抗體藥物偶聯(lián)物的制備研究PPT

1、LOGO抗體藥物偶聯(lián)物的制備研究抗體藥物偶聯(lián)物的制備研究n班級：n學(xué)生：n學(xué)號：河北科技大學(xué)本科論文答辯目錄目錄實驗分以下幾項進行介紹. .引言引言2.2.實驗部部分實驗部部分1.1課題背景課題背景u本課題是對抗體藥物偶聯(lián)物的制備進行研宄，主要內(nèi)容如下：u從眾多檢測蛋白的方法中挑選出適用于檢測抗體還原后產(chǎn)物的最優(yōu)方法。采用常用的還原劑對抗體進行還原，檢測抗體不同時間下還原程度，得出最優(yōu)還原反應(yīng)時間以及還原過程的動態(tài)變化。u對反應(yīng)溫度，反應(yīng)pH，還原劑與抗體的還原比例進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)化反應(yīng)條件，從常用的九種還原劑中篩選出高效的還原劑，用來連接帶有馬來酰亞胺接頭的藥物，進行抗體藥物偶聯(lián)物制備

2、實驗。2.1實驗機理實驗機理u抗體被還原到合適的程度后，進行與藥物的偶聯(lián)反應(yīng)，通常在pH 78左右，反應(yīng)溫度0C下反應(yīng)1h。例如如果抗體被還原到4巰基/抗體，通常加入4-5倍的馬來酰亞胺接頭的藥物反應(yīng)30min1。其中采用二甲基甲酰胺（DMF)或者二甲基乙酰胺（DMAC)先將藥物溶解，然后與抗體還原后的產(chǎn)物反應(yīng)2，3。加入過量的小分子硫醇進行猝滅，來阻止馬來酰亞胺與抗體上的巰基進一步反應(yīng)，藥物接頭的馬來酰亞胺被猝滅后，接下來的步驟就是要除去多余的藥物接頭以及有機溶劑，EDTA等添加物。u由于藥物的成分、均一性與藥物的安全以及藥物的療效息息相關(guān)，因此對抗體藥物偶聯(lián)物的組成、非均一性分析越來越被重

3、視4 。疏水色譜柱TSKgelButyl -NPR (4.6mm X 3.5 cm)以對蛋白的高速、高分辨率的分離性能為廣大研宄人員提供了幫助。它以表面鍵合有丁基的、粒徑為2.5的非多孔型親水性樹脂作為填充劑。2.2實驗方案實驗方案分別取濃度為26.6mg/mL的IgG75pL分裝至離心管中，TCEP和DTT用PB7.0緩沖液配置成10mM溶液，然后稀釋至1mM，將藥物溶于N, N-二甲基甲酰胺配成濃度為2 mM的溶液。還原反應(yīng)：將還原劑按表中比例加入到IgG溶液中，補充緩沖液至總體積為150pL，用移液槍吹打混勻，將反應(yīng)體系放置到37C恒溫?fù)u床中，180轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2h。SDS-PAGE檢測是

4、否被還原。在反應(yīng)體系中取出5pL稀釋至20pL，加入非還原電泳上樣緩沖液，進行SDS-PAGE，檢測還原反應(yīng)程度5 。采用3K超濾管超濾膜在4000g轉(zhuǎn)速下離心至少5次，以除去未反應(yīng)還原劑。同時將整個反應(yīng)置換成Tris-HCl 8.0的緩沖體系中。加入不同比例2mM藥物142B1，Drug：IgG比例分別為4、5、6。比例和體積如表中所示，加入Tris-HCl pH8.0至反應(yīng)體系為200pL (表4-3)。采用混勻器混勻后，將反應(yīng)體系放置到37C恒溫?fù)u床中，180轉(zhuǎn)速下反應(yīng)1h。向最終的反應(yīng)體系中加入半胱氨酸，使其中濃度達到1mM，猝滅未反應(yīng)u的藥物。反應(yīng)后的樣品采用BCA法檢測濃度。實驗藥

5、品及其規(guī)格2.3實驗藥品和儀器實驗藥品和儀器2.4分析方法2.4.1、蛋白濃度測定 蛋白濃度采用BCA方法測定。具體步驟為：分別在96孔板的每個孔中加入20pL 不同濃度（0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL 和 1.0mg/mL)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液2mg/mL)和待測樣品和空白對照，然后加入200pL工作液（A液:B液=50:1)，將96孔板放置于37C的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.5h。將酶標(biāo)儀的檢測波長設(shè)為562nm，在該波長下檢測每個孔中蛋白質(zhì)的吸光值。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度和測出的吸光值，繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到檢測樣品的濃度。

6、SDS-PAGE是依據(jù)通過SDS使蛋白質(zhì)分子帶上大量負(fù)電荷中和蛋白質(zhì)分子本身電荷，消除蛋白質(zhì)分子本身的電荷效應(yīng)。依據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小呈現(xiàn)不同條帶。通過凝膠成像系統(tǒng)所得圖片蛋白帶的寬度以及顏色的深淺，采用光密度分析可以判斷出蛋白帶大約的蛋白量。采用非還原的SDS-PAGE電泳，濃縮膠為8%的聚丙烯酰胺凝膠，分離膠為12%的聚丙烯酰胺凝膠。樣品緩沖液中不含巰基乙醇6 。取20pL(0.1mg/mL0.5mg/mL)蛋白樣品加適量的樣品緩沖液在100C下煮沸5min， 8000g高速離心5min后上樣?？捡R斯亮藍染色，染色劑為考馬斯亮藍R-250。2.4.2、聚丙烯酰胺凝膠電泳 2.4.3、疏水作用

7、層析層析前樣品處理：采用層析前樣品處理：采用BCABCA法檢測抗體與藥物法檢測抗體與藥物偶聯(lián)后產(chǎn)物的濃度，將產(chǎn)物用偶聯(lián)后產(chǎn)物的濃度，將產(chǎn)物用PBSPBS稀釋到稀釋到1mg/mL1mg/mL77 。采用。采用0.22pm0.22pm的超濾膜過濾，除去樣的超濾膜過濾，除去樣品中雜質(zhì)。品中雜質(zhì)。采用分析柱采用分析柱TOSOH TSKgel Butyl-NPR檢測抗體檢測抗體與藥物偶聯(lián)后的各個產(chǎn)物的生成情況，液相系與藥物偶聯(lián)后的各個產(chǎn)物的生成情況，液相系統(tǒng)為統(tǒng)為AKTA Explorer 100。分析條件：流動相為分析條件：流動相為 Buffer A: 1.5M (NH4 4)2 2S4 4，50mM

8、 KHPO4 4，pH 7.0，BufferB: 50mM KHPO4 4，pH 7.0 加入加入 20% 異丙醇。異丙醇。考察樣品中加入不同硫酸銨含量對分析結(jié)果的影考察樣品中加入不同硫酸銨含量對分析結(jié)果的影響。加入不同比例響。加入不同比例2 M2 M硫酸銨緩沖液硫酸銨緩沖液(2.0 mM (2.0 mM Na2HPO4-NaH2PO4Na2HPO4-NaH2PO4磷酸緩沖液中加入磷酸緩沖液中加入2M2M硫酸銨調(diào)硫酸銨調(diào)pH pH 7.0)7.0)和和PB(20 mM pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4PB(20 mM pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4磷酸磷酸緩沖液），最

9、終濃度硫酸銨分別為緩沖液），最終濃度硫酸銨分別為0.50.5、0.80.8、1.01.0、1.31.3、1.5M1.5M?？疾炝魉贋榭疾炝魉贋?.20.2、0.40.4、0.60.6、0.80.8、1mL/min1mL/min時，系時，系統(tǒng)壓力的變化，分析柱對抗體與藥物偶聯(lián)后生成統(tǒng)壓力的變化，分析柱對抗體與藥物偶聯(lián)后生成產(chǎn)物的情況，室溫檢測，檢測波長為產(chǎn)物的情況，室溫檢測，檢測波長為280nm280nm，進樣，進樣體積為體積為50pL50pL，濃度，濃度1mg/mL1mg/mL，總蛋白進樣量為，總蛋白進樣量為5050昭昭。2.4.4、反相色譜分析 u層析前樣品處理：采用層析前樣品處理：采用BC

10、A法檢測抗體與藥物偶聯(lián)后產(chǎn)法檢測抗體與藥物偶聯(lián)后產(chǎn)物的濃度，將產(chǎn)物用物的濃度，將產(chǎn)物用PBS 稀釋到稀釋到 2mg/mL。100L 2mg/mL IgG 在在 PBS 溶液中與溶液中與 100pL 50mM DTT 在在37C，反應(yīng)，反應(yīng)20min，0.22m的超濾膜過濾，除去樣品中雜質(zhì)的超濾膜過濾，除去樣品中雜質(zhì)。上樣。上樣20L，280nm檢測。u采用反相色譜柱采用反相色譜柱 PLRP-S 1000A，8mm，150mmx4.6mm，P/N PL1512-3802 檢測，方法檢測，方法：Buffer A: H2 2O + 0.1% TFA，Buffer B: CH3 3CN + 0.1%

11、TFA，梯度：，梯度： 30-45%B 30min，95%B 3 min，30%B 5min。實驗結(jié)果與討論實驗結(jié)果與討論3、實驗結(jié)果與討論鹽濃度的高低直接影響疏水吸附能力的大鹽濃度的高低直接影響疏水吸附能力的大小，鹽濃度太高疏水性強，不宜洗脫；而鹽小，鹽濃度太高疏水性強，不宜洗脫；而鹽濃度太低疏水性弱，不宜吸附。因此要選擇濃度太低疏水性弱，不宜吸附。因此要選擇適宜的鹽濃度。當(dāng)樣品中分別含有不同鹽濃適宜的鹽濃度。當(dāng)樣品中分別含有不同鹽濃度度0.50.5、0.80.8、1.01.0、1.31.3、1.50M1.50M硫酸銨時，進硫酸銨時，進行行HICHIC分析，當(dāng)鹽濃度為分析，當(dāng)鹽濃度為0.50

12、.5、0.80.8、1.0 M1.0 M時，時，樣品不能吸附在介質(zhì)上，基本全部流穿，當(dāng)樣品不能吸附在介質(zhì)上，基本全部流穿，當(dāng)為鹽濃度為為鹽濃度為1.5M1.5M，洗脫峰中出現(xiàn)不同的抗體，洗脫峰中出現(xiàn)不同的抗體藥物偶聯(lián)物，因此，選擇樣品上樣時鹽濃度藥物偶聯(lián)物，因此，選擇樣品上樣時鹽濃度為為 1.5M1.5M。3.13.1疏水作用層析硫酸銨濃度的選擇3.23.2疏水作用層析流速的選擇采用采用HICHIC進行分離過程中，流速能夠影響不進行分離過程中，流速能夠影響不同藥物偶聯(lián)物之間的分離度，流速一般在同藥物偶聯(lián)物之間的分離度，流速一般在0.20.21mL/min1mL/min之間變化，在流速之間變化，

13、在流速0.20.21mL/min1mL/min變化時，系統(tǒng)壓力逐漸上升，壓變化時，系統(tǒng)壓力逐漸上升，壓力如圖力如圖4-14-1所示，當(dāng)流速超過所示，當(dāng)流速超過0.8mL/min0.8mL/min時時，系統(tǒng)壓力達到，系統(tǒng)壓力達到10MPa10MPa，已經(jīng)接近，已經(jīng)接近AKTAAKTA層層析系統(tǒng)耐受壓力。流速在析系統(tǒng)耐受壓力。流速在0.6mL/min0.6mL/min時，時，系統(tǒng)壓力在系統(tǒng)壓力在8MPa8MPa，在層析系統(tǒng)和分析柱的，在層析系統(tǒng)和分析柱的耐受壓力范圍內(nèi)，但是，不同藥物偶聯(lián)物耐受壓力范圍內(nèi)，但是，不同藥物偶聯(lián)物的峰分離度很差，不能將各個產(chǎn)物很好的的峰分離度很差，不能將各個產(chǎn)物很好的分

14、開。當(dāng)流速為分開。當(dāng)流速為0.2mL/min0.2mL/min時，分析時間時，分析時間延長，綜合考慮各個因素選擇最優(yōu)流速為延長，綜合考慮各個因素選擇最優(yōu)流速為0.4mL/min0.4mL/min。3.33.3抗體藥物偶聯(lián)物疏水作用分析 在流速0.4mL/min，樣品中鹽濃度為1.5M硫酸銨的條件，采用AKTAPurifier100層析系統(tǒng)對樣品進行分析。不同載藥量的抗體藥物偶聯(lián)物按照疏水性的強弱先后被洗脫下來，從而得到不同的檢測峰?？贵w還原后的巰基是成對出現(xiàn)，因此，偶聯(lián)的藥物數(shù)量分別是0，2，4，6，8個，分別記為D0，D2，D4，D6， D8。出峰先后順序為D0，D2，D4，D6，D8，見圖

15、4-4。每個抗體分子的平均藥物載量可以通過構(gòu)成峰的積分面積和每個峰的藥物載量作為加權(quán)因子來計算，通過工作站分析得出各個峰面積，見表4-2： 藥物載量計算以藥物載量計算以IgG： DTT： Drug=1:3:6為例進行計算為例進行計算通過上式計算出不同反應(yīng)每個抗體分子上平均偶聯(lián)上的藥物數(shù)量。圖4-24-2由下及上分別是 IgG: DTTIgG: DTT： Drug=1:1.5:3Drug=1:1.5:3、1:2.5:51:2.5:5、1:3.5:71:3.5:7、1:3:61:3:6。通過分析可知，當(dāng)IgGIgG： DTTDTT： Drug=1:1.5:3Drug=1:1.5:3時，偶聯(lián)到抗體上

16、的藥物很少，基本檢測不出，當(dāng)IgGIgG： DTTDTT： Drug=1:2:4Drug=1:2:4時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量為1.651.65，當(dāng)IgGIgG： DTTDTT：Drug=1:2.5:5Drug=1:2.5:5時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量為2.222.22，當(dāng)IgG: DTTIgG: DTT： Drug=1:3:6Drug=1:3:6時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量為3.563.56，因此，當(dāng)IgGIgG： DTTDTT： Drug=1:3:6Drug=1:3:6時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量符合要求，因此，采用DTTDTT作為還原劑還原抗體并偶聯(lián)上藥物的最佳比例為IgGIgG：

17、DTTDTT： Drug=1:3:6Drug=1:3:6 3.43.4反相色譜分析 反相色譜也是基于抗體載藥量的不同來來分離的，載藥量越高的ADC，保留時間越長，與HIC的根本不同是反相色譜是在還原的條件下分離的，此時抗體的重鏈輕鏈?zhǔn)欠蛛x的，并沒有共價結(jié)合為一體，因此重鏈輕鏈?zhǔn)欠謩e洗脫下來的。部分還原后偶聯(lián)藥物生成的藥物偶聯(lián)物是一個依靠鏈間的共價鍵結(jié)合在一起的復(fù)雜的混合物，從該混合物中的物種衍生的反相色譜圖很難解釋，所以這個方法的樣品制備包括DTT處理的步驟，以減少任何其它分子間的二硫化物。樣品完全還原后，所有的抗體以單獨的鏈進行洗脫。所有的重鏈輕鏈連有不同數(shù)量藥物，重鏈H，輕鏈L，重鏈連有1

18、個藥物H1，依次類推，產(chǎn)物有L0，L1，H0，H1， H2，H3分別計算出來，由工作站得出每個峰面積，當(dāng)IgG:DTT:Drug=1:2:4時，每個峰面積如表4.5所示，由下式可得出每個抗體上連接藥物數(shù)量。圖4.3中，由上至下依次為 IgG, IgG:DTT:Drug=1:1.5:3，IgG： DTT: Drug=1:2:4，IgG： DTT: Drug=1:2.5:5，IgG： DTT： Drug=1:3:6。u通過分析計算，當(dāng)IgG:DTT:Drug=1:1.5:3時，偶聯(lián)到抗體上的藥物很少，基本檢測不出。當(dāng)IgG: DTT： Drug=1:2:4時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量為1.23，當(dāng)

19、IgG： DTT： Drug=1:2.5:5時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量為2.12，當(dāng)IgG：DTT： Drug=1:3:6時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量為3.56。這與疏水作用層析數(shù)據(jù)基本接近，因此，當(dāng)IgG：DTT：Drug=1:3:6時，平均每個抗體上的藥物數(shù)量符合要求，因此DTT作為還原劑還原抗體并偶聯(lián)上藥物的最佳比例為IgG:DTT：Drug=1:3:6。4、實驗結(jié)論 本章在還原劑還原抗體的最優(yōu)條件下，進行抗體與藥物的偶聯(lián)反應(yīng)，采用疏水作用層析和反相高效液相色譜對偶聯(lián)藥物后的抗體進行檢測，確定了抗體藥物偶聯(lián)物的合適的檢測方法，并且計算得出了平均每個抗體所連接藥物數(shù)量。所得結(jié)論有以下三點

20、：u通過不同流速，樣品中含有不同鹽濃度進行疏水層析方法的優(yōu)化，確定采用疏水層析分析抗體藥物偶聯(lián)物的分析條件：流動相為Buffer A: 1.5M (NH4)2SO4，50mM KHPO4，pH 7.0，Buffer B: 50mM KHPO4，pH 7.0 加入 20%異丙醇，流速0.4mL/min，樣品中鹽濃度為1.5M硫酸銨，蛋白濃度1mg/mL。上樣 50pL，280nm 檢測。u通過反相色譜柱PLRP-S檢測，分析方法：BufferA: H2O + 0.1% TFA BufferB: CH3CN + 0.1% TFA 梯度:30-45%B 30min，95%B 3 min，30%B 5

21、min樣品處理 100pL 2mg/mL IgG 在 PBS 溶液中與 100pL 50mM DTT 在 37C反應(yīng)20min后上樣20pL，280nm檢測。u通過不同還原劑比例進行抗體還原，然后進行藥物偶聯(lián)，進行疏水作用層析和反相高效色譜進行分析，當(dāng)IgG: DTT： Drug=1:3:6時，通過分析計算，平均每個抗體上偶聯(lián)的藥物為3.56。參考文獻參考文獻（1）Wilbur, D. S., Chyan, M. K., Nakamae, H., etal, Reagents for Astatination ofBiomolecules. 6. An Intact Antibody Conj

22、ugated with aMaleimido-closo-Decaborate(2-) Reagent via Sulfhydryl Groups Had ConsiderablyHigher Kidney Concentrations than the Same Antibody Conjugated with anIsothiocyanato-closo-Decaborate(2-) Reagent via Lysine Amines, Bioconjugatechemistry,2012, 23(3):409-420.（2）Hamann, P. R., Hinman, L. M., Beyer, C. F., etal, An anti-CD33antibody-calicheamicin conjugate for treatment of acute myeloid leukemia. Choice oflinker, Bioconjugate chemistry,2002, 13(1):40-46.（3）Fleming, M. S., Zhang, W., Lambert, J. M., etal, reversed-phasehigh-performance l