食品生物技術(shù)導(dǎo)論第2章基因工程

1、1第二章 基因工程與食品產(chǎn)業(yè)1 基因工程概述1.1基因工程的概念及主要內(nèi)容1.1.1基因工程的概念 基因工程是用人工的方法把不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）分離出來，在體外進(jìn)行剪切、拼接、重組，形成基因重組體，然后再把重組體引入宿主細(xì)胞或個(gè)體中得到高效表達(dá)，最終共獲得人們所需要的基因產(chǎn)物。23l 食品基因工程是指利用基因工程的技術(shù)和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，以改良食品的品質(zhì)和形狀，提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，貯藏加工性狀以及感官性狀的技術(shù)。如轉(zhuǎn)基因食品等41.1.2基因工程的主要內(nèi)容基因工程應(yīng)包括以下幾個(gè)主要的內(nèi)容和步驟：l （1）從復(fù)雜的生物體中，分離出帶有目的基因的DNA片段。l （2）在體外

2、將外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。l （3）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞中，并與之一起增殖。5l （4）從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的寄主細(xì)胞克隆即轉(zhuǎn)化子。l （5）從這些篩選出來的轉(zhuǎn)化子克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用。l （6）將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 6基因工程的發(fā)展概況l 從上述基因工程的定義，我們可以把基因工程看成由三大“主件”組成的。這三大“主件”包括：帶有目的基因的DNA片段、載體DNA分子和受體細(xì)胞。l 在基

3、因工程發(fā)展的這短短的二十多年中，科學(xué)家們對這三大“主件”進(jìn)行了大量的研究，積累了無數(shù)的成果。 7l 分子生物學(xué)特別是重組DNA技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用使有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究獲得了迅速的發(fā)展人們不僅相繼發(fā)現(xiàn)了斷裂基因、重疊基因和假基因等多種新的基因類型同時(shí)還相當(dāng)詳盡地弄清了原核和真核基因的結(jié)構(gòu)特征。l 關(guān)于基因組核苷酸全序列的測定與分析、是重組DNA技術(shù)促進(jìn)基礎(chǔ)生物學(xué)研究的又一出色的范例。8l 由于基因克隆技術(shù)的發(fā)展。已使生物技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)藥行業(yè)中發(fā)揮了重要的作用。重組DNA技術(shù)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是它往往可以使一個(gè)生物獲得與之固有性狀完全無關(guān)的新功能使人們可以在大量擴(kuò)增的細(xì)胞中生產(chǎn)特殊的蛋白質(zhì)其意

4、義是相當(dāng)重大的。9l 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵問題是如何培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的禾谷類農(nóng)作物。l 當(dāng)前基因工程技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于這個(gè)研究領(lǐng)域尤其是最近10余年以來隨著外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中首次獲得成功的表達(dá)。應(yīng)用重組DNA技術(shù)培育具有改良性狀的糧食作物的工作巳初見成效、轉(zhuǎn)基因植物的種植面積逐年上升(表1-1)。1011l 轉(zhuǎn)基因植物的工作技其發(fā)展水平可以分為三個(gè)階段：第一階段主要是對有重要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)意義的目的基因進(jìn)行分離與改造；第二階段的主要目標(biāo)是培育出具有改良的重要經(jīng)濟(jì)性狀的工程植株；第三階段的發(fā)展方向是培育出具有生物反應(yīng)器功能的工程植株。l 現(xiàn)在已經(jīng)培育成功了一批分別具有抗病、抗蟲和抗除草劑性

5、狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。12l 基因工程在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的利用方面主要是將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為專門生產(chǎn)一些特殊藥物的“生物工廠”(bio-factories)。l 基因工程仍在深入發(fā)展之中。132工具酶和基因載體l 基因工程的操作依賴于許多重要的酶（限制性內(nèi)切酶、核酸酶、連接酶、聚合酶等）作為工具來對基因進(jìn)行切割和拼接操作，這些酶被稱為工具酶（enzyme of tools）。l 目的基因要進(jìn)入宿主細(xì)胞，有兩種方式：1.直接導(dǎo)入2.通過載體的運(yùn)載 這種在細(xì)胞內(nèi)具有自我復(fù)制功能的運(yùn)載目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的運(yùn)載體，叫做基因工程載體（Vector or Carrier）。142.1基因工程的工具酶2.1.1基因克隆

6、所需的核酸酶l 通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核苷酸發(fā)生水解斷裂的酶叫做核酸酶。l 其中專門水解斷裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase）；而特異水解斷裂DNA分子的叫做脫氧核糖核酸酶（DNase）。15l 核酸酶按其水解斷裂核酸酶分子的方式不同，可以分兩種類型：一類是從核酸分子的末端開始，一個(gè)核苷酸一個(gè)核苷酸的消化降解多核苷酸鏈，叫做核酸外切酶（exonuclease）一類是從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔殉尚∑危凶龊怂醿?nèi)切酶(endonuclease)16l 2.1.1限制性內(nèi)切酶限制酶能夠識(shí)別DNA大分子鏈上特定的核苷酸順序，并能在某一特定部位

7、將DNA斷裂。l 在限制性核酸內(nèi)切酶的作用下，侵入細(xì)菌的外源DNA會(huì)被切割成各種片段，而其自身的DNA由于修飾酶（通常是一種甲基化酶）的保護(hù)作用而免受限制酶的降解。172.1.1.1限制性內(nèi)切酶的分類l 限制性核酸內(nèi)切酶和修飾甲基化酶共同參與了寄主細(xì)胞的限制和修飾系統(tǒng)，由此系統(tǒng)的類型可將限制酶分為、型， 型和型酶在同一蛋白中帶有修飾（甲基化）和限制活性， 型限制修飾系統(tǒng)則由分別的限制酶和修飾酶組成。18l 型限制酶的典型例子來自大腸桿菌K菌株和B菌株，這些酶是由三個(gè)不同的亞基組成的高分子復(fù)合物，相對分子量約310000。l 該酶作用除了鎂離子外，還需要ATP、S腺苷蛋氨酸（SAM）作為輔助因子

8、，DNA降解的同時(shí)ATP水解。l 該酶對雙鏈DNA具有專一性，它與DNA分子上的特定識(shí)別序列（非對稱序列）相作用，然后酶沿DNA分子移動(dòng)，移動(dòng)方向可能在兩個(gè)方向上均可，并在某一其它部位切斷DNA，切裂部位似乎并不確定，但又不是完全隨機(jī)的。19l 型限制酶除了具有內(nèi)切酶活力外，還有甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶活力。l 型限制酶相對分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，輔助因子多，作用機(jī)制復(fù)雜的缺點(diǎn)，切識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致，切除片段重復(fù)性不高，所以這種酶的使用受到很大限制20l 型限制性內(nèi)切酶首先來自流感嗜熱桿菌。此酶是一類分子量較小的單體蛋白，僅需要鎂離子作為輔助因子，該酶沒有甲基化修飾功能，這類酶在基因

9、工程實(shí)驗(yàn)中相當(dāng)常用。l 型限制性內(nèi)切酶有特定的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)，識(shí)別序列約為4-12bp，約有一半的型限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)是6個(gè)核苷酸21l 型限制酶的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)比較接近，大約在25-27bp，切割產(chǎn)物的5端突出2-3個(gè)核苷酸，它的作用輔助因子與型酶相同，有甲基化修飾功能，無ATP酶和DNA解旋酶活力。l 型限制酶在重組DNA分子建造中有特殊的價(jià)值，在DNA分子進(jìn)入載體后，可作為試劑識(shí)別特殊的DNA序列。222.1.1.2 限制性內(nèi)切酶的命名l 其命名原則是，用具有某種限制性內(nèi)切酶的有機(jī)體學(xué)名縮寫來命名：1. 有機(jī)體屬名的第一個(gè)字母（大寫，斜體）和種名的前兩個(gè)字母（小寫，斜體）構(gòu)成

10、基本名稱；2. 株系數(shù)字通常省略，如果酶來自于特殊菌株中，應(yīng)加上菌株名稱符號；3. 羅馬數(shù)字用來表示從同一個(gè)細(xì)菌中分離出來的不同的限制性內(nèi)切酶。23表1限制性內(nèi)切酶命名名稱EcoRHindHindHpa 屬名（大寫、斜體）EHHH種名（小寫、斜體）coininpa株名Rdd-序數(shù)來源菌株Escherichia coli R株Haemophilus influenzae d株Haemophilus influenzae d株Haemophilus parainfluenzae24l EcoR是最早發(fā)現(xiàn)的型限制性內(nèi)切酶，它可以特異地結(jié)合在一段6個(gè)核苷酸的DNA區(qū)域里，在每條鏈的鳥嘌呤和腺嘌呤之間切

11、斷DNA鏈,產(chǎn)生兩個(gè)單鏈末端，每個(gè)末端會(huì)有4個(gè)核苷酸延伸出來，這種雙鏈DNA中沒有配對的堿基末端被稱為黏性末端（cohesive ends）。2526型限制性內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)l 型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特點(diǎn)：大多數(shù)酶識(shí)別順序很嚴(yán)格，有少數(shù)有變動(dòng)的余地；識(shí)別序列的堿基數(shù)一般為4-6個(gè)堿基對，一般都富含GC；大多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有180o旋轉(zhuǎn)對稱性（或稱為回文結(jié)構(gòu)，核酸的這種結(jié)構(gòu)與在生物體內(nèi)和蛋白作用有關(guān)），少數(shù)酶切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外，也具有旋轉(zhuǎn)對稱性；型酶的識(shí)別順序中的堿基被甲基化修飾后會(huì)影響部分酶的外切割作用。27一些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)28l 型限制性內(nèi)切酶的切割方式：型限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)絕大

12、多數(shù)在識(shí)別順序中，或在識(shí)別順序的兩個(gè)組成部分之間（如Bgl）。只有極少數(shù)例外，它們的識(shí)別順序是不對稱的，切割發(fā)生在識(shí)別順序之外。l 切割方式有三種，就切割位點(diǎn)相對于二重對稱軸的位置而言，在對稱軸5側(cè)切割產(chǎn)生5粘性末端，在對稱軸的3 側(cè)切割產(chǎn)生3粘性末端，在對稱軸切割產(chǎn)生平端。29l 型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)與切割方式之間的關(guān)系，可以分為以下四種：1.識(shí)別順序不同，切割方式也不同。2.識(shí)別順序不同，切割產(chǎn)生的粘性末端相同，這類酶稱為同尾酶，此時(shí)兩種酶產(chǎn)生相同的粘端，可用連接酶將其連接起來。3.識(shí)別順序相同，切割方式不同。4.相同的識(shí)別順序，切割方式亦相同，如Hpa 與Msp，但Msp能切割甲基化

13、的胞嘧啶通常我們將來源不同，但能切割同一靶序列的酶稱為同裂酶或異源同功酶30l 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端的連接1.匹配末端的連接：用同一種酶酶切產(chǎn)生的帶相同突出端的兩個(gè)片段；或用不同的酶酶切但帶有相同突出端的兩個(gè)片段，可在連接酶作用下連接。2.平端連接：可以直接連接，連接效率較低。3.不匹配粘端連接：一種是采用Klenow酶將粘端補(bǔ)平，或用S1酶切除突出的核苷酸后再用連接酶連接；二是用Klenow酶將粘端部分補(bǔ)平。31限制酶反應(yīng)的影響因素1.溫度：一般最適反應(yīng)溫度為37左右2.緩沖液：不同的酶對離子強(qiáng)度、pH值有不同的要求，一般分為低鹽、中鹽和高鹽3.時(shí)間：主要取決于加入的酶量與DNA的量之間的

14、關(guān)系，通常作用時(shí)間為1-1.5小時(shí)4.反應(yīng)體積和甘油濃度：商品化的限制酶均加甘油作為保護(hù)劑，所以在酶反應(yīng)時(shí)，加酶量不宜太多，否則甘油濃度偏高，影響反應(yīng)5.DNA純度和結(jié)構(gòu)：DNA樣品中的蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑及RNA等雜質(zhì)均會(huì)影響酶切反應(yīng)的速度和酶切的完全程度32星號活性l 在商品目錄或某些論著中，一些酶被打上星號（*），如EcoR*意思是說在反應(yīng)體系變化時(shí)，酶的性能甚至酶切位點(diǎn)可能會(huì)改變關(guān)于星號活性的機(jī)制還不清楚，維持反應(yīng)體系適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度、低溫或低酶濃度，縮短反應(yīng)時(shí)間可以克服星號活性l 限制酶識(shí)別位點(diǎn)的兩頭必須有一定長度的旁側(cè)序列才能被相應(yīng)的酶作用332.1.1.3限制性內(nèi)切酶的主要用途1. 在

15、特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段；2. 建立分子的限制性內(nèi)切酶物理圖譜；3. 構(gòu)建基因文庫；4. 用限制性內(nèi)切酶切出相同的黏性末端，以便重組DNA。342.1.2DNA連接酶l 能將兩段DNA拼接起來的酶叫做DNA連接酶（ligase）。該酶催化DNA相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，將DNA單鏈缺口封合起來。l DNA連接酶的作用需要ATP或NAD+作為輔助因子l DNA連接酶的來源有兩種：一種來自大腸桿菌，以NAD+作為能源；一種來源于T4噬菌體，以ATP為能源，兩種酶作用機(jī)理相同35T4 DNA連接酶的作用36l T4DNA連接酶為相對分子量680

16、00的多肽，是T4噬菌體感染大腸桿菌而產(chǎn)生的。它的用途有：1. 鏈接帶匹配黏端的DNA分子2. 使平端的雙鏈DNA分子互相連接或使合成的接頭相連接37382.1.3DNA聚合酶l DNA聚合酶（ DNA polymerase）在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程中起著重要的作用。通常分為DNA聚合酶、型三類。l 其中pol和pol主要參與DNA修復(fù)過程， pol則同DNA復(fù)制有關(guān)，基因工程中主要應(yīng)用的是DNA聚合酶。39l 基因工程中很多都需要DNA聚合酶催化DNA體外合成反應(yīng)，這些酶作用均需要模板，合成產(chǎn)物的序列與模板互補(bǔ)，基因工程中常用的DNA聚合酶有：1. 大腸桿菌聚合酶(全酶)2.大腸桿菌聚合酶大

17、片段（Klenow片段）3.T4噬菌體DNA聚合酶404. T7噬菌體聚合酶及經(jīng)修飾的T7噬菌體聚合酶（測序酶）5. 耐熱DNA聚合酶（Taq DNA 聚合酶）6. 末端轉(zhuǎn)移酶7. 逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA 的DNA 聚合酶）41422.1.3.1大腸桿菌DNA聚合酶l 該酶相對分子量為109000，是一條約1000個(gè)氨基酸殘基的多肽酶。它有三種活性：1. 53 DNA 聚合酶活性：催化結(jié)合在DNA模板鏈上的引物核酸3-OH與底物dNTP的5磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵，釋放出焦磷酸并使鏈延長，延長方向532. 3 5外切核酸酶活性：即從游離的3-OH末端降解單鏈或雙鏈DNA稱為單核苷酸，其意義在

18、于識(shí)別和消除不配對的核苷酸43443. 53外切核酸酶活性：從5末端降解雙鏈DNA成單核苷酸或寡核苷酸，液降解DNARNA雜交體的RNA成分45l 該酶的主要用途1. 用切口平移方法標(biāo)記DNA：用于制備核酸分子雜交用探針 。在條件嚴(yán)格控制下，可以使單鏈缺口只發(fā)生聚合作用，無3 5核酸外切酶活性，生長鏈取代親本鏈，DNA探針形成。2. 3粘端的末端標(biāo)記：3. 使用其53外切核酸酶活性降解寡聚核苷酸作為合成cDNA第二條鏈的引物462.1.3.2大腸桿菌聚合酶Klenow片段l 相對分子量76000，為一條單多肽鏈，與大腸桿菌聚合酶全酶相比，少了53外切核酸酶活性。其主要用途為：1. 隨機(jī)引物標(biāo)記

19、核酸探針2. 補(bǔ)平DNA5粘端或進(jìn)行3端標(biāo)記3. cDNA克隆中，用于合成第二條cDNA鏈4. 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA5. 應(yīng)用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA測序472.1.3.3 T4噬菌體DNA聚合酶l 相對分子量114000，功能與Klenow片段相似。但其的3 5外切核酸酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA的作用更強(qiáng)，而且外切酶活性比Klenow片段強(qiáng)200倍。48l 其主要用途：1.補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的3凹端2.對帶有3突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記3.標(biāo)記作探針用的DNA片段4. 將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化為平端5. 使結(jié)合于單鏈DNA模板上的誘變

20、寡聚核苷酸引物得到延伸492.1.3.4T7噬菌體聚合酶及經(jīng)修飾的T7噬菌體聚合酶（測序酶）l 該酶的持續(xù)合成能力是DNA聚合酶中最強(qiáng)的，所催化合成的DNA平均長度比用其它聚合酶所合成的DNA長度長得多。 3 5外切核酸酶活性很強(qiáng)，比Klenow片段強(qiáng)1000倍，無53外切核酸酶活性。其主要用途為：1. 用于拷貝片段模板的引物延伸反應(yīng)2. 通過補(bǔ)平或交換（置換）反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記3. Sanger雙脫氧測序法對長片段DNA進(jìn)行測序用502.1.3.5耐熱DNA聚合酶（Taq DNA 聚合酶）l 相對分子量65000，是一種耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶。l Taq DNA聚合酶分離自水棲高溫

21、菌，其最適反應(yīng)溫度為75-80攝氏度，且經(jīng)90攝氏度以上的加溫后仍可在溫度恢復(fù)后復(fù)性。所以這種酶特別適合于在不同溫度點(diǎn)進(jìn)行循環(huán)加溫與降溫而不喪失酶的活性。因此被廣泛應(yīng)用于各種PCR。 51表2 DNA聚合酶特性聚合酶名稱35 核酸外切酶活性53核酸外切酶活性聚合酶反應(yīng)速度持續(xù)合成能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中速低Klenow大片段酶低無中速低逆轉(zhuǎn)錄酶無無低速中T4DNA聚合酶高無中速低T7DNA聚合酶高無快速高TaqDNA聚合酶無有快速高522.1.3.6末端轉(zhuǎn)移酶l 末端轉(zhuǎn)移酶發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物胸腺，它能催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3羥基末端上，催化作用不要求有模版，但需要有Co2+的存在。

22、末端轉(zhuǎn)移酶可給一些DNA的3羥基末端接上寡dA或dG，另一些DNA的3羥基末端接上寡dT或dC，混合這些分子，即可使同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子nppin)PdN(DNAndNTPDNA22CoMgOH或53l 末端轉(zhuǎn)移酶的主要作用：1. 給載體或cDNA加上互補(bǔ)的同聚尾2. DNA片段3末端的放射性同位素標(biāo)記54552.1.3.7逆轉(zhuǎn)錄酶l 來源于禽類成髓細(xì)胞白血病病毒，又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。該酶催化以單鏈RNA為模版生成雙鏈DNA的反應(yīng)。由于該反應(yīng)中遺傳信息流動(dòng)方向與絕大多數(shù)生物轉(zhuǎn)錄生成方向相反，故此反應(yīng)稱為逆轉(zhuǎn)錄作用。l 逆轉(zhuǎn)錄酶具有三種活性：1. RNA 指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)2

23、. DNA指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)3. RNA的水解反應(yīng)56Reverse transcription 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RNA 3 35 (reverse primer 反向引物反向引物)5 3 3Reverse transcription （逆轉(zhuǎn)錄）（逆轉(zhuǎn)錄）Transcription（轉(zhuǎn)錄）（轉(zhuǎn)錄）Section 2 Enzymes and vectorsDNADNA57l 基因工程中有兩種商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶：一種來自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（avian myoblastosis virus，AMV）提取的；另一種是Moloney鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus

24、，Mo-MLV）克隆的逆轉(zhuǎn)錄酶編碼基因在大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物。58l 禽源逆轉(zhuǎn)錄酶和鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶均屬多功能酶，它們的共同性質(zhì)是：具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，可以RNA為模板，以寡聚脫氧核糖核苷酸為引物，合成互補(bǔ)的DNA（cDNA）；具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，但不具DNA聚合酶那樣的35外切酶活性；具有RNaseH活性，即從5或3端連續(xù)地降解RNA DNA雜種雙鏈中的RNA部分。 59l 在基因工程中，逆轉(zhuǎn)錄酶的主要用途是：將真核基因的mRNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)；對具有5突出端的DNA片段的3端進(jìn)行填補(bǔ)（補(bǔ)平反應(yīng)）和標(biāo)記，制備探針；代替Klenow大片

25、段，用于DNA序列測定。602.1.4堿性磷酸酯酶l 在基因工程中得到廣泛使用的堿性磷酸酶主要有兩種：1.從大腸桿菌提取的BAP;2.從牛小腸提取的CIP； 這兩種酶均能去除DNA、RNA、rNTP、dNTP的5磷酸基，產(chǎn)生5羥基末端。61l 基因工程中堿性磷酸酶主要用于：1. 用32P標(biāo)記5末端前，先去除其DNA和RNA的5磷酸基2. 去除DNA線性分子末端的5磷酸基，防止片段間彼此相連?？寺≥d體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后為了防止自身連接，需用此酶處理除去5磷酸基62632.1.5 Sl核酸酶l Sl核酸酶來自米曲霉，分子量為32000，它是單鏈特異性核酸酶，以核酸內(nèi)切的方法降解單鏈DNA或RNA

26、，也能作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，對雙鏈DNA或RNADNA雜合雙鏈無作用。該酶在基因工程中主要用于：1. 給RNA分子定位2. 檢測核酸雜交程度、雙鏈DNA二級結(jié)構(gòu)差異3. 去除DNA粘性末端而產(chǎn)生平端4. 打開cDNA中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其成平端64表3基因工程常用的核酸酶核酸酶名稱主要功能型限制性內(nèi)切酶在特異的堿基序列部位切割DNA分子DNA連接酶將兩條DNA分子或片段連接成一個(gè)整體大腸桿菌DNA聚合酶通過向3端逐一增加核苷酸的方式填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈缺口逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈多核苷酸激酶把一個(gè)磷酸分子加到多核苷酸的5-OH末端末端轉(zhuǎn)移酶將同聚物尾部加至線性雙鏈DN

27、A分子或單鏈DNA分子的3 -OH末端核酸外切酶從一條DNA鏈的3端移去核苷酸殘基65表3基因工程常用的核酸酶（續(xù)）核酸外切酶催化自雙鏈DNA分子的5端移走單核苷酸，因此暴露出延伸的單鏈3端堿性磷酸酶催化從cDNA分子的5端或3端或同時(shí)從5端和3端移去末端磷酸S1核酸酶催化RNA和單鏈DNA分子降解為5單核苷酸，同時(shí)也可以切割雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)Bal核酸酶具有單鏈特異的核酸內(nèi)切酶酶活性，也具有雙鏈特異的核酸外切酶活性TaqDNA聚合酶能在高溫（75）下以單鏈DNA為模板按35方向合成新生互補(bǔ)鏈662.2基因工程的載體l 理想的基因工程載體一般至少有以下幾點(diǎn)要求： 能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，而且

28、最好要有較高的自主復(fù)制能力。容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高越好。容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。67容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來， 這才便于重組操作。有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞、或攜帶著外來的核酸序列進(jìn)入宿主細(xì)胞都能容易被辨認(rèn)和分離出來。l 目前常用的基因載體有：細(xì)菌質(zhì)粒載體、農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯氏質(zhì)粒載體和病毒載體等682.2.1質(zhì)粒載體l 質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。69l 其特點(diǎn)如下：是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形D

29、NA（covalently closed circuar DNA，cccDNA）；能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon）。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)?？呻S宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。70l 按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：1. 嚴(yán)緊控制（stringent control）型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；2. 另一類是松弛控制（relaxed control）型質(zhì)粒，其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。l 有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA中，隨宿主DNA復(fù)制，稱為附加體。71質(zhì)粒對宿主生存并不是必需

30、的。這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存。例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒。7273l 根據(jù)質(zhì)粒是否帶有促進(jìn)細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的基因?？蓪⑵浞譃椤敖雍闲汀?conjugative)與“非接合型”(non -conjugative)。接合型是指細(xì)胞質(zhì)粒通過纖毛從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程。l 按照質(zhì)粒的“不相容性”(incompatibility)又可以將質(zhì)粒分為若干個(gè)不相容群。

31、所謂質(zhì)粒的不親和性，有時(shí)又稱不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下。兩種不同質(zhì)粒不能共存于同一宿主細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象。74l 構(gòu)建一種質(zhì)粒載體，通常有以下幾方面的要求：質(zhì)粒載體的相對分子量應(yīng)盡可能的??；應(yīng)該有用來克隆外源DNA的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)；應(yīng)該有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記。75l 現(xiàn)在分子生物學(xué)使用的質(zhì)粒載體都已不是原來細(xì)菌或細(xì)胞中天然存在的質(zhì)粒，而是經(jīng)過了許多的人工的改造。從不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康某霭l(fā)，人們設(shè)計(jì)了各種不同的類型的質(zhì)粒載體，近年來發(fā)展很快，新的有特定用途的質(zhì)粒不斷被創(chuàng)建。下面給出最常用的大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pBR322的圖譜 76772.2.1.3酵母質(zhì)粒載體l 除常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體外

32、，近年來發(fā)展了許多人工構(gòu)建的其它能用于微生物、酵母、植物等的質(zhì)粒載體。l 選擇酵母載體的必須慎重考慮以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：大腸桿菌和酵母均有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)志；結(jié)合實(shí)際需要，考慮在酵母中的復(fù)制方式；在酵母和大腸桿菌中的拷貝數(shù)；要有簡單易行的篩選插入物的方式。78l 根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的復(fù)制機(jī)制，可將酵母質(zhì)粒載體分為整合型載體（YIP）、自我復(fù)制載體（YRP）和附加型載體（YEP）。以上三種類載體的共同特點(diǎn)是：1.能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)，這樣可以使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增2.含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記一般能和大腸桿菌相應(yīng)的突變體互補(bǔ)3.含有合適的酶切位點(diǎn)，以便

33、外源基因插入79整合型載體 （YIP）l 整合型酵母載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的，YIP載體不能在酵母細(xì)胞中自我復(fù)制，但可以轉(zhuǎn)化后導(dǎo)入受體細(xì)胞并通過與受體DNA的同源重組，整合到染色體上，并隨染色體一起復(fù)制，這樣的質(zhì)粒DNA以單拷貝基因形式穩(wěn)定的遺傳。l YIP載體轉(zhuǎn)化效率低（1-10轉(zhuǎn)化子gDNA），但轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。80自我復(fù)制載體 （YRP）l 自我復(fù)制型酵母載體因在酵母中有自我復(fù)制的能力而得名。l YRP載體是酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。l 由于它同時(shí)含有酵母和大腸桿菌的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制，這種載體又稱為穿梭載體（

34、shuttle vector），即可在兩種不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體81l YRP載體對酵母的轉(zhuǎn)化率極高（102-103轉(zhuǎn)化子/ gDNA ）,拷貝數(shù)也較高。YRP質(zhì)粒以cccDNA（共價(jià)閉合環(huán)狀DNA）分子形式存在，容易提取，但在供體細(xì)胞中不穩(wěn)定，易丟失。82附加型載體l 附加型載體（YEP）一般由大腸桿菌質(zhì)粒、酵母天然質(zhì)粒（2m質(zhì)粒）以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。YEP型載體對酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性，一般103-105轉(zhuǎn)化子/ gDNA ，比YRP更穩(wěn)定，拷貝數(shù)也更高。l 在使用酵母中的克隆載體時(shí)，穩(wěn)定性和拷貝數(shù)是一對矛盾，穩(wěn)定遺傳的YIP是低拷貝的，而高拷貝數(shù)的YRP、YEP又不穩(wěn)定，因

35、此在使用這類載體時(shí)，可根據(jù)不同的目的進(jìn)行選擇和改造。832.2.2噬菌體載體 2.2.2.1噬菌體和噬菌體載體的特點(diǎn) l 噬菌體是寄生在細(xì)菌中的病毒，故又稱細(xì)菌病毒。不同種類的噬菌體顆粒在結(jié)構(gòu)上差別很大，可分為3種類型：大多數(shù)噬菌體是具有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體，看起來像一種小型皮下注射器，如T4噬菌體另兩種是無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型和線狀體型（如M13噬菌體）84 T4噬菌體結(jié)構(gòu)8586l 噬菌體作為載體，可插入長10kb20kb甚至更大的一些外源DNA片段。又由于噬菌體有較高的增殖能力，有利于目的基因的擴(kuò)增，從而成為當(dāng)前基因工程研究的重要載體之一。野生型的噬菌體必須經(jīng)過改造，才能成為比較理想的基因

36、工程載體。 872.2.2.2噬菌體的生命周期和特點(diǎn)l 噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶原周期兩種不同的類型8889l 溫和噬菌體是既能進(jìn)入溶菌生命周期，又能進(jìn)入溶源生命周期的噬菌體。l 溶源性細(xì)菌是具有一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌l 用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過程，叫做溶源化。在溶源性細(xì)菌中存在的整合或非整合的噬菌體DNA叫原噬菌體l 整合是指噬菌體DNA易插入到寄主細(xì)菌染色體之中，以游離DNA分子形式存在的噬菌體DNA叫非整合噬菌體DNA90l 被感染形成的溶源性細(xì)菌，由于細(xì)胞內(nèi)具有原噬菌體，故不能被第一次感染的同種噬菌體再感染，也就是說溶源性細(xì)菌具有了抵御同種噬菌體再

37、感染的能力，這一現(xiàn)象叫做超感染免疫性。l 經(jīng)過許多世代之后，溶源性細(xì)菌也能夠開始溶源周期，這時(shí)噬菌體的基因組以單一DNA片段的形式從寄主染色體DNA上刪除下來，這一過程叫做溶原性細(xì)菌的誘發(fā)。912.2.2.2噬菌體 l 噬菌體是一種溫和噬菌體。噬菌體由頭部和尾部兩個(gè)部分組成，頭部為正二十面體結(jié)構(gòu)，內(nèi)裝噬菌體核酸。9293l 在寄主范圍方面，噬菌體比質(zhì)粒載體要狹窄得多，因此作為基因克隆載體自然也就更加安全。l 在噬菌體的兩端，各有十二個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端，當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入宿主菌體后，會(huì)迅速通過粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈環(huán)形DNA。l 這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段，稱為cos位點(diǎn)（coh

38、esiveend site）94952. 噬菌體載體的構(gòu)建l 野生型的噬菌體本身不適宜于作為克隆載體來用，主要原因是 DNA對大多數(shù)常用的限制酶有較多的切割位點(diǎn)。l 噬菌體之所以能夠改造成為克隆載體是因?yàn)?DNA中的J基因到N基因區(qū)段為非必要區(qū)。l 改建的基本步驟是先將所有的噬菌體存在過多的限制酶位點(diǎn)移去，然后應(yīng)用遺傳重組技術(shù)插入一個(gè)期望的DNA片段。96l 目前構(gòu)建出了多種噬菌體載體，這些可歸納成兩種不同的載體類型，即插入型載體(insertion vector)和置換型載體(replacement vector)。(1)插入型載體 只具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)可便于外源DNA插入的噬菌體稱為插入型

39、載體。外源DNA片段克隆到插入型載體上后會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插人失活效應(yīng)，這也為克隆基因的選擇提供了表型。常用的有免疫功能失活和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活兩種。97 (2)置換型載體 置換型載體的基因組中具有成對的限制酶位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代。983 DNA的體外包裝 正常的噬菌體能夠在其本身所編碼的基因中，利用寄主細(xì)胞內(nèi)原材料表達(dá)成各種有活性的蛋白或酶，經(jīng)一系列反應(yīng)變化，最后組裝成完整的噬茵體顆粒?；具^程如圖632所示。99100l 所謂噬菌體DNA的體外包裝，是指在試管中完成噬菌體在寄主細(xì)胞內(nèi)的全部組裝過程。l 其基本原理是

40、噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進(jìn)行的。頭部的基因發(fā)生突變，噬菌體只能形成尾部；而尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成頭部。將這兩種不同突變型的噬菌體提取物混合起來，就能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體穎粒。101102l 噬菌體DNA的包裝有一定的限制，這是因?yàn)槭删w頭部外完蛋白對DNA的容納量是有一定限度的。l 包裝限制說明， 噬菌體作載體對外源DNA片段的大小有比較嚴(yán)格的要求，這是在應(yīng)用載體時(shí)必須注意的。1032.2.2.3 M13載體l M13是一種絲狀大腸桿菌噬菌體，經(jīng)改造后作為單鏈的DNA載體，表現(xiàn)出許多其他載體所不具備的優(yōu)越性。l M13感染細(xì)菌后呈雙鏈復(fù)制型（RF）DNA。M13作

41、重組DNA的載體有兩個(gè)特性，一是允許包裝大于病毒單位長度的外源DNA，二是感染細(xì)菌后，復(fù)制環(huán)狀DNA經(jīng)包裝形成噬菌體顆粒，分泌到細(xì)胞外而不產(chǎn)生溶菌。 104l 這一特性不僅便于分離單鏈的DNA，而且在產(chǎn)生大量的單鏈DNA中，含有外源DNA序列，因此應(yīng)用價(jià)值極大：用于DNA序列分析；用于制備雜交探針；用于定點(diǎn)突變。 1052.2.3粘性質(zhì)粒載體 l 粘性質(zhì)粒載體（也稱柯斯質(zhì)粒載體或粘粒，cosmid vector）是一類由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。l 柯斯質(zhì)粒比噬菌體具有更大的克隆能力，在真核基因的克窿中起到巨大的作用。1061柯斯質(zhì)粒載體的組成l 柯斯質(zhì)

42、粒的大小為46kb，這類質(zhì)粒的基因組都由三部分組成：一個(gè)抗藥性標(biāo)記和一個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制起始部位一個(gè)或多個(gè)限制酶酌單一切割位點(diǎn)一個(gè)帶有噬菌體的粘性末端片段1071082柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)l 柯斯質(zhì)粒的特點(diǎn)大體上可以歸納為以下4個(gè)方面：1.具有噬菌體的特點(diǎn)2.具有質(zhì)粒載體的特性3.具有高容量的克隆能力4.具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力1093柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用上述的噬菌體載體在噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出數(shù)百個(gè)由cos位點(diǎn)連接的DNA組成的多連體。同時(shí)， 噬菌體還具有一種位點(diǎn)特異的切割體系，或叫做末端酶(terminase)或Ter體系，它能識(shí)別兩個(gè)距離適宜的cos位點(diǎn)，把多連體分子切割成單位

43、長度的片段，并把它們包裝到噬菌體頭部中去。1101112.3基因工程的基本技術(shù)1.核酸分子的提取l 核酸分子是基因工程的主要研究對象，核酸樣品的質(zhì)量直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗l 核酸包括DNA和RNA，在細(xì)胞中它們都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在l 真核生物染色體DNA為雙鏈線性分子l 原核生物、質(zhì)粒和真核細(xì)胞器的DNA為雙鏈環(huán)狀分子，RNA一般為單鏈線性分子112l 核酸的存在位置：原核細(xì)胞DNA均在核內(nèi)真核生物95的DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，5在細(xì)胞器內(nèi)（線粒體、葉綠體等）RNA分子約有75存在于細(xì)胞質(zhì)中，10在細(xì)胞核內(nèi)，15在細(xì)胞器內(nèi)113l 總DNA的提取一般的說，總DNA主要是指基因組DNA，即細(xì)

44、胞核內(nèi)的染色體DNA分子。核DNA分子呈極不對稱的線狀結(jié)構(gòu)。真核生物細(xì)胞的破碎方法有很多種，一些如超聲波法、勻漿法等物理方法易導(dǎo)致DNA鏈的斷裂，所以一般采用去污劑溫和處理方法。對于細(xì)胞破碎較困難的細(xì)胞可以添加蛋白酶K，在酶的作用下共同破碎細(xì)胞。114l 植物總DNA的提取方法從提取原理上主要有以下兩種：1.十六烷基三乙基溴化銨法（CTAB）：CTAB是一種去污劑，可以溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中可溶解，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度時(shí)可沉淀。CTAB法的優(yōu)點(diǎn)是能很好的去除糖類雜質(zhì)，在提取前期能同時(shí)得到高質(zhì)量的DNA和RNA1152.SDS（十二烷基硫酸鈉）法：其原理是利用高濃度

45、的SDS在較高溫度（55-65）下裂解細(xì)胞，使染色體離析、蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后提高鹽濃度及降低溫度使蛋白和多糖沉淀，離心除去沉淀后將上清液中的DNA進(jìn)行反復(fù)抽提除去蛋白質(zhì)，用乙醇沉淀水相中的DNA。該法操作簡單、條件溫和，也可提取到高分子量的DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多116RNA的提取l RNA主要包括：rRNA（核糖體RNA，占總量的80-85）tRNA（轉(zhuǎn)移RNA）和核內(nèi)小分子RNA 占總量的10-15mRNA（信使RNA，占總量的1-5）117l RNA分離的關(guān)鍵因素在于盡量減少RNA酶的污染。造成RNA酶污染的主要來源有：所用的器皿所用的溶液實(shí)驗(yàn)人員的手l 常用的RNA提

46、取方法有：1.異硫氰酸胍-氯化銫超速離心法：使用蛋白質(zhì)強(qiáng)變形劑異硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，用CsCl介質(zhì)進(jìn)行密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA和蛋白質(zhì)處于上清液1182.鹽酸胍-有機(jī)溶劑法：本法適用于沒有超速離心設(shè)施的情況下提取細(xì)胞RNA，它利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，有機(jī)溶劑抽提除去蛋白質(zhì)，通過選擇性沉淀RNA分子而除去DNA。提取的RNA質(zhì)量較好，但操作費(fèi)時(shí)繁瑣3.氯化鋰-尿素法：利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNA酶，氯化鋰選擇性沉淀RNA。缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會(huì)對是一些小分子量的RNA，優(yōu)點(diǎn)是快速簡便，適用于大量樣品少量組織細(xì)胞的RN

47、A提取1194.一步熱酚快速抽提法：基本1987年Shomczynki和Sacchi兩人提出的RNA快速提取法，目前已有商品試劑盒，使操作更為簡便，其優(yōu)點(diǎn)在于：將已知最強(qiáng)的RNase抑制劑異硫氰酸胍、-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用RNA選擇性的進(jìn)入物DNA和蛋白質(zhì)的水相，容易被異丙醇沉淀濃縮，對大量或少量的組織細(xì)胞RNA提取均合適120可在3小時(shí)以內(nèi)處理大批樣品，省略了氯化銫密度梯度超速離心及其他方法使用的長時(shí)間選擇性乙醇沉淀或氯化鋰沉淀。121l 質(zhì)粒DNA的提取應(yīng)用質(zhì)粒作為基因克隆的載體分子，一個(gè)重要的條件是獲得批量的純化的質(zhì)粒DNA分子質(zhì)粒的提取方法很多，有以下三個(gè)主要步

48、驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集、質(zhì)粒DNA的分離和純化1.從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后通過離心回收菌體，即可從中純化質(zhì)粒。對于拷貝數(shù)較低的質(zhì)粒，可使用氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)菌胞內(nèi)的質(zhì)粒數(shù)大幅增加1222.細(xì)菌細(xì)胞裂解的方法很多，但共同的步驟如下：細(xì)胞溶菌酶和EDTASDS堿處理復(fù)性離心上清液有機(jī)溶劑沉淀1233.1.1.1結(jié)構(gòu)基因組成l 作為一個(gè)能轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)構(gòu)基因必須包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。l 啟動(dòng)子是DNA上RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和促使轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列，轉(zhuǎn)錄mRNA的第一個(gè)堿基被定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這個(gè)堿基多數(shù)情況下是A，以此作

49、為序列的+1，其上游的核苷酸為-，下游的核苷酸為+。124l 基因編碼區(qū)包括起譯碼ATG、開讀框和休止碼TAA（或TAG、TGA）。l 終止子是一個(gè)提供轉(zhuǎn)錄停止信息的核苷酸序列，不同類型基因組的基因組成稍有不同。因此必須根據(jù)基因組類型和實(shí)驗(yàn)需要來分離含目的基因的DNA片段。1253.1.1.2原核生物結(jié)構(gòu)基因的組成l 原核生物的基因多數(shù)以操縱子形式存在，完成同類功能的多個(gè)基因聚集在一起，處于同一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，下游同具一個(gè)終止子l 兩個(gè)基因之間存在著長度不等的間隔序列，但有例外。126l 原核生物的啟動(dòng)子含-35序列保守區(qū)5TTGACA3，提供RNA聚合酶識(shí)別的信號；-10序列保守區(qū)5TA

50、TAAT3，DNA雙鏈從此處解開轉(zhuǎn)錄。l 操縱子除啟動(dòng)子外，往往還有一些調(diào)控轉(zhuǎn)錄的其它因子，如乳糖操縱子除啟動(dòng)子（p）外，還有調(diào)節(jié)因子（i）和操縱因子（o）127l 原核基因在起譯碼ATG上游約10bp處，有一個(gè)富含嘌呤核苷酸的SD保守序列區(qū)，一般為GGAGGA（以G為主），由此區(qū)轉(zhuǎn)錄的序列是翻譯時(shí)核糖體識(shí)別、結(jié)合mRNA的位置。核糖體由此位置向前移動(dòng)，尋找起譯碼AUG。l 原核生基因轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文序列結(jié)構(gòu)，稱為終止子，使RNA聚和酶減緩移動(dòng)或停止RNA的合成，但不是所有的回文序列結(jié)構(gòu)都是終止子。1283.1.1.3真核生物結(jié)構(gòu)基因的組成l 真核生物染色體基因組的基因是單獨(dú)存在的，并且

51、兩個(gè)基因之間有很長的間隔序列區(qū)，甚至起譯碼和休止碼之間除編碼序列區(qū)外還有一至多個(gè)非編碼序列間隔區(qū)，稱為內(nèi)含子，而編碼序列區(qū)稱為外顯子。129l 真核生物結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子通常包含3個(gè)保守序列區(qū)：在-20到-30序列區(qū)有一個(gè)TATA框，DNA雙鏈在此處開始解開；在-75序列區(qū)有一個(gè)CAAT框，其作用是與RNA聚合酶結(jié)合有關(guān)；在更上游處有一個(gè)GC框，是某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列。130l 對真核生物基因轉(zhuǎn)錄終止信號和終止過程目前了解不多，不過發(fā)現(xiàn)高等真核生物結(jié)構(gòu)基因休止碼序列下游有一保守的AATAAA序列提供轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的釋放信號。l 此外，真核生物染色體基因組的結(jié)構(gòu)基因不具SD序列區(qū)，核糖體與轉(zhuǎn)錄

52、的mRNA結(jié)合靠mRNA5端添加的“帽”結(jié)構(gòu)。131目的基因的分離l 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，待分離的目的基因可能是包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)、基因編碼區(qū)和終止區(qū)的全功能基因，甚至是一個(gè)完整的操縱子或由幾個(gè)功能基因、幾個(gè)操縱子聚集在一起的基因簇；l 也可能是只具有基因的編碼區(qū)，甚至是只含啟動(dòng)子或終止子等元件的DNA片段；而且不同基因組類型的基因大小和基因組組成也各不相同。l 因此分離目的基因應(yīng)采用不同的途徑和方法132l 目前采用的分離、合成目的基因的方法有很多種，下面介紹一部分：1. 鳥槍法 首先利用物理方法或酶化學(xué)方法（限制性內(nèi)切酶法）將生物細(xì)胞染色體切割成很多基因水平的片段，繼而將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，將

53、重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結(jié)合篩選方法，從眾多轉(zhuǎn)化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。 由于目的基因在整個(gè)基因組中太少太小，所以這個(gè)方法稱為“鳥槍法”或“散彈槍”試驗(yàn)法。1333.1.1.2物理化學(xué)法l 利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對，A和T配對的這一特性，從生物基因組分離目的基因的方法。常用的方法有：1. 密度梯度離心法2. 單鏈酶法3. 分子雜交法134分子雜交法135化學(xué)合成法l 根據(jù)氨基酸順序以及密碼關(guān)系可以推測出目標(biāo)基因的一種可能的堿基排列方式，由此可用化學(xué)法進(jìn)行合成（全合成或半合成）。1363.1.1.4通過構(gòu)建cD

54、NA文庫和基因組文庫分離目的基因l 通過轉(zhuǎn)錄和加工，每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的一個(gè)mRNA分子，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生相應(yīng)的cDNA（互補(bǔ)DNA）。這樣產(chǎn)生的cDNA只含基因編碼序列，不具有啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子。l 某生物基因組經(jīng)轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與合適的克隆載體連接，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)化）貯存在一種受體菌的群體之中。把這種包含某生物基因組全部基因cDNA的受體菌群體稱為該生物cDNA文庫。137l 從概率原則來看，只有當(dāng)此文庫中重組子總數(shù)達(dá)到某一數(shù)目時(shí)，才能包含基因組中所有基因，才可稱之為完整基因組文庫。構(gòu)成完整基因組文庫所需要重組子的數(shù)目，主要取決于基因組的大小和目的基因片段的大小兩個(gè)參

55、數(shù)。138l 對于某一特定的基因組構(gòu)成其DNA文庫所需的重組子的數(shù)目，在很大程度上與構(gòu)建文庫所用的載體的容量緊密相關(guān)。l 構(gòu)建高等植物基因組DNA文庫時(shí)，通常采用噬菌體載體和粘性質(zhì)粒載體，因?yàn)樗鼈兙哂懈蟮目寺∪萘俊?39l 基因組文庫的構(gòu)建一般包括下列基本步驟細(xì)胞染色體大分子DNA的提取和大片段的制備；載體DNA的制備；載體與外源大片段連接；體外包裝及基因組DNA文庫的擴(kuò)增；重組DNA的篩選和鑒定140141cDNA的合成和克隆l 利用純化的總DNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補(bǔ)的DNA即cDNA，再按上述構(gòu)建基因文庫的類似方法對cDNA進(jìn)行克隆，由此獲得的克隆總稱為cDNA文庫。142l 構(gòu)建c

56、DNA文庫通常包括：mRNA的提取及其完整性的確定；cDNA的合成和克隆；目的cDNA的鑒定等步驟。143cDNA的合成和克隆144（3）cDNA與載體的重組 合成的cDNA與載體DNA進(jìn)行連接一般有3種方法。借助于末端轉(zhuǎn)移酶的3OH端合成均聚物的能力，雙鏈cDNA和線性化載體DNA的30H端分別加上均聚核苷酸鏈。雙鏈cDNA和線性化載體DNA分別用Klenow片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行齊頭連接，形成重組分子。通過粘性末端連接。145（4）轉(zhuǎn)化 受體菌株經(jīng)氯化鈣處理后成為感受態(tài)，可以較高的效率接受外來DNA進(jìn)入。重組體載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株

57、。當(dāng)不同重組的DNA含有不同的cDNA基因時(shí)，整個(gè)轉(zhuǎn)化子含有來自mRNA群體的各種cDNA基因，這樣的轉(zhuǎn)化子群體構(gòu)成該mRNA群體全部遺傳信息的cDNA基因文庫。146(5)特定cDNA的克隆 特定cDNA克隆的獲得可以有以下幾種方法。從某組織總mRNA為模板得到的cDNA基因文庫中分離特定的cDNA克隆從該蛋白質(zhì)已知序列推知C末端56個(gè)氨基酸的相應(yīng)DNA序列，合成一組寡聚脫氧核苷酸片段作為引物。在總mRNA中這組引物只與該蛋白質(zhì)的mRNA可以氫鍵配對，以此引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，得到特異性cDNA用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)可以得到特定cDNA雜交選擇法篩選特定mRNA。147(6)目的cDNA克隆的鑒

58、定用于從cDNA文庫中篩選和鑒定目的cDNA的方法主要有3種：核酸雜交；免疫學(xué)雜交檢測；cDNA的同胞選擇。148PCR技術(shù)l PCR技術(shù)的發(fā)明 PCR技術(shù)是在核酸研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。l PCR的反應(yīng)體系所要具備的條件：1.要由于被分離的目的基因的DNA雙鏈兩端的序列相互補(bǔ)的DNA引物（約20個(gè)堿基）2.具有熱穩(wěn)定性的酶（如Taq DNA 聚合酶）3.dNTP4.作為模板的目的DNA序列 一般PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出1005000bp的目的基因片段。變性53533535引物復(fù)性35355335P1P2延伸35355335P1P2再變性再復(fù)性P1P1P2P2再延伸參與參與PCR反應(yīng)的主要試劑：反應(yīng)

59、的主要試劑：1. 上下游引物上下游引物(10-50pmol)2. 緩沖液緩沖液(pH 8.3)3. Mg+(0.5-2.5mM)4. dNTPs (0.2mM)5. Taq DNA聚合酶聚合酶(2.5U)6. DNA模板模板(1ng)P1P1P2P2短片段以指數(shù)形式擴(kuò)增短片段以指數(shù)形式擴(kuò)增長片段以線性形式擴(kuò)增長片段以線性形式擴(kuò)增最終主產(chǎn)物片段長度在最終主產(chǎn)物片段長度在P1-P2之間之間PCR循環(huán)的主要參數(shù)：循環(huán)的主要參數(shù)：1. 預(yù)變性：預(yù)變性：92C-95 C， 2-5min2. 變性：變性： 92C-95 C，30s-1min3. 復(fù)性：復(fù)性： 40 C-60 C，20s-2min4. 延伸

60、：延伸： 70 C-75 C，30s-3min5. 總延伸：總延伸：72 C， 7minPCR技術(shù)的特點(diǎn)（1）特異性強(qiáng)（2）敏感性高；（3）快速；（4）簡便；（5）可擴(kuò)增cDNA或RNA（6）對起始材料質(zhì)量要求低；（7）具有一定程度單核苷酸錯(cuò)誤摻入引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)：1.長度在長度在15-30bp，GC含量在含量在45-55%之間。之間。Tm=4(G+C)+2(A+T)。2. 堿基分布表現(xiàn)出隨即性，避免相同堿基堿基分布表現(xiàn)出隨即性，避免相同堿基連續(xù)排列。連續(xù)排列。3. 3不能與引物內(nèi)部互補(bǔ)，以免形成二級不能與引物內(nèi)部互補(bǔ)，以免形成二級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。4. 兩個(gè)引物各自的兩個(gè)引物各自的3不能互補(bǔ)，以