態(tài) 對核酸無抽提、修飾與降解作用 不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蔽作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定 2）雜交過程：（1）組織或細(xì)胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：84（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理 去垢劑（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì) 組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時(shí)間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落85（3）探針的選擇與標(biāo)記 以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 探針的長度一般為50300bp ,有時(shí)達(dá)1.5kb 放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號

33、檢測時(shí)間長 非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察86（4）雜交 雜交液體積?。?020l cDNA和RNA探針雜交溫度約為50 雜交時(shí)間:DNA探針雜交為24h.RNA探針雜交過夜 雜交前一般將組織切片置95 515分鐘使DNA變性 沖洗溫度一般 不超過50 87（5）雜交結(jié)果檢測 所用探針為核素標(biāo)記,放射自顯影檢測 所用探針為非核素標(biāo)記,比色或化學(xué)發(fā)光檢測8889直接法熒光原位雜交原理89熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）90 5 5、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/DNA/DNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/RNA/RNA雜交技術(shù)雜交技術(shù)91又叫D

34、NA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay），也稱作Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。 原理： DNA與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時(shí)遷移率的降低。92凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖放射性標(biāo)記的放射性標(biāo)記的DNADNA由于同一種細(xì)胞蛋白質(zhì)由于同一種細(xì)胞蛋白質(zhì)B B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動(dòng)速度變結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，在放射自

35、顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合93 不僅可以用來鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 而且可以研究發(fā)生此種結(jié)合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標(biāo)記競爭DNA）94(a)(b) (c) 在凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，探針DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶

36、消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。蛋白質(zhì)與未蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的競爭標(biāo)記的競爭DNA結(jié)合結(jié)合凝膠電泳凝膠電泳放射自顯影放射自顯影蛋白質(zhì)與標(biāo)蛋白質(zhì)與標(biāo)記的探針記的探針DNA結(jié)合結(jié)合95 可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 1. 用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子 2. 在競爭DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。96 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂驹隗w內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的有關(guān)信息，但無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。而足跡實(shí)驗(yàn)可以解決這個(gè)問題97

37、足跡實(shí)驗(yàn)足跡實(shí)驗(yàn)（footprintingfootprinting assay assay） 是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。9832p1 5 101 5 101 4 8 101 4 8 10加入蛋白質(zhì)X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510A BA B足跡足跡(a)(c)(b)DNaseI DNaseI 足跡實(shí)驗(yàn)足跡實(shí)驗(yàn)99 如果使用較大的DNA片段，通過足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)一樣，我

38、們也可以加入非標(biāo)記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。 100 硫酸二甲酯（DMS）足跡實(shí)驗(yàn)： DMS能使裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，六氫吡啶會(huì)對甲基化的G殘基作特異的化學(xué)切割。 而與蛋白結(jié)合的DNA片段上的G殘基，不會(huì)被DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在具這些G殘基末端的DNA片段，出現(xiàn)了空白區(qū)。101甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（methyltion interference assaymethyltion interference assay）根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異

39、切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計(jì)出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，即甲基化干擾實(shí)驗(yàn)。這種技術(shù)可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局限性是，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。 102凝膠電泳凝膠電泳和和1034 4、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)me硫酸二甲酯分離分離DNA并用并用六氫吡啶切割六氫吡啶切割應(yīng)用甲基化保護(hù)作用進(jìn)行的體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甲基化保護(hù)作用進(jìn)行

40、的體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)104105基因芯片發(fā)展歷史基因芯片發(fā)展歷史106轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)107基因芯片技術(shù)流程 一、PCR技術(shù)原理 二、PCR技術(shù)主要類型 三、PCR技術(shù)主要應(yīng)用第三節(jié)第三節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)108Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬乃至千百萬倍。一、一、PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理109（一）（一）PCRPCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史DNA

41、的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長110PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物111PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

42、35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶112PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明19711971年，年，KhoranaKhorana提出：經(jīng)過提出：經(jīng)過DNADNA變變性，與合適引物雜交，用性，與合適引物雜交，用DNADNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆克隆tRNAtRNA基因?；颉５捎跍y序和引物合成的困難，以但由于測序和引物合成的困難，以及及7070年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克

43、隆基因成為可能，所以，隆基因成為可能，所以，KhoranaKhorana的的設(shè)想被人們遺忘了設(shè)想被人們遺忘了113PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明19851985年，美國年，美國PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人發(fā)明了聚等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNADNA復(fù)制復(fù)制最初采用最初采用E-coliE-coli DNA DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行PCRPCR，由于該酶，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱耐熱DNAD

44、NA聚合酶的應(yīng)用使得聚合酶的應(yīng)用使得PCRPCR能高效率的進(jìn)行，能高效率的進(jìn)行，隨后隨后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一臺(tái)公司推出了第一臺(tái)PCRPCR自動(dòng)化熱循自動(dòng)化熱循環(huán)儀環(huán)儀19931993年，年，MullisMullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)114 PCR的發(fā)明人，一般公認(rèn)是穆里斯（K. Mullis），他獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。穆里斯在許多作品中，包括1990年在科學(xué)美國人上的一篇文章，及1998年的自傳心靈裸舞（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR這個(gè)構(gòu)想的起源。115“頓悟頓悟” 那是在

45、1983年春天的一個(gè)周五晚上，他開車帶著女友前往鄉(xiāng)間的小屋度周末。在蜿蜒的鄉(xiāng)間公路上開著車，一段DNA反復(fù)復(fù)制的景像，在他的腦海里冒了出來。穆里斯原以為這樣簡單的想法，應(yīng)該有人提出過，但搜索文獻(xiàn)后卻發(fā)現(xiàn)沒有。116PCRPCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明 PCRPCR的發(fā)明是的發(fā)明是DNADNA操作技術(shù)的革命操作技術(shù)的革命 美國美國MullisMullis教授教授 開汽車時(shí)的聯(lián)想開汽車時(shí)的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路逶迤崎嶇的山路 行駛的汽車行駛的汽車 19881988年發(fā)明了年發(fā)明了PCRPCR技術(shù)技術(shù) 19931993年獲諾貝爾年獲諾貝爾獎(jiǎng)獎(jiǎng)117118 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)

46、重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。119 國內(nèi)復(fù)旦大學(xué) 1988 年起開始研制耐熱性多聚酶，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬立人教授等在 1989 年研制成功了 PCR 自動(dòng)裝置，并且不斷推陳出新，最近研制的PTC51A/B 型 DNA 熱循環(huán)儀體積小，造型美觀，價(jià)格適宜，操作簡單，尤為適宜國內(nèi)應(yīng)用。120 PCR 發(fā)明不到 10 年，卻已獲得廣泛應(yīng)用。目前，每年都有上千篇文章 發(fā)表。1991 年，期刊“PCR 方法與應(yīng)用”（PCr Methods and Application）在美國創(chuàng)刊，使有關(guān)學(xué)者有了自己的論壇和參考的專業(yè)期刊。PCR 技術(shù)作為一種

47、方法學(xué)革命，必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各有關(guān)學(xué)科的研究，使其達(dá)到一個(gè)新的高度。121 1993 年度諾貝爾化學(xué)將已于 10 月 13 日揭曉，Kary Mullis 因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得此殊榮。現(xiàn)在世界各地都在使用 PCR 檢測病人血液中的微量遺傳物質(zhì)，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路。瑞典皇家科學(xué)院說：“PCR 方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中。該方法同 DNA 測序法結(jié)合起來很可能將成為研究動(dòng)植物分類學(xué)的一種革新工具?！币幻幽么蠹茖W(xué)家Michael Smith 因開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變”的方法而與 Mullis 同享此榮。122引物引物引物引物123()40

48、50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20124125（二）（二）PCRPCR的基本原理的基本原理 類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先將待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。126127PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)Target SequenceTarget SequencePCRP

49、CR原理示意圖原理示意圖模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；128PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；129PCR

50、 Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板- -引物引物結(jié)合物在結(jié)合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP為反應(yīng)原為反應(yīng)原料，靶序列為模料，靶序列為模板，按堿基配對板，按堿基配

51、對與半保留復(fù)制原與半保留復(fù)制原理，合成一條新理，合成一條新的與模板的與模板DNA DNA 鏈。鏈。130End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一每完成一個(gè)循環(huán)需個(gè)循環(huán)需2 24 4分鐘，分鐘， 2 23 3小時(shí)小時(shí)就能將待就能將待擴(kuò)目的基擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放因擴(kuò)增放大幾百萬大幾百萬倍。倍。131Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target12243841653266

52、4201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon132（三）（三）PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：10X10X緩沖液緩沖液 10 10 L L4 4種種dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol

53、100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L133PCRPCR儀儀134PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1351234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍136模板DNA95137PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的

54、特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物138PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶139PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束第2輪開始140PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq141PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束142PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+

55、x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 143PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)靈敏度高靈敏度高1. 1. 皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量級擴(kuò)增到微克量級擴(kuò)增到微克(ug=10(ug=10-6 -6) )水平水平2. 2. 能從能從100100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞3. 3. 病毒檢測的靈敏度可達(dá)病毒檢測的靈敏度可達(dá)3 3個(gè)個(gè)RFURFU（空斑形成單位）（空斑形成單位）4. 4. 細(xì)菌檢測的最小檢出率為細(xì)菌檢測的最小檢出率為3 3個(gè)細(xì)菌個(gè)細(xì)菌簡便、快速簡便、快速1. 1. 一次性加好反應(yīng)液，一次性加好反應(yīng)液，2 24 4 小

56、時(shí)完成擴(kuò)增小時(shí)完成擴(kuò)增2. 2. 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低對標(biāo)本的純度要求低u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提組織的粗提DNADNA144標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 (上、下游引物) 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙蒸水至 100ul（四）（四）PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系1451 1、PCRPCR反應(yīng)五要素（反應(yīng)成分）反應(yīng)五要素

57、（反應(yīng)成分）1) 引物（primers）2) 酶 （Taq DNA polymerase） 3) dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4) 模板 （template） 5) Mg2+ （magnesium）1461 1）引物）引物理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈作引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增147引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則引物長度： 15-30bp，常用為20mer左右 引物的有效長度不能大于 38 mer，否則最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性引物擴(kuò)增跨度：以500bp為

58、宜 特定條件下可擴(kuò)增長至10kb片段引物堿基：G+C含量以40-60%為宜 G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列148引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) 避免兩條引物間互補(bǔ)， 特別是 3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增條帶引物3端的堿基要求嚴(yán)格配對 特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn) 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則引物的特異性： 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它

59、序列無明顯同源性引物量： 每條引物的濃度0.2 1umol，以最低引物量產(chǎn)生所需結(jié)果為佳 引物濃度偏高會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且又增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)150GenBank網(wǎng)址：網(wǎng)址： 使用使用Blast程序，輸入引物序列，等待結(jié)果報(bào)告程序，輸入引物序列，等待結(jié)果報(bào)告151引物設(shè)計(jì)網(wǎng)址引物設(shè)計(jì)網(wǎng)址/cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi152 DNAstar Primer premierSoftware for primer design依靠經(jīng)驗(yàn)直接設(shè)計(jì)依靠

60、經(jīng)驗(yàn)直接設(shè)計(jì)1532）酶及其濃度）酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng) 天然酶：從嗜熱水生桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成 一個(gè)典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100 ul時(shí)） 濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少1543）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。1554 4）模板）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA