mPEG修飾紅細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1、mPEG修飾紅細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)             作者：邱艷，檀英霞，李立立，李素波，呂秋霜，查，章?lián)P培【摘要】  本研究采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠、獼猴、豬和人的修飾與未修飾自體和異體紅細(xì)胞(RBC)并給小鼠和獼猴實(shí)施輸注，觀察回輸體內(nèi)RBC 24小時(shí)存活率的變化和差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：未修飾小鼠RBC在小鼠體內(nèi)24小時(shí)存活率為74%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的小鼠RBC在小鼠體內(nèi)24小時(shí)存活率為45%，兩者間有顯著差異；未修飾人RBC在小鼠體內(nèi)24

2、小時(shí)存活率為8%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾人RBC在小鼠體內(nèi)24小時(shí)存活率為5%，兩者間無(wú)顯著差異。修飾的獼猴RBC自體回輸后24小時(shí)的存活率大于90%，而修飾的人RBC和豬RBC在給獼猴回輸后2小時(shí)其存活率已降至零。結(jié)論：RBC標(biāo)記方法及不同種實(shí)驗(yàn)小鼠的選擇對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，但mPEG種類和濃度對(duì)鼠RBC壽命的有一定程度影響。用鼠RBC做自體回輸來(lái)評(píng)價(jià)mPEG修飾人RBC的中mPEG是否影響人紅細(xì)胞的壽命是不可靠的，修飾人RBC回輸給小鼠可以作為評(píng)價(jià)修飾人RBC壽命和安全性的動(dòng)物模型。大哺乳動(dòng)物異種RBC輸注很難觀察到修飾RBC的存活率和壽命長(zhǎng)短。適合評(píng)價(jià)修飾人RBC

3、壽命和安全性的大動(dòng)物模型有待于進(jìn)一步探索。 【關(guān)鍵詞】  mPEG-SPA； 紅細(xì)胞；輸血； 動(dòng)物模型Abstract   This study was aimed to investigate the survival rate and difference of transfused modified and ummodified RBC at 24 hours.  The   modified and unmodified RBC from mice，monkey，pig and human  were labeled

4、 by using FITC，then these blood RBCs  were transfused  to homogeneous  and heterogeneous animals.  The result showed that 24 hour survival rate of unmodified mice RBC transfused to mice was 74%，while survival rate of 2.0 mmol/L mPEG-SPA modified mice RBC transfused to mice was 45

5、%，difference   between them was significant. The 24 hour survived rate of unmodified human RBC transfused to mice was 8%，while 24 hours survival rate of 2.0 mmol/L  mPEG-SPA modified human RBC transfused to mice was 5% without statistical difference.  The 24 hour survived rate of

6、 homogeneous transfusion of modified monkey RBC was 90%，while survival rate  of modified human and pig RBC was zero on 24 hours after transfusion  to monkey. It is concluded that  RBC labeling methods and mice species are unrelated to 24 hours  survival rate，but mPEG variety and

7、concentration are related to mouse RBC life-span. It is incredible to use mouse RBC homogeneous transfusion result instead of human RBC to evaluate longevity and safety of modified human RBC. But modified human RBC transfused to mice can be a model to evaluate longevity of modified human RBC. It is

8、very difficult to get the result about modified RBC life span by RBC transfusion among great heterogeneous mammal animals. So evaluation in large mammal animal models needs to be further studied.Key words mPEG-SPA ;  red blood cell;   transfusion blood;  animal model  

9、mPEG-SPA修飾的RBC輸入體內(nèi)的安全性及壽命是通用RBC研究的主要內(nèi)容之一，通用RBC在未來(lái)臨床的應(yīng)用有著重要的意義。體內(nèi)24小時(shí)存活率是評(píng)價(jià)RBC結(jié)構(gòu)和功能是否正常的一個(gè)重要指標(biāo)，為此我們采用小鼠和獼猴為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停卯惲蚯杷釤晒馑貥?biāo)記1鼠、獼猴、豬和人的修飾與未修飾的RBC，實(shí)施動(dòng)物自體和異體輸注，并檢測(cè)回輸體內(nèi)RBC 24小時(shí)的熒光強(qiáng)度，來(lái)判斷修飾與未修飾的RBC在小鼠和獼猴體內(nèi)的存活情況，確定mPEG-SPA修飾對(duì)RBC壽命和對(duì)受者安全性的影響及探索建立評(píng)價(jià)和觀察mPEG-SPA修飾的RBC在異種動(dòng)物體內(nèi)壽命和體內(nèi)存活率的動(dòng)物模型。材料和方法動(dòng)物及RBC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)

10、院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，6-8周齡，雄性，共18只，其中12只為受血小鼠，6只為供血小鼠；獼猴由北京動(dòng)物園提供，健康，雄性，共3只，其中1號(hào)猴重9.5 kg，2號(hào)猴重11 kg，3號(hào)猴重10.5 kg；AB型RhD(+)人的RBC由北京市紅十字血液中心提供，豬的RBC由北京SPF中心提供。試劑華鑫生物工程公司的FITC; NECTAR的20 kD  mPEG-SPA，北京BDST MAP血液保養(yǎng)液。儀器FACS Calibur(Becton Dickinson產(chǎn)品) 流式細(xì)胞儀，Beckman 5 diff血球計(jì)數(shù)儀。小鼠實(shí)驗(yàn)昆明鼠眼窩取血2 ml，加入280 l CPDA血液保養(yǎng)液，2

11、 500×g離心1分鐘，用生理鹽水洗滌3次，用2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾，PBS（pH 7.2）懸浮細(xì)胞至45%；對(duì)照組小鼠RBC經(jīng)洗滌后不修飾直接同樣懸浮后，均與142 g/ml FITC按11混合，37水浴20分鐘，標(biāo)記對(duì)照組及修飾組小鼠，按上述步驟同樣處理CPDA保存的人RBC。將每3只小鼠分為1組，共4組：分別為輸未修飾小鼠的RBC的對(duì)照組（1），輸2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的小鼠RBC的實(shí)驗(yàn)組（1），輸未修飾的人RBC的對(duì)照組（2），輸2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的人RBC 實(shí)驗(yàn)組（2）。通過(guò)尾靜脈給每只小鼠輸入0.5 ml懸浮

12、RBC。輸小鼠RBC的小鼠分別于注射后15、45、80分鐘及2、3、4、20和24小時(shí)時(shí)剪尾取血，輸人RBC的小鼠分別于注射后5、20、40、60分鐘及2、3、4、18和24小時(shí)時(shí)剪尾取血，加入1多聚甲醛固定。流式細(xì)胞儀測(cè)定百分?jǐn)?shù)。把5分鐘和15分鐘后取血測(cè)定的熒光標(biāo)記的RBC的百分?jǐn)?shù)設(shè)為100，之后將測(cè)定的百分?jǐn)?shù)與之相比，繪制熒光標(biāo)記RBC百分比曲線，計(jì)算24小時(shí)存活率，并與未修飾的RBC相比較。獼猴實(shí)驗(yàn)未修飾的人RBC與猴血漿的交叉配血 按10 mg/kg的劑量用吹管給猴子注射鹽酸氯胺酮，將其麻醉，取獼猴血用冷吸收放散實(shí)驗(yàn)鑒定3只獼猴的類ABO血型，用熱吸收放散法檢測(cè)獼猴Rh血型

13、，將未修飾的人RhD(+)ABRBC與3只獼猴血漿用抗人球方法進(jìn)行交叉配血，同時(shí)做輸血前血生化、血常規(guī)以及尿生化檢查。修飾的人RBC與猴血清的交叉配血  稱取1.68g  mPEG-SPA，加入36.7ml  PBS（pH 8.0），配成 2.0 mmol/L mPEG-SPA，加入5 ml人RBC，25搖床搖晃60分鐘修飾人RBC并加入MAP液保存。修飾后RBC與猴血清用抗人球方法進(jìn)行交叉配血。未修飾的豬RBC與猴血漿的交叉配血  取未修飾的豬血5-6 ml與3只獼猴血漿用抗人球方法進(jìn)行交叉配血。未修飾和修飾的豬RBC與猴血清的交叉配血  取

14、豬RBC 5-6 ml 用PBS（pH 5.6）洗滌2次，按50  U/ml加入半乳糖苷酶進(jìn)行酶解，酶解后用PBS（pH 8.0）洗滌1次，然后用生理鹽水洗滌3次，與猴血清相配進(jìn)行交叉配血。用1.0  mmol/L mPEG-SPA包裹酶解后豬RBC，再次與猴血清相配進(jìn)行交叉配血，根據(jù)配血相容結(jié)果確定輸注修飾的人和豬RBC的實(shí)驗(yàn)猴和對(duì)照猴。輸注血液的標(biāo)記  按0.425  g/ml稱取FITC，并用PBS（pH 7.4）配成50 ml溶液，攪拌子攪拌過(guò)夜，充分溶解的FITC用濾器過(guò)濾，與修飾的人RBC、修飾的豬RBC以及對(duì)照猴自身RBC按11(vv)加入

15、FITC溶液。37搖床反應(yīng)30分鐘，取出后用PBS（pH 74）洗滌2次，生理鹽水洗滌1次，然后用生理鹽水配成RBC懸液，用于輸血。         血液自體異體輸注  按10  mg/kg的劑量用吹管給猴子注射鹽酸氯胺酮，將其麻醉，給猴子接心電監(jiān)護(hù)器，記錄輸血前心電監(jiān)護(hù)器上顯示的猴的生理體征指標(biāo)，自猴股靜脈用注射器按4  ml/10分鐘的速度給每只猴輸注對(duì)應(yīng)RBC各8 ml，每半小時(shí)連續(xù)記錄輸血后心電監(jiān)護(hù)器上顯示的猴的生理體征指標(biāo)及觀察輸血后狀況，回輸后15、30、60、120分鐘取

16、血約50 l，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，收集4小時(shí)血樣進(jìn)行血常規(guī)、血生化檢測(cè)，收集輸血后尿液進(jìn)行尿生化檢查。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Chi-square檢驗(yàn)。結(jié) 果小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果未修飾的小鼠RBC在小鼠體內(nèi)24小時(shí)存活率為（82.4±2.9）%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的小鼠RBC在小鼠體內(nèi)24小時(shí)存活率為（45.2±12）%，大約在20小時(shí)后，修飾的小鼠RBC存活率開(kāi)始明顯下降，兩者Chi-square=23.73，df=7，P0001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異（圖1）。未修飾的人RBC在小鼠體內(nèi)24小時(shí)存活率為（7±5）%，2.0 mm

17、ol/L mPEG-SPA修飾的人RBC在小鼠體內(nèi)24小時(shí)存活率為（3±2）%（P0.05），兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（圖2）。獼猴實(shí)驗(yàn)結(jié)果3只獼猴的血型均為類O型。未修飾的人RhD(+)ABRBC與3只獼猴交叉配血結(jié)果是：與1號(hào)猴和3號(hào)猴發(fā)生凝集反應(yīng)，與2號(hào)猴不發(fā)生凝集反應(yīng)；修飾后人RhD(+)ABRBC與3只獼猴交叉配血結(jié)果是：僅與3號(hào)猴發(fā)生凝集反應(yīng)，與1號(hào)猴和2號(hào)猴不發(fā)生凝集反應(yīng)（表1）。處理前豬RBC與1、2、3號(hào)猴發(fā)生凝集反應(yīng)，均為強(qiáng)陽(yáng)性，豬RBC半乳糖苷酶酶解后與1號(hào)猴和2號(hào)猴血清相配，1號(hào)猴反應(yīng)為2，2號(hào)猴為±；包裹后豬RBC與1、2、3號(hào)猴均不發(fā)生凝集反應(yīng)。給1

18、號(hào)實(shí)驗(yàn)猴輸注修飾的人RBC，給2號(hào)實(shí)驗(yàn)猴輸注酶解和修飾的豬RBC，3號(hào)實(shí)驗(yàn)猴為對(duì)照猴（表1）。修飾的獼猴RBC自體回輸后，RBC  24小時(shí)的存活率大于90%，而修飾人RBC和豬RBC在給獼猴回輸后2小時(shí)其存活率已降至0，且修飾的人RBC存活率在半小時(shí)內(nèi)開(kāi)始迅速降低（圖3）。2號(hào)和3號(hào)猴在輸血前后心率、血氧飽和度、血壓和體溫?zé)o異常，1號(hào)猴在輸血前后心率、血氧飽和度、血壓無(wú)異常，但體溫在輸血后略有升高，輸后30分鐘出現(xiàn)輕度寒戰(zhàn)（表2）。3只獼猴在輸血后血液生化檢測(cè)中總膽紅素和直接膽紅素比輸血前有明顯的升高，且實(shí)驗(yàn)猴比對(duì)照猴升高幅度大（表3）。3只獼猴在輸血后尿液常規(guī)檢查中，實(shí)驗(yàn)猴蛋白質(zhì)

19、含量異常，對(duì)照猴正常（表4）。3只獼猴在輸血后血液常規(guī)檢查中，實(shí)驗(yàn)猴白細(xì)胞明顯增多并伴隨淋巴細(xì)胞減少，而對(duì)照猴無(wú)白細(xì)胞增多只是粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例增高（表5）。Table 1.   Cross-mathch of modified and unmodified pig and human RBC with monkey serum（略）Table  2.  Physiological parameters in monkeys pre-and post-transfused with homo-/heterologous RBC（略）Table 

20、; 3.   Blood biochemistry parameters in monkeys pre-and post-transfused with homo-/heterologous RBC（略）Table 4.  Urine routine tests in monkeys pre-and post-transfused with homo-/heterologous RBC（略）Table 5 .  Blood routine tests in monkeys pre-and post-transfused with homo-/hetero

21、logous RBC  at 4 hours（略）討 論目前關(guān)于mPEG修飾的小鼠RBC自體回輸后RBC存活情況研究，由于不同的研究者使用的mPEG的種類和濃度、標(biāo)記方法以及實(shí)驗(yàn)小鼠有差別，對(duì)mPEG修飾的小鼠RBC自體回輸后的存活情況還未有完全統(tǒng)一的結(jié)論，但是所有這些研究結(jié)果至少表明，RBC標(biāo)記方法及不同種類實(shí)驗(yàn)小鼠的選擇可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，但mPEG種類和濃度對(duì)鼠RBC壽命有一定程度影響。對(duì)于低分子量的mPEG如5 kD C-mPEG，當(dāng)濃度達(dá)到1.2 mmmol/L時(shí)，小鼠RBC壽命明顯縮短；同樣，高分子量的mPEG如20 kD mPEG-BTC，當(dāng)濃度達(dá)到2 mmol/L

22、時(shí)小鼠RBC壽命也明顯縮短。由此可見(jiàn)，分子量越大，濃度越高的mPEG修飾的鼠RBC，RBC壽命明顯縮短1-6。本研究采用20 kD mPEG-SPA修飾昆明鼠RBC，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記后自體回輸，結(jié)果顯示，在2.0 mmol/L的濃度時(shí)鼠RBC  24小時(shí)存活率明顯低于未修飾鼠的RBC，與目前的研究結(jié)果是一致的，究其原因可能是鼠RBC體積比較小、RBC膜比較脆弱、單位面積膜與一定量mPEG結(jié)合后離心等處理，致使RBC容易破碎和溶血。因此，用鼠RBC做自體回輸實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)2.0 mmol/L 20 kD mPEG-SPA修飾Rh抗原的工藝7是否影響人RBC的壽命和安全性是不可靠的

23、。   有些研究者用5 kD 5.0 mg/ml(1.0 mmol/L) C-mPEG修飾的人RBC回輸給C57B1/6鼠，用細(xì)胞電泳的方式檢測(cè)修飾的人RBC，發(fā)現(xiàn)該濃度C-mPEG對(duì)人RBC壽命無(wú)明顯作用2；用5 kD 6.0 mg/ml(1.2   mmol/L)的C-mPEG修飾的羊RBC，PKH-26熒光素標(biāo)記后給BALB/c鼠輸注，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)內(nèi)修飾的羊RBC存活率反而高于未修飾的羊RBC，這表明mPEG修飾有利于羊RBC存活3；本研究采用20 kD 2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的人RBC，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記后給昆明鼠回輸，結(jié)果也顯示修飾人RBC 24小時(shí)存活率不低于未修飾的RBC。以上研究結(jié)果說(shuō)明，低分子量的mPEG如5 kD C-mPEG，當(dāng)濃度達(dá)到1.2 mmol/L 時(shí)，高分子量的mPEG如20 kD mPEG-BTC，當(dāng)濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)，哺乳動(dòng)物的RBC壽命均不會(huì)明顯縮短。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)不但表明RBC經(jīng)一定濃度mPEG修飾后其結(jié)構(gòu)和功能正常，而且還表明回輸mPEG-SPA修飾的哺乳動(dòng)物RBC包括人RBC的小鼠可以作為從一個(gè)角度評(píng)價(jià)修飾的人RBC壽命和安全性的動(dòng)物模型。   在大型哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，王捷熙等用5 kD 3.0 mg/ml (1.0 mmol/L) C-mPEG