中藥化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)-

1、中藥化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)中藥中所含的化學(xué)成分比較復(fù)雜,在研究某中藥的化學(xué)成分之前,一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),初步了解其中可能含有哪些類型的成份,以便對(duì)提取、分離工作提供有益的參考,預(yù)試驗(yàn)一般可分為兩大類:一類是單項(xiàng)預(yù)試驗(yàn),即可根據(jù)需要,重點(diǎn)檢查某類化學(xué)成分的存在與否;另一類是系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn),即選用定性試驗(yàn)及薄層層析等方法,對(duì)中藥中各類化學(xué)成分進(jìn)行比較全面的檢查,然后進(jìn)行綜合分析,初步判斷有或無(wú)那些成分存在。預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果一般只能作為參考,這是由于有些定性試驗(yàn)不是某類化學(xué)成分的特效、專一反應(yīng),同時(shí)在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),幾種化學(xué)成分之間會(huì)發(fā)生相互干擾,使反應(yīng)結(jié)果呈假陽(yáng)性,故常須對(duì)某些類型化學(xué)成分進(jìn)一步做層析法(TLC

2、或PC檢查,才能進(jìn)一步作出較恰當(dāng)?shù)呐袛?。一、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)中藥化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)原理及方法。2、掌握中藥化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)程序及結(jié)果判斷。二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)中藥中所含各類化學(xué)成分在不同極性的溶劑中溶解度不同。先選用不同極性的溶劑把溶解度相近的成分提取出來(lái),分成極性不同的幾個(gè)部分,即供試液;然后再選用各類成分的定性反應(yīng)(包括沉淀反應(yīng)和顯色反應(yīng)等及層析法(TLC、PC等檢查,最后進(jìn)行分析判斷,初步確定有無(wú)哪幾類化學(xué)成分。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(一預(yù)試驗(yàn)溶液的制備1、水提取液(1 冷水浸液:稱取樣品粗粉5g,置于l00ml的三角燒瓶中,加蒸餾水50-60ml室溫浸泡過(guò)夜。過(guò)濾出約20ml濾液供檢查氨基酸、

3、多肽、蛋白質(zhì)用。(2 熱水提取液:將上述剩余的冷水浸泡液連同濾渣于水浴上60左右熱浸半小時(shí),趁熱過(guò)濾,濾液供檢查糖、多糖、有機(jī)酸、皂甙、甙類、酚類、鞣質(zhì)等成分用。2、乙醇提取液另稱取樣品粗粉10g,置于250ml圓底燒瓶中,加95%乙醇100ml,于水浴上加熱回流一小時(shí),稍冷后加入蒸餾水使其含醇量為70%,冷至室溫,過(guò)濾,濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中;用100ml 石油醚(60-90分兩次萃取,每次用石油醚50m1,以除去葉綠素等,分出下層乙醇提取液,濃縮至40-50ml,加95%乙醇50ml溶解后過(guò)濾,濾液供檢查黃酮、蒽醌、香豆素、萜類、甾體化合物、內(nèi)酯化合物、強(qiáng)心甙、有機(jī)酸、酚類、鞣質(zhì)等成分用。3

4、、酸性乙醇提取液稱取樣品粗粉2g,加0.5%硫酸的乙酸溶液10ml,于水浴上加熱回流10分鐘,過(guò)濾,濾液供檢查生物堿用。4、石油醚提取液稱取樣品粗粉1g,加入石油醚(60-9010ml,濾液供檢查揮發(fā)油、油脂、萜類、甾體化合物等成分用。(二各類成分的檢查1、檢查生物堿類取上述酸性乙醇提取液先用稀氨水調(diào)至中性,再于水浴上蒸干,殘?jiān)?%硫酸5ml 溶解后,過(guò)濾,濾液供以下實(shí)驗(yàn)用。(1 碘化鉍鉀試驗(yàn):取濾液1ml,加入碘化鉍鉀試劑1-2滴,如有桔紅色沉淀產(chǎn)生,即表示可能有生物堿。(2 碘化汞鉀試驗(yàn):取濾液1ml,加入碘化汞鉀試劑1-2滴,如有淺黃色或白色沉淀產(chǎn)生,即表示可能有生物堿。(3 硅鎢酸試

5、驗(yàn):取濾液1ml,加入硅鎢酸試劑1-2滴,如有淺黃色或灰白色沉淀產(chǎn)生,即表示可能有生物堿。2、檢查氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類(1 加熱沉淀試驗(yàn):取冷水浸液1ml,加熱煮沸,如產(chǎn)生渾濁或沉淀,即表示可能有蛋白質(zhì)。(2 雙縮脲試驗(yàn):取冷水浸液1ml,加入10%氫氧化鈉水溶液2滴,搖勻,再滴加0.5%硫酸銅水溶液1-2滴,搖勻,如顯紅色,紅紫色或紫色,即表示可能有多肽、蛋白質(zhì)。(3 茚三酮試驗(yàn):取冷水浸液1m1,加入0.2%茚三酮乙醇溶液2-3滴,搖勻,于沸水浴中加熱5 分鐘,冷卻后,如顯藍(lán)色或藍(lán)紫色,即表示可能有氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)。(4 吲哚醌試驗(yàn):取冷水浸液滴于濾紙片上,干燥后,噴灑吲哚醌試劑,于

6、120加熱5分鐘,若斑點(diǎn)顯各種顏色,即表示可能有氨基酸。3、檢查還原糖、多糖和甙類(1 斐林反應(yīng):取熱水提取液1ml,加入新配制的斐林(Fehling試劑4-5滴,在沸水浴上加熱5分鐘,如產(chǎn)生磚紅色沉淀,即表示有還原糖或其它還原性物質(zhì)。若現(xiàn)象不明顯,可另取熱水提取液4ml,加入10%鹽酸1ml于水浴上加熱10分鐘使其水解,冷卻后,若有沉淀應(yīng)過(guò)濾,然后加入5%氫氧化鈉水溶液調(diào)至中性,再加入斐林試劑1ml于沸水浴上加熱5分鐘,如產(chǎn)生磚紅色洗淀,即表示可能有多糖或甙類。(2 -萘酚試驗(yàn):取熱水提取液1ml,加入5% -萘酚乙醇液2-3滴,搖勻,沿試管壁緩緩加入濃硫酸lml,在試液與硫酸的交界面產(chǎn)生紫

7、色或紫紅色環(huán),即表示有糖類,多糖或甙類。(3 多糖的試驗(yàn):取熱水提取液5ml,于水浴上蒸發(fā)至1ml,再加入95%乙醇5ml,若生沉淀,過(guò)濾,用少量乙醇洗滌沉淀,再將沉淀溶于3ml水中,加入10%鹽酸1ml,于水浴上加熱10分鐘使其水解,冷卻后,加5%氫氧化鈉水溶液調(diào)至中性,然后加入斐林試劑1ml,于沸水浴上加熱5分鐘,如產(chǎn)生磚紅色沉淀,即表示有多糖。4、檢查皂甙類(1 泡沫試驗(yàn):取熱水提取液1-2ml置于試管中,密塞,激烈振搖2分鐘,如產(chǎn)生大量持續(xù)性泡沫,且放置10分鐘以上,或加熱,或加入乙醇泡沫均無(wú)明顯地減少,即表示可能有皂甙。(2 醋酐-濃硫酸反應(yīng):取熱水提取液2ml,置于小瓷蒸發(fā)皿中,于

8、水浴上蒸干,殘留物加冰醋酸1ml溶解,再加醋酐1ml,濃硫酸1滴,如反應(yīng)液顏色由黃紅紫藍(lán)污綠色,即表示可能有甾體皂甙,如反應(yīng)液顏色由黃紅色不呈污綠色,即表示可能有三萜皂甙。(3 溶血試驗(yàn):取熱水提取液滴于濾紙片上,等干燥后,噴灑紅細(xì)胞懸浮液,數(shù)分鐘后,在紅色背景中如出現(xiàn)白色或淡黃色斑點(diǎn),即表示可能有皂甙。5、檢查有機(jī)酸類(1 pH 試紙?jiān)囼?yàn):取熱水提取液及乙醇提取液,分別用pH試紙檢查其pH值,如呈酸性,即表示可能有游離羧酸或酚性化合物。(2 溴酚藍(lán)試驗(yàn):取乙醇提取液滴于濾紙片上,待干燥后,噴灑0.1%溴酚藍(lán)的70%乙酸溶液,如在藍(lán)色背景上顯黃色斑點(diǎn),即表示可能有有機(jī)酸。若斑點(diǎn)不明顯,可再噴灑

9、氨水,然后暴露在鹽酸蒸汽中,背景逐漸由藍(lán)色變黃色,而有機(jī)酸斑點(diǎn)仍顯藍(lán)色。溴酚藍(lán)變色范圍是:3.0(黃色 4.6(紫色。(3 溴甲酚綠試驗(yàn):取乙醇提取液滴于濾紙片上,等干燥后,噴灑0.04% 溴甲酚綠乙醇溶液,如藍(lán)色背景上顯黃色斑點(diǎn),即表示可能有有機(jī)酸。溴甲酚綠變色范圍是:3.8(黃色 5.4(藍(lán)色。6、檢查酚類化合物和鞣質(zhì)類(1 三氯化鐵試驗(yàn):取熱水提取液及乙醇提取液各1ml,(若提取液為酸性,可直接進(jìn)行檢查,若為堿性應(yīng)先加醋酸酸化,加1%三氯化鐵試劑12滴,如反應(yīng)液呈綠色、藍(lán)綠色、墨綠色、藍(lán)紫色,即表示可能有酚類化合物或鞣質(zhì)。(2 三氯化鐵-鐵氰化鉀反應(yīng):取熱水提取液及乙醇提取液分別滴于濾紙

10、片上,待干燥后,噴灑三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑,如斑點(diǎn)呈藍(lán)色,即表示可能有酚類、鞣質(zhì)或還原性化合物。(3 香草醛-鹽酸反應(yīng):取熱水提取液及乙醇提取液分別滴于濾紙片上,待干燥后,噴灑香草醛-鹽酸試劑,如斑點(diǎn)呈不同程度的紅色,即表示有間苯二酚和間苯三酚類的化合物。(4 明膠試驗(yàn):取熱水提取液1ml,加入氯化鈉-明膠2-3滴,如有沉淀產(chǎn)生,即表示可能有鞣質(zhì)。7、檢查甾體及三萜類化合物(1 醋酐-濃硫酸反應(yīng):取乙醇提取液2ml,置于小瓷蒸發(fā)皿中,于水浴上蒸干,殘留物加冰醋酸1ml溶解,再加醋酐1m1,然后滴加濃硫酸1滴,如反應(yīng)液顏色由黃紅紫藍(lán)污綠色,即表示可能有甾體化合物;如反應(yīng)液顏色僅由黃紅紫紅色,即表

11、示可能有三萜類化合物。(2 氯仿-濃硫酸反應(yīng):取乙醇提取液2ml,置于小瓷蒸發(fā)皿中,于水浴上蒸干,殘留物加氯仿1ml溶解,并轉(zhuǎn)移至小試管中,沿管壁加入濃硫酸1ml,如氯仿層顯紅色或青色,硫酸層于紫外光燈下觀察有綠色熒光,即表示可能有甾體化合物。8、檢查黃酮類化合物(1 鹽酸-鎂粉反應(yīng):取乙醇提取液1ml,加入鎂粉少許,再加入濃鹽酸2-3滴(必要時(shí)水浴加熱,如反應(yīng)液或產(chǎn)生的泡沫顯紅紫紅色,即表示可能有黃酮類化合物。(2 三氯化鋁反應(yīng):取乙醇提取液滴于濾紙片上,待干燥后,噴灑1%三氯化鋁乙醇溶液,如斑點(diǎn)呈黃色,于紫外燈下檢視呈明顯的黃色或黃綠色熒光,即表示可能有黃酮類化合物。(3 氨熏試驗(yàn):取乙醇

12、提取液滴于濾紙片上,待干燥后,置于濃氨水瓶上熏半分鐘,如斑點(diǎn)顯黃色或黃色加深,當(dāng)濾紙片離開(kāi)氨蒸汽數(shù)分鐘后,黃色減弱或消褪;另將氨熏后的濾紙置于紫外光燈下檢視,斑點(diǎn)呈黃色熒光,即表示可能有黃酮類化合物。9、檢查內(nèi)酯、香豆素及其甙類(1 熒光試驗(yàn):取乙醇提取液滴于濾紙片,待干燥后,于紫外燈檢視,如斑點(diǎn)呈藍(lán)色熒光,噴灑1%氫氧化鉀試劑后斑點(diǎn)有熒光顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色,即表示可能有香豆素及其甙類。(2 重氮化反應(yīng):取乙醇提取液1ml,加入3%碳酸鈉水溶液1ml于沸水浴加熱3分鐘,冷卻后,加入新配制的重氮化試劑1-2 滴,如顯紅色,即表示可能有香豆素及其甙類。(3 異羥肟酸鐵反應(yīng):取乙醇提取液1ml,加7%

13、鹽酸羥胺甲醇液3-5滴和10%氫氧化鉀液10滴,于水浴上加熱至反應(yīng)開(kāi)始(有氣泡產(chǎn)生,冷卻,再加入5%鹽酸使成弱酸性,加1%三氯化鐵水溶液5滴,如反應(yīng)液有橙紅色或紫紅色出現(xiàn),即表示可能有酯類、內(nèi)酯類、香豆素及其甙類。10、檢查強(qiáng)心甙類(1 3,5-二硝基苯甲酸反應(yīng)(Kedde反應(yīng):取乙醇提取液1ml,加3,5-二硝基苯甲酸試劑3-4滴,如反應(yīng)液呈紅色或紫色,即表示可能有強(qiáng)心甙。(2 堿性苦味酸反應(yīng)(Baljet反應(yīng):取乙醇提取液1ml,加堿性苦味酸試劑1-2滴,如反應(yīng)液呈橙色或紅色,即表示可能有強(qiáng)心甙。(3 亞硝酸鐵氰化鈉反應(yīng)(Legal反應(yīng):取乙醇提取液1ml,置于小瓷蒸發(fā)皿中,于水浴上蒸干,

14、殘留物加吡啶1ml溶解,再加0.3%亞硝酸鐵氰化鈉溶液4-5滴,混勻,再加入10%氫氧化鈉溶液1-2滴,混勻,如反應(yīng)液呈紅色,且顏色又逐漸消退,即表示可能有強(qiáng)心甙。11、檢查蒽醌類(1 堿液試驗(yàn)(Borntrager 反應(yīng):取乙醇提取液1ml,加入10%氫氧化鈉水溶液1ml,如反應(yīng)液呈紅色,再加入30%過(guò)氧化氫5滴,加熱后,紅色不消退,用5% 鹽酸化后,如紅色消退,即表示有蒽醌及其甙類。(2 醋酸鎂反應(yīng):取乙醇提取液1ml,加1%醋酸鎂甲醇溶液l-2滴,如反應(yīng)液呈紅色,即表示有蒽醌及其甙類。(3 硼酸溶液試驗(yàn):取乙醇提取液滴于濾紙片上,待于燥后,噴灑1%硼酸水溶液,如斑點(diǎn)呈橙黃色或紅色,且于紫

15、外燈下檢視有熒光,即表示有蒽醌及其甙類。12、檢查揮發(fā)油、油脂類(1 油斑試驗(yàn):取石油醚提取液滴于濾紙片上,如油斑在室溫下可揮發(fā)不留痕跡,即表示可能有揮發(fā)油;如油斑不消失,即表示有油脂類。(2 磷鉬酸試驗(yàn):取石油醚提取液滴于濾紙片上,噴灑25%磷鉬酸乙醇液,115-118加熱2分鐘,如斑點(diǎn)呈藍(lán)色,背景為黃綠色或藏青色,即表示有油脂、三萜及甾醇類。(3 香草醛-硫酸試驗(yàn):取石油醚提取液滴于濾紙片上,噴灑香草醛60%硫酸試劑,如斑點(diǎn)呈紅、藍(lán)、紫等各種顏色,即表示可能有揮發(fā)油、萜類和甾醇類。(三園型濾紙層析法取一張園型濾紙,在距園心1.0-1.5cm 周?chē)妹?xì)管點(diǎn)加樣品,一張濾紙可同時(shí)點(diǎn)6-8個(gè)樣

16、品,待點(diǎn)樣溶劑揮發(fā)后,在濾紙園心處穿入一濾紙芯,然后放在合適的培養(yǎng)皿中,使紙芯與培養(yǎng)皿中的展開(kāi)劑接觸,于園型濾紙上加蓋培養(yǎng)皿蓋,進(jìn)行層析。當(dāng)溶劑前沿接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí),取出濾紙,揮干溶劑后顯色,根據(jù)樣品斑點(diǎn)顏色,可確定樣品中的成分。1、檢查有機(jī)酸類展開(kāi)劑:95%乙醇樣品:a. 熱水提取液b. 乙醇提取液c. 檸檬酸乙醇溶液(對(duì)照品顯色劑:0.1%溴酚藍(lán)試劑,有機(jī)酸斑點(diǎn)呈黃色。2、檢查揮發(fā)油類展開(kāi)劑:95%乙醇樣品:a. 乙醇提取液b. 石油醚提取液顯色:先觀察濾紙上有無(wú)油跡斑點(diǎn),如有油跡斑點(diǎn),可將濾紙加溫烘烤,若油斑消失,則表示有揮發(fā)油存在。(四各類成分的層析檢查中藥化學(xué)成分的預(yù)試驗(yàn)除用上述的定

17、性反應(yīng)外,還可用層析法進(jìn)行,它不僅可以減少成分間的相互干擾,展析結(jié)果容易判斷,還可以根據(jù)層析所用的條件加展開(kāi)劑的組成,層析種類以及色斑的比較值(Rf 值,初步判斷樣品中所含化學(xué)成分的極性大小和溶解性能,甚至可以通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照,初步確定樣品中含有何種化合物。用層析法預(yù)試各類化學(xué)成分的參考層析條件如下:生物堿類:1、氧化鋁層析(中性、堿性展開(kāi)劑:氯仿-甲醇(9:1苯-乙醇(8:2顯色劑:改良碘化鉍鉀試劑2、硅膠G 層析展開(kāi)劑:環(huán)己烷-二乙胺(9:1氯仿-丙酮-二乙胺(5:4:1二甲苯-正丁醇-甲醇-二乙胺(40:40:6:2顯色劑:改良碘化鉍鉀試劑氨基酸類:1、紙層析移動(dòng)相:正丁醇-醋酸-水(

18、4:1:5,上層顯色劑:茚三酮試劑2、硅膠G 層析展開(kāi)劑:正丁醇-醋酸-水(4:1:1顯色劑:茚三酮試劑糖類:1、紙層析移動(dòng)相:乙酸乙酯-吡啶-水(2:1:2顯色劑:茴香胺-鄰苯二甲酸試劑2、硅膠G 層析展開(kāi)劑:丁酮-醋酸-水(6:1:3乙酸乙酯-甲醇-醋酸-水(12:3:3:2顯色劑:茴香醛-硫酸試劑皂甙類:1、硅膠G 層析展開(kāi)劑:正丁醇-乙醇-25%氨水(7:2:5氯仿-甲醇-水(65:35:10顯色劑:噴霧10%硫酸乙醇液后于100左右加熱數(shù)分鐘。2、氧化鋁層析展開(kāi)劑:己烷-乙酸乙酯(7:3苯-乙酸乙酯(7:3顯色劑:噴霧10%硫酸乙醇液后于100左右加熱數(shù)分鐘。有機(jī)酸類:1、紙層析移動(dòng)

19、相:正丁醇-醋酸-水(4:1:5,上層顯色劑:噴霧0.1%溴酚藍(lán)乙醇液后于110左右加熱數(shù)分鐘。2、硅膠G 層析展開(kāi)劑:苯-甲醇-醋酸(79:14:7顯色劑:噴霧0.1%溴酚藍(lán)乙醇液后于110左右加熱數(shù)分鐘。酚類、鞣質(zhì):1、紙層析移動(dòng)相:正丁醇-醋酸-水(4:1:5,上層顯色劑:1%三氯化鐵乙醇溶液2、硅膠CMC-Na 層析展開(kāi)劑:氯仿-丙酮(9:1顯色劑:1%三氯化鐵乙醇溶液黃酮類化合物:1、聚酰胺層折展開(kāi)劑:水-乙醇-乙酰丙酮(4:2:1顯色劑:于紫外光燈下檢視,(1 氨熏,(2 1%三氯化鋁乙醇溶液2、紙層析移動(dòng)相:正丁醇-醋酸-水(4:1:5,上層顯色劑:于紫外光燈下檢視,(l 氨熏,(2 1%三氯化鋁乙醇溶液3、硅膠 G 層析 展開(kāi)劑：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1 顯色劑：于紫外光燈下檢視，(1 氨熏，(2 1%三氯化鋁乙醇溶液 香豆素類： 1、硅膠 G 層析 展開(kāi)劑：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1 石油醚-乙酸乙酯(5:1 顯色劑：于紫外光燈下檢視，重氮化試劑 2、紙層析 移動(dòng)相：正丁醇-醋酸-水(4:1:5，上層 顯色劑：于紫外光燈下檢視，重氮化試劑 強(qiáng)心甙類： 1、硅膠 G 層析 展開(kāi)劑：乙酸乙酯-吡啶-水(5:1:4 二氯甲烷-甲醇