生物負載測定

1、生物負載測定生物負載測定1 1微生物的定義和分類微生物的定義和分類 原核類原核類：細菌、放線菌、支原體、藍細胞：細菌、放線菌、支原體、藍細胞 立克次氏體、衣原體立克次氏體、衣原體微生物微生物 真核類真核類：真菌：真菌( (酵母菌、霉菌）、原生動物、酵母菌、霉菌）、原生動物、 顯微藻類顯微藻類 非細胞類非細胞類：病毒、類病毒、朊病毒：病毒、類病毒、朊病毒2 2 定義：定義： 一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱。一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱。細菌細胞形態(tài)顯微鏡檢照片細菌細胞形態(tài)顯微鏡檢照片 放大放大10001000倍桿菌倍桿菌 放大放大10001000倍球菌倍球菌3 3微生物細胞

2、結構示意圖微生物細胞結構示意圖 細菌細胞結構圖細菌細胞結構圖 真菌細胞結構圖真菌細胞結構圖4 4微生物的五大共性微生物的五大共性1 1、體積小，面積大、體積小，面積大 巨大的營養(yǎng)吸收面、代謝廢物的排泄面和環(huán)境信息的接受面巨大的營養(yǎng)吸收面、代謝廢物的排泄面和環(huán)境信息的接受面2 2、吸收多，轉化快、吸收多，轉化快 高速生長的物質基礎，活的化工廠高速生長的物質基礎，活的化工廠。3 3、生產(chǎn)旺，繁殖快、生產(chǎn)旺，繁殖快 大腸埃希菌大腸埃希菌20min20min分裂分裂1 1次，次，4848小時后的重量則達到地球的小時后的重量則達到地球的40004000倍。倍。 注：因營養(yǎng)條件的限制，實際不可能發(fā)生。注：

3、因營養(yǎng)條件的限制，實際不可能發(fā)生。4 4、適應強，易變異、適應強，易變異 極端環(huán)境的驚人適應能力極端環(huán)境的驚人適應能力5 5、分布廣，種類多、分布廣，種類多 空氣、水體、土壤、動植物都有分布，微生物有空氣、水體、土壤、動植物都有分布，微生物有1010多萬種。多萬種。5 5微生物的存在對醫(yī)療器械的影響微生物的存在對醫(yī)療器械的影響 活的微生物對滅菌影響活的微生物對滅菌影響 非過度滅菌的工藝因醫(yī)療器械上生物負載增加，滅菌非過度滅菌的工藝因醫(yī)療器械上生物負載增加，滅菌難度加大，可能導致滅菌失敗。難度加大，可能導致滅菌失敗。 活的微生物對使用者危害活的微生物對使用者危害 滅菌不徹底的無菌醫(yī)療醫(yī)療器械，根

4、據(jù)使用方式的不滅菌不徹底的無菌醫(yī)療醫(yī)療器械，根據(jù)使用方式的不同，可能出現(xiàn)炎癥、菌血癥等病理反應。同，可能出現(xiàn)炎癥、菌血癥等病理反應。 微生物尸體對使用者的危害微生物尸體對使用者的危害 典型例子：典型例子：G G- -菌細胞壁脂多糖成分菌細胞壁脂多糖成分( (內(nèi)毒素內(nèi)毒素) )通過輸液通過輸液進入人體血液，致使人體發(fā)熱。進入人體血液，致使人體發(fā)熱。6 6基本概念基本概念 生物負載的定義生物負載的定義 一件產(chǎn)品和一件產(chǎn)品和/ /或或無菌屏障無菌屏障上或其中存活的微生物總數(shù)。上或其中存活的微生物總數(shù)。對滅菌來說：生物負載應為無菌屏障內(nèi)的所有微生物。對滅菌來說：生物負載應為無菌屏障內(nèi)的所有微生物。因為

5、，滅菌需要殺滅屏障內(nèi)的所有微生物。因為，滅菌需要殺滅屏障內(nèi)的所有微生物。對使用來說：生物負載應為產(chǎn)品與人體的接觸面，因對使用來說：生物負載應為產(chǎn)品與人體的接觸面，因為屏障通常不與人的自然腔道、血管、肌肉等接觸。為屏障通常不與人的自然腔道、血管、肌肉等接觸。對生產(chǎn)過程控制來說：生物負載應是屏障內(nèi)所有的微對生產(chǎn)過程控制來說：生物負載應是屏障內(nèi)所有的微生物，反映過程的控制水平。生物，反映過程的控制水平。7 7基本概念基本概念校正因子校正因子correction factorcorrection factor 用于補償無法從產(chǎn)品和用于補償無法從產(chǎn)品和/ /或微生物培養(yǎng)中完全采集的數(shù)值?；蛭⑸锱囵B(yǎng)中完

6、全采集的數(shù)值。培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 culture conditionsculture conditions 促進微生物復蘇、生長和促進微生物復蘇、生長和/ /或繁殖所采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式。或繁殖所采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式?；厥章驶厥章?recovery efficiency recovery efficiency 用一特定技術從產(chǎn)品上采集和用一特定技術從產(chǎn)品上采集和/ /或培養(yǎng)微生物能力的測定值?；蚺囵B(yǎng)微生物能力的測定值。樣品份額（樣品份額（SIPSIP） sample item portion sample item portion 從某一產(chǎn)品單元上取出的用于試驗的部分從某一產(chǎn)品單元上取出的用

7、于試驗的部分。8 8產(chǎn)品選擇產(chǎn)品選擇的基本原則的基本原則 選擇和處理用于生物負載測定的產(chǎn)品的程序，應能確保所選擇和處理用于生物負載測定的產(chǎn)品的程序，應能確保所選產(chǎn)品對包括包裝材料和過程的常規(guī)生產(chǎn)具有代表性。選產(chǎn)品對包括包裝材料和過程的常規(guī)生產(chǎn)具有代表性。 若為若為生物負載測定的目的對產(chǎn)品進行分類生物負載測定的目的對產(chǎn)品進行分類，應記錄每一分，應記錄每一分類內(nèi)包含這一產(chǎn)品的理由。理由應包含所選產(chǎn)品在是整個類內(nèi)包含這一產(chǎn)品的理由。理由應包含所選產(chǎn)品在是整個分類里具有代表性的標準。分類里具有代表性的標準。 由于生物負載測定易受時間推由于生物負載測定易受時間推 移的影響而改變，應考慮生物移的影響而改變

8、，應考慮生物 負載測定的取樣時限。負載測定的取樣時限。9 9部分液體產(chǎn)品可能部分液體產(chǎn)品可能存在支持微生物生存在支持微生物生長的現(xiàn)象長的現(xiàn)象SIPSIP取樣的基本要求取樣的基本要求 如果已驗證生物負載在本產(chǎn)如果已驗證生物負載在本產(chǎn)品上或內(nèi)是均勻分布的，則品上或內(nèi)是均勻分布的，則SIPSIP可以是該產(chǎn)品的任何部分可以是該產(chǎn)品的任何部分。 否則，樣品應包含能代表所否則，樣品應包含能代表所制產(chǎn)品的每種相應材質而隨制產(chǎn)品的每種相應材質而隨機選取的產(chǎn)品部位。機選取的產(chǎn)品部位。 若已知生物負載分布，可以若已知生物負載分布，可以從認為對滅菌工藝最有嚴峻從認為對滅菌工藝最有嚴峻挑戰(zhàn)的產(chǎn)品部分選擇挑戰(zhàn)的產(chǎn)品部分

9、選擇SIPSIP。1010SIP選擇選擇產(chǎn)品產(chǎn)品表面積表面積植入物（不可吸收）植入物（不可吸收）質量質量粉粉末末手術服手術服植入物（可吸收）植入物（可吸收）長度長度管路（直徑一致）管路（直徑一致）體積體積流流體體生物負載的測定生物負載的測定測定方法微生物的采集微生物的采集（洗脫系數(shù)洗脫系數(shù)）采集微生物的技術能力采集微生物的技術能力（追求合適的采集技術）（追求合適的采集技術）微生物的可能種類和微生物的可能種類和它們在產(chǎn)品上的位置它們在產(chǎn)品上的位置采集技術對微生物活性的影響采集技術對微生物活性的影響（避免采集技術對微生物的傷害）（避免采集技術對微生物的傷害）檢測時產(chǎn)品的物理或化學特性檢測時產(chǎn)品的物

10、理或化學特性（確認：抑菌物質存在與否，如何去除）（確認：抑菌物質存在與否，如何去除）微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)（培養(yǎng)系數(shù)修正培養(yǎng)系數(shù)修正）微生物計數(shù)微生物計數(shù)1111生物負載的微生物鑒定生物負載的微生物鑒定 鑒定的意義鑒定的意義 通過微生物的鑒定，了解微生物的基本來源，為日常微生通過微生物的鑒定，了解微生物的基本來源，為日常微生物的控制提供依據(jù)；滅菌工藝的的適合性提供依據(jù)（是否物的控制提供依據(jù)；滅菌工藝的的適合性提供依據(jù)（是否存在耐受特定滅菌因子的芽孢菌的存在）。存在耐受特定滅菌因子的芽孢菌的存在）。 通常鑒定的方法通常鑒定的方法常規(guī)鑒定常規(guī)鑒定：染色特性；細胞形態(tài)；菌落；選擇性培養(yǎng)的使染色特性

11、；細胞形態(tài)；菌落；選擇性培養(yǎng)的使 用；生化特性；用；生化特性；分子水平鑒定分子水平鑒定：DNADNA測序后與測序后與數(shù)據(jù)庫提供遺傳序列數(shù)據(jù)庫提供遺傳序列比對比對。1212生物負載測定方法的確認生物負載測定方法的確認 若測定方法中包括采集產(chǎn)品上微生物，則對該技術適當性若測定方法中包括采集產(chǎn)品上微生物，則對該技術適當性的評價；的評價；確定回收率確定回收率, ,以便得到修正系數(shù)；以便得到修正系數(shù)；液體類的產(chǎn)品非常便捷液體類的產(chǎn)品非常便捷, ,通常不需要回收率通常不需要回收率. . 對包括培養(yǎng)條件和微生物計數(shù)技術在內(nèi)的微生物計數(shù)適當對包括培養(yǎng)條件和微生物計數(shù)技術在內(nèi)的微生物計數(shù)適當性的評價；性的評價；

12、不是所有的微生物可以通過單一培養(yǎng)基能有效培養(yǎng)出來的。不是所有的微生物可以通過單一培養(yǎng)基能有效培養(yǎng)出來的。 微生物鑒定技術適合性的評價。微生物鑒定技術適合性的評價。1313 常規(guī)測定和數(shù)據(jù)判讀常規(guī)測定和數(shù)據(jù)判讀確定確定樣品大小和取樣頻率。樣品大小和取樣頻率。測定方法要規(guī)定測定方法要規(guī)定, ,并形成作業(yè)指導書并形成作業(yè)指導書根據(jù)生物負載的使用目的確定鑒定的程度根據(jù)生物負載的使用目的確定鑒定的程度, ,通常鑒定是否存在芽孢通常鑒定是否存在芽孢生物負載數(shù)據(jù)用于確定滅菌工藝的處理程度，則生物負載數(shù)據(jù)用于確定滅菌工藝的處理程度，則根據(jù)具體要求進行根據(jù)具體要求進行應應滿足滅菌工藝設定、驗證和常規(guī)控制特定標準

13、中規(guī)定的關于生物負載滿足滅菌工藝設定、驗證和常規(guī)控制特定標準中規(guī)定的關于生物負載數(shù)據(jù)使用的切實可行的要求。數(shù)據(jù)使用的切實可行的要求。規(guī)定規(guī)定醫(yī)療器械上或醫(yī)療器械上或屏障內(nèi)屏障內(nèi)的生物負載的可接受限量。的生物負載的可接受限量。中國有中國有GB15980-GB15980-19951995的標準，但未有明確的國際標準。如果生物負載的信息用于設定的標準，但未有明確的國際標準。如果生物負載的信息用于設定滅菌條件，則限量比較好設定。滅菌條件，則限量比較好設定。根據(jù)根據(jù)一段時間得到的生物負載測定數(shù)據(jù)來確定趨勢一段時間得到的生物負載測定數(shù)據(jù)來確定趨勢，進行趨勢管理，進行趨勢管理。 1414生物負載測定方法的維

14、持 產(chǎn)品和/或生產(chǎn)過程的改變 通常重新進行回收率的測試或生物負載的測試。 生物負載測定方法的改變 應對生物負載測定常規(guī)方法的任何變化進行評價。 評價測定結果的變化的影響；設 新的回收率。 先前進行的確認和回收率是否仍有效。生物負載測定方法的重新確認1515重復回收重復回收確定回收率確定回收率 重復回收進行重復回收進行回收率回收率確認確認 使用自然的產(chǎn)品，初次采集的微生物數(shù)值占連續(xù)多次采集使用自然的產(chǎn)品，初次采集的微生物數(shù)值占連續(xù)多次采集總數(shù)值的比值?？倲?shù)值的比值。 方法的理論基礎方法的理論基礎 生物負載的確認方法應重復進行，直到回收的微生物累計生物負載的確認方法應重復進行，直到回收的微生物累計

15、數(shù)量沒有明顯增加。每重復一次后，從產(chǎn)品上或產(chǎn)品部分數(shù)量沒有明顯增加。每重復一次后，從產(chǎn)品上或產(chǎn)品部分上洗脫液全部回收并計數(shù)。比較連續(xù)回收得到的累計結果。上洗脫液全部回收并計數(shù)。比較連續(xù)回收得到的累計結果。 注意注意：本方法未必精確。產(chǎn)品上回收的微生物數(shù)量及實際存在的微生本方法未必精確。產(chǎn)品上回收的微生物數(shù)量及實際存在的微生物數(shù)量之間的確切關系永遠無法驗證物數(shù)量之間的確切關系永遠無法驗證。1616重復回收重復回收確定回收率確定回收率產(chǎn)品要求 本身具有一定的微生物負載水平，如果產(chǎn)品本身負載水平低，則不適合采用該方法，應采用產(chǎn)品人工接種法。重復采集的次數(shù) 準確的重復次數(shù)通常取決于 產(chǎn)品特性，構成生物

16、負載的微生物和初始污染水平等。預試驗可用于確定重復的次數(shù)。在某些產(chǎn)品上，進行重復處理后有必要確定產(chǎn)品上是否還存在存活微生物。這可以通過以下方法實現(xiàn)：用熔化的回收培養(yǎng)基涂在產(chǎn)品表面上，讓培養(yǎng)基變硬，然后使產(chǎn)品在規(guī)定的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)形成的菌落計數(shù)。將產(chǎn)品浸于液體回收培養(yǎng)基中，在規(guī)定的培養(yǎng)條件下，檢查是否生長。浸于液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)后，若產(chǎn)品中的一小部分出現(xiàn)存活的微生物，可通過MPN方法來計數(shù)結果。但是若全部結果都表明有微生物生長，則不能采用MPN法，應重新考慮確認方法。1717重復回收的修正系數(shù)1818處理處理產(chǎn)品數(shù)產(chǎn)品數(shù)123451605070554521012523310200401001瓊

17、脂覆蓋21210總的菌落計數(shù)7364795349第一次處理：6050705545總數(shù)：7364795849第一次處理的回收率：82%78%89%95%92%第一次處理后的平均回收率： = 87.2 %范圍= 78%95%計算中已包括了瓊脂覆蓋得到的菌落數(shù)。某些醫(yī)療器械可能會無法應用瓊脂覆蓋。運用首次處理后平均回收率，運用首次處理后平均回收率，回收效率的修正系數(shù)可為：回收效率的修正系數(shù)可為：15. 12 .87100有些應用中可使用平均回收率范圍的最低值，以反應出最壞情況。有些應用中可使用平均回收率范圍的最低值，以反應出最壞情況。這一決定將會影響數(shù)據(jù)的使用。這一決定將會影響數(shù)據(jù)的使用。產(chǎn)品接種法

18、產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 產(chǎn)品接種法產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 產(chǎn)品上人工接種微生物后，初次采集的微生物數(shù)量占 接種到產(chǎn)品上的微生物的比值?？蔀槊恳划a(chǎn)品計算百分率，并用其確立回收率。 產(chǎn)品的要求 產(chǎn)品首先應進行適合的滅菌，并確?？赡軐ξ⑸镉幸种频臏缇橘|的有效去除。 如用EO滅菌時，則應驗證殘留水平是否存在對微生物的抑制作用。1919產(chǎn)品接種法產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 接種的微生物 最常用 需氧菌芽孢接種，因為使用細菌繁殖體時，常因干燥失去活性，所以通常不使用繁殖體。 芽孢懸液分布在產(chǎn)品上，應包括最難洗脫 的部位。 但應注意為了刻意追求WORST CASE，將芽孢全部接種在最

19、難的位置，導致回收率過低的異常。2020接種法的修正系數(shù)接種法的修正系數(shù) 制備懸液稀釋液，每0.1mL中含有100個芽孢。向器械所選部分接種0.1mL該稀釋懸液，并在單項流狀態(tài)下干燥。 注意接種體積，體積過大不易干燥；體積過小，則分布不均勻。 使經(jīng)接種的產(chǎn)品經(jīng)受得住所選采集技術，采集的平均芽孢數(shù)是35，其范圍為2545之間。 回收率的修正系數(shù)如下：21219 . 235100微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備 袋蠕動 將試驗樣品和一已知體積的洗脫液裝在一個無菌胃型袋中。開動往復式攪棒，使洗脫液貫穿試驗樣品內(nèi)外。 應規(guī)定處理時間。 該方法尤其適用于軟質、纖維和/或吸附性材料，但可能不適用于

20、能刺破袋的任何材質（如帶針或含有堅硬部分的器械）。 若使用了較大大量的洗脫液，可能會生成含有低濃度微生物的懸浮液。可使用膜過濾法濾掉洗脫液。2222微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備超聲波洗脫 將試驗樣品浸入裝有已知體積洗脫液的適當容器中。將容器連同內(nèi)裝物一起在超聲波清洗器中進行處理，或將超聲波探頭浸入到容器內(nèi)洗脫液中進行處理。超聲波也能使微生物失去活性，尤其是大能量傳輸時，使用超聲波探頭會比超聲波清洗器更有可能使其失去活性。根據(jù)要求應驗證超聲法。 應規(guī)定超聲處理的常規(guī)頻率和處理時間。而且，還應規(guī)定試驗樣品在超聲波清洗器中的安放位置。應注意限制同時進行處理的試驗樣品數(shù)量，以便阻斷超聲處理

21、源。 該方法尤其適用于不透液體的固體試驗樣品以及形狀復雜的產(chǎn)品。該方法對某些醫(yī)療器械可能產(chǎn)生破壞作用，尤其是對帶有電子部件的器械，如植入式脈沖發(fā)生器。 超聲處理能量和超聲處理持續(xù)時間不應太強或太長，以免破壞微生物并導致死亡，或是使洗脫液過熱。2323微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備 振搖（機械或手工方式） 將試驗樣品浸入裝有已知體積洗脫液的適當容器中，并用機械振動器（如往復式、軌道或機械腕搖床）進行振搖。也可用手工振搖，但其效力會因操作人員而異。 應規(guī)定振搖時間和頻率。 可以加入一定大小的玻璃微珠增加表面磨損以及由此提高回收效率。加入的玻璃微珠的大小以及振搖時間和頻率不能導致過熱和/或

22、對微生物造成可能的破壞。 增加玻璃微珠將增加微生物可附著的表面積。2424微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備渦旋混合 將試驗樣品浸入裝有已知體積洗脫液的密閉容器內(nèi)，該容器壓在放置在旋渦混合器的旋轉墊以形成渦旋。渦旋的形成取決于手動施加的壓力。渦旋中的變化會使微生物洗脫產(chǎn)生差異。 應規(guī)定所用容器、混合時間以及設定的混合器的速度。 該方法操作簡單快捷，但僅適用于小的試驗樣品。沖洗 讓洗脫液通過試驗樣品的內(nèi)腔?？梢钥恐亓虮脕硎挂后w流動。另外也可將洗脫液充入產(chǎn)品中，夾住并抖動。 應規(guī)定器械與洗脫液的接觸時間、沖洗速度及液體體積。 器械結構及腔體尺寸會限制從內(nèi)表面完全移除微生物所必須的沖力。25

23、25微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備攪切（碎裂） 將試驗樣品浸入裝有已知體積洗脫液的適當容器內(nèi)。在規(guī)定的一段時間內(nèi)攪切或振搖試驗樣品的時間。 根據(jù)試驗樣品和攪切器來規(guī)定攪切時間，但不應超過會導致洗脫液過熱和對微生物造成破壞。 該技術提供了將試驗樣品分成足夠小的部分的方法，以便通過接種平板培養(yǎng)技術對微生物進行計數(shù)。擦拭 含有吸附性材料的棉拭子通常被固定于桿或把手上。樣品材料可以是可溶性的或不可溶性的。 通常使用的方法是用洗脫液濕潤棉拭子，并用棉拭子擦拭界定好的試驗樣品的表面。在有些情況下，可以先潤濕表面，然后用干棉拭子擦拭，這樣可提高回收效率。然后將棉拭子轉放至洗脫液中，并攪動從棉拭子上

24、洗脫微生物。另外，若使用的是可溶性棉拭，拭子會溶解到稀釋液中。 擦拭法是對不規(guī)則形狀產(chǎn)品或難接近的區(qū)域取樣的一個有效的方法。該方法也可用于大面積區(qū)域的取樣。 該方法會因擦拭方式的不同而更易出錯。而且，通過擦拭不可能將表面上的全部微生物都收集起來。有些微生物會被棉拭子本身吸附，以致于被檢測不到。 棉拭子中不應含有滅菌劑或抑菌劑。2626洗脫液體2727溶液水中的濃度應用緩沖蛋白胨水0.067 mol/L磷酸鹽；0.43 % 氯化鈉； 0.1 % 蛋白胨；通用六偏磷酸鈉林格氏溶液 1/4 強度溶解海藻酸鈣拭子蛋白胨水 0.1 %1.0%通用磷酸鹽緩沖溶液0.02 mol/L磷酸鹽；0.9 %氯化鈉

25、；通用林格氏溶液1/4 強度通用氯化鈉0.25 %0.9 %通用硫代硫酸鹽林格氏溶液1/4 強度中和余氯水稀釋含水樣品；計數(shù)前制備可溶材料的等滲壓溶液；%此表并未包括全部。表面活性劑，如聚山梨醇酯（Tween）80可以添加到洗脫液和稀釋液中。根據(jù)具體的應用，通常濃度在0.01%0.1%之間。應使用適當濃度的表面活性劑，并加以特殊處理以防止泡沫形成。微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備接觸板 接觸板或玻璃片可用凝固的培養(yǎng)基放在樣品表面上，使存活的微生物能附著到該培養(yǎng)基的表面，然后再培養(yǎng)接觸板或玻璃片，至形成可計數(shù)的菌落。 該方法優(yōu)點在于使用方便。結果與凝固培養(yǎng)基的接觸表面直接相關。 表面上自

26、然集聚的細胞群、菌落在瓊脂表面散布、瓊脂干燥、可能存在厭氧菌等都是潛在的不利因素。 由于該方法的回收率通常較低，所以只有在其它方法不適用的情況下才使用。接觸板和玻璃片通常只適用于平的或規(guī)則的表面。瓊脂覆蓋 當生物負載低以及產(chǎn)品構造適合時，在產(chǎn)品的表面涂上熔化的瓊脂培養(yǎng)基（最高溫度在45），培養(yǎng)至產(chǎn)生可見菌落。 表面上自然集聚的細胞群、菌落在瓊脂表面散布、瓊脂干燥、可能存在厭氧菌等都是潛在的不利因素。2828微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備最大可能數(shù)（MPN法）MPN法是一種沿用已久并有充分文獻根據(jù)，用于估算在產(chǎn)品內(nèi)隨機分布的存活微生物數(shù)量的方法。它主要用于食品和水產(chǎn)品等行業(yè)（與液體、粉

27、末和半固體的產(chǎn)品或者原材料一起使用）。這種方法尤其適用于生物負載平均數(shù)低的產(chǎn)品。這種方法包括（按體積或者重量）對產(chǎn)品進行重復取樣，其中每次取樣的樣品中均含有相同數(shù)量的可存活微生物（因而要求分布的隨機性），然后通過將樣品轉到液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)，單獨記下有可存活微生物存在的每個樣品。當具有足量的洗脫液，可將其一系列的稀釋液接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，使部分接種的培養(yǎng)基在隨后的培養(yǎng)中不產(chǎn)生可見生長。用表現(xiàn)出生長的稀釋度，估算出樣品中或產(chǎn)品取樣的絕大部分中存在的存活微生物的數(shù)量；關于此估算值，95%的可信區(qū)間是相對寬的。該估算和其置信界限來自MPN表格（DeMan18），此表是在一定的假設條件下編制的，即根據(jù)泊

28、松分布原理，重復取樣樣品中存在的可存活微生物的數(shù)量是圍繞一個平均數(shù)量分布的。MPN方法應用的關鍵要求是微生物總數(shù)在整個（研究中的）產(chǎn)品上隨機分布。因此，對于液體用的醫(yī)療器械、黏性液體、粉末，或在單一產(chǎn)品使用如洗脫液等液體估算生物負載的情況下，MPN方法可以有生物負載測定值。但是，這種方法并不普遍適用于在固體醫(yī)療器械上的生物負載測定。典型的情況是，在這些器械上構成低平均值生物負載的若干微生物的分布通常是隨機的，一個總數(shù)的微生物總是有高比例的不可檢測的有機物和少量的帶“峰值”的微生物（實質構成平均值生物負載）。在MPN的應用中，“峰值”將會被簡單地記錄為一個正值，因而，只以公式化的方式構成此平均值

29、，而不是用數(shù)字表示。這可能導致對生物負載估計過低，而得出一個不符合要求的結果。MPN法易于操作，并且該方法是基于統(tǒng)計學，所以它更適用于一般性評估而不是精確測定。2929微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備 膜過濾法 洗脫液過濾后，將濾器放到適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，形成可見菌落，是對存活微生物計數(shù)的一種有效方法。通常，孔徑不大于0.45的過濾器適于采集微生物。 對含有類似纖維狀產(chǎn)品殘留物等微粒的洗脫液進行膜過濾可能比較困難，因微粒會阻塞過濾器。 膜過濾法更適用于微生物濃度較低的懸液。3030微生物采集技術和設備微生物采集技術和設備平板傾注 使用平板傾注技術，將一定量的懸浮液在在約45的溫度與融化的瓊脂相混合，然后傾注到平板放至凝固。對平板進行培養(yǎng)至菌落形成并進行計數(shù)。平板涂抹 平板涂抹技術是用涂抹器將一定量懸液涂在固體營養(yǎng)基表面。螺旋涂板 螺旋涂板技術運用自動裝置將一定量微生物懸液涂在固體培養(yǎng)基表面上。懸液涂抹是以遞減的速度從培養(yǎng)板中心以螺旋線軌跡向周邊運動。經(jīng)過培養(yǎng)后，對全板或部分板，運用專用的計數(shù)柵和計數(shù)技術來統(tǒng)計原始懸液中的存活微生物數(shù)量。3131微生物采集技