生物農藥實驗教案2011

1、生物農藥實驗指導書金晨鐘主編譚顯勝湖南人文科技學院生命科學系農學教研室2011年9月前言 生物農藥（biopesticides），按照Copping和Menn的定義包含活體微生物（病毒、細菌、真菌），昆蟲致病線蟲，植物源農藥，微生物農藥，微生物次生代謝物質（抗生素），昆蟲信息素，用于表達抗蟲、抗病、抗病毒、耐除草劑的基因以及昆蟲天敵。生物農藥的獨特優(yōu)點是對人類健康威脅小，對環(huán)境安全。這正是全社會最關心的問題之一。進入21世紀以來，各國政府和民眾更加重視生物農藥的開發(fā)和應用，生物農藥在整個農藥市場的份額正在逐年上升。我國的天然藥物資源十分豐富，為了發(fā)現新的活性成分，尋找新的藥物，就必須首先從復雜

2、的藥物成分中提取出有活性的單體成分，以期為新農藥合成提供先導化合物。因此，正確掌握提取分離的實驗操作以及熟悉快速、有效的新的提取分離技術在分離目的化合物中就顯得尤為重要。本實驗指導書書共分三部分。第一部分是有效成分的提取。內容主要包括溶劑提取法（回流提取、索氏提?。┖退魵庹麴s法，重點介紹了溶劑提取法的原理和如何選擇溶劑，要求掌握回流提取、索氏提取裝置和水流氣蒸餾裝置的正確應用。第二部分主要介紹有效成分的初步分離及其化學成分預測試。內容主要包括薄層層析分離法和有效成分化學預試驗方法，要求掌握薄層層析板的制備和正確應用各種分離方法。第三部分是有效成分的生物測定。內容包括生物殺蟲劑的生物測定方法（

3、為了突出與化學農藥的區(qū)別，這里主要介紹驅避、拒食等作用方式的測定方法）、生物農藥殺菌劑生物測定方法（孢子萌發(fā)法和生長速率測定法）、生物農藥抗植物病毒劑（以抗煙草花葉病毒TMV為例）和生物農藥除草劑生物測定方法。生物農藥是一門專業(yè)性很強的學科交叉課程，學好生物農藥，需要同時具備農學、生物學和化學等方面的知識。根據此門課程的特點，結合本科生教學特點的需要，我們編寫了此實驗指導書。編者2011年9月實驗須知一、牢固樹立“安全第一”的思想1、實驗前應充分預習實驗內容，了解實驗所用藥品的性能及危害和注意事項。2、實驗進行時應該注意儀器是否完好無損，裝置力求正確穩(wěn)妥，嚴格遵守操作規(guī)程及實驗條件，未經指導老

4、師允許不得擅自改變。3、保持臺面整齊清潔，不得將與實驗無關的儀器、書籍、雜物等堆放在實驗臺上。4、禁止在實驗室吸煙、飲水或吃東西。不得在實驗過程中看其它書籍、聽廣播、玩手機、大聲說笑、會客等與實驗無關的活動。5、易燃、易揮發(fā)物品不得放在敞口容器中加熱。6、實驗進行當中不得擅自離開操作臺，如必須暫時離開，應托付他人照看。7、廢酸、廢渣、廢紙等均應倒入廢液缸中，不得倒入水槽。8、要熟悉安全用具如滅火器、砂桶等的放置地點及使用方法。9、最后離開實驗室者應負責檢查實驗室的水、電、門、窗、通風設備是否關好。二、事故的預防和急救1、爆炸和火災（1）易燃氣體或易燃溶劑的蒸汽在空氣中混合到一定比例時，遇到明火

5、、電火花、靜電摩擦都會引起爆炸。因此，實驗中要有良好的通風；傾倒和量取易燃液體均應在通風櫥內進行，遠離火源；不得用敞口容器加熱、盛裝、或蒸除有機溶劑；冷凝水要保持暢通；或進行攪拌或加入沸。（2）儀器內壓力過高造成爆炸。常壓操作時，應使全套裝置通大氣，切勿造成密閉體系；減壓蒸餾時，要用圓底燒瓶作接受器，不可用錐形瓶。如一旦發(fā)生火災，切不可驚慌失措，應保持冷靜，采取措施滅火立即報告指導教師，切斷電源，選擇適當的滅火器材。2、中毒許多化學溶劑都有不同程度的毒性，濺入口中立即用大量水沖洗。腐蝕性毒物：對于強酸，先用大量水沖洗，然后服用氫氧化鈉鋁膏、雞蛋白；對于強堿也應先用大量的水，然后服用醋、酸果汁、

6、雞蛋白。刺激性及神經性毒物：先給牛奶或雞蛋白沖淡，再給如硫酸鎂催吐，立即送醫(yī)院。3、外傷與急救割傷：發(fā)生原因通常都是因玻璃折斷所傷。一旦割傷，用蒸餾水洗凈傷口，貼上創(chuàng)可貼或涂上紅藥水。燙傷或被火燒傷：輕傷可用苦味酸飽和溶液洗滌后涂以硼酸、凡士林或燙傷膏。化學試劑灼傷：皮膚被酸或堿灼傷，先用大量水沖洗，然后分別用3%碳酸氫鈉或硼酸溶液洗滌。4、安全用電使用電器時，應防止人體和電器導電部位接觸，不能用濕手接觸電源插頭；如發(fā)現儀器有漏電，打火花等現象時，立即斷開電源進行檢修。實驗結束后，應及時斷開電源。目 錄實驗一 生物農藥中有效成分提取之溶劑提取法索氏提取.2實驗二 生物農藥中有效成分提取之溶劑提

7、取法回流提取.4實驗三 生物農藥中有效成分的提取方法水蒸氣蒸餾法.6實驗四 生物農藥有效成分的分離萃取法（LLE）.9實驗五 生物農藥有效成分的分離薄層層析法（TLC）.11實驗六 植物提取物化學成分預試驗.13實驗七 用薄層層析法測定蔬菜中生物農藥的殘留量.16實驗八 生物殺蟲劑對小菜蛾的毒力測定.20實驗九 生物殺蟲劑對韭菜遲眼蕈蚊幼蟲的毒力測定.22實驗十 生物殺蟲劑對害蟲的取食忌避和非選擇性拒食作用測定.23實驗十一 生物殺菌劑的生物測定孢子萌發(fā)法.24實驗十二 生物殺菌劑生物測定生長速率法.26實驗十三 生物農藥抗煙草花葉病毒（TMV）活性測定. .29實驗十四 生物除草劑對黃瓜種苗

8、的活性測定.32附錄1 有效成分鑒別常用顯色劑及其配制.33附錄2 生物農藥課程相關的主要參考書目.45附錄3 學習農藥專業(yè)知識的相關期刊、數據庫和網站.47實驗一 植物源農藥細辛提取物的提取及藥效觀察隨著人們環(huán)保意識逐漸提高，對無公害蔬菜的需求越來越大。植物中含有很多天然的化學成分，我國利用植物材料治療人類疾病已經有幾千年的歷史了。依據中醫(yī)藥研究的成果，在低毒或無毒的植物材料中篩選對植物病原真菌具有抑制或殺滅作用的材料為尋找新的化學結構提供了一條新的線索。1、目的要求掌握植物源農藥細辛提取物的提取原理、加工工藝以及測試方法。2、方法原理乙醇作為對細辛的適宜提取溶劑，利用恒溫振蕩提取法提取。主

9、要實驗儀器及材料細辛 200g手提式中藥粉碎機 1臺恒溫振蕩儀 1臺80%的乙醇 500mL50%的乙醇 500mL離心機 1臺烘箱 1臺試管 5根燒杯 4個玻璃棒 2根紗布 1卷電子天平 1臺冰箱 1臺培養(yǎng)箱 1臺4、掌握要點細辛的前期處理工作及提取工藝、測試程序。5、實驗內容5.1細辛提取物的制備取經粉碎的植物材料20g，加80乙醇100 mL，30，l50 rmin恒溫振蕩提取2d。三層紗布過濾，濾液經4500 rmin離心20 min。取上清液45下減壓濃縮。 殘余物用50乙醇重新溶解并定容到20 mL，4下保存。5.2殺菌活性驗證將細辛提取物配置成5個濃度備用（0.25g/L, 0.

10、50g/L, 1.00g/L, 2.00g/L, 4.00g/L）制備濃度為100個左右/L鐮刀菌孢子懸浮液備用將5個濃度的細辛藥液各取1ml分別與鐮刀菌孢子懸浮液混勻吸取一滴置于凹玻片中，放在保濕器培養(yǎng)（25-28）8h后觀察孢子萌發(fā)情況6、注意事項、結果計算與分析實驗二 植物源農藥黃連中生物堿的提取及藥效觀察黃連是著名的中藥，其根、莖味極苦，苦味在于其所含的多種生物堿。黃連中生物堿具有瀉火、 燥濕、解毒、殺蟲等作用，多用于治療細菌性痢疾、肺結核等疾病，對猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道、婦科及外科感染也有一定療效。1、目的要求掌握植物源農藥黃連中生物堿的提取工藝。2、方法原理微波輔助提?。豪?/p>

11、微波的反射、穿透、吸收、熱效應和滲透速度快等特點，將藥物組織和細胞中的生理活性物質提取出來，微波輔助提取可以顯著提高目標成分的提取量，減少對提取溶劑的限制，達到強化與優(yōu)化傳熱傳質的目的。3、主要實驗儀器及材料黃連 200g手提式中藥粉碎機 1臺微波爐 1臺稀硫酸（0.092 molL） 500mL40目的篩子 1個電子天平 1臺紗布 1卷試管 5根燒杯 4個玻璃棒 2根冰箱 1臺培養(yǎng)箱 1臺4、掌握要點黃連的微波處理提取工藝及提取物活性測試方法。5、實驗內容5.1稱取黃連20g，采用中藥粉碎機粉碎，過4O目篩，稱取黃連粉1.0g，加人90mL 0015molL的硫酸溶液浸濕，在微波中采用中低火

12、條件下，間歇加熱5min后，三層紗布過濾，烘干，備用。5.2殺蟲活性測試將生物堿提取物配置成3個濃度（稀釋100倍，500倍，1000倍）并設置空白對照備用選取齡期一致的蚜蟲30頭放置于寄主植物葉片上，置于塑料培養(yǎng)皿內，準備4次重復將葉片分別置于生物堿藥液及空白對照液中充分浸潤5s后，將葉片置于棉花上自然晾干24h后觀察蟲體存活情況。6、注意事項、結果計算與分析試驗三 蔬菜葉片中農藥殘留量的測定目前有機磷、氨基甲酸酯類農藥是我國大量使用的殺蟲劑，雖然這類農藥與過去使用的有機氯農藥相比，降解速度較快，但在果蔬中的殘留仍然較為嚴重。由于該類農藥能抑制人體內乙酰膽堿酯酶的生理活性，神經傳導因此受阻，

13、引起神經麻痹乃至死亡，對人類健康造成極大危害。對于果蔬中的農藥通常采用氣相色譜等方法進行分析，但分析時間長，操作步驟煩瑣，適用于實驗室分析。長期以來在大部分果蔬市場中，通常采用乙酰膽堿酯酶抑制法進行快速檢測，即以乙酰膽堿酯酶作為檢測試劑，采用農藥殘留檢測儀，根據乙酰膽堿酯酶活性變化的程度來測定果蔬樣品中的殘留農藥。1、實驗目的1.1了解果蔬中殘留農藥的分析方法；1.2掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法；1.3理解農藥殘留性評價的意義。2、實驗原理有機磷和氨基甲酸酯類農藥能抑制昆蟲中樞和周圍神經系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的活性，造成神經傳導介質乙酰膽堿的積累，影響正常傳導，使昆蟲中毒致死，酶抑制法就是根

14、據這一昆蟲毒理學原理，對農藥殘留進行檢測。以乙酰膽堿為底物，在乙酰膽堿酯酶（ACHE）的作用下，乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿和二硫雙對硝基苯甲酸（DNTB）產生顯色反應，使反應液呈黃色（于410nm處有最大吸收峰）。根據酶促反應動力學原理，在沒有有機磷和氨基甲酸酯類農藥存在時，底物在酶的催化作用下發(fā)生水解，反應速率可以用吸光度值隨時間的變化率K0來表示。當有機磷和氨基甲酸酯類農藥加入到酶的顯色體系中時，農藥抑制了酶的活性，影響顯色體系的反應速度，此時體系吸光度隨時間的變化率為Kt，則有機磷和氨基甲酸酯類農藥對酶的活性的抑制率Y的計算公式如下：。采用乙酰膽堿酯酶測定殘留農藥時，當酶完全水解底物

15、乙酰膽堿時，溶液顯黃色，其抑制率為0，當酶活性被農藥抑制而部分水解乙酰膽堿，測定溶液顯淡黃色，出現相應的抑制率，當酶完全被農藥抑制，測定溶液顯無色，抑制率為100%，這樣就可以建立起農藥殘留量與酶活性抑制率之間的關系。因而可以通過測定抑制率的大小來顯示農藥殘留的毒性程度。樣品的毒性等級分為：安全、低毒和高毒。3、儀器和試劑3.1儀器CL-BIII四通道殘留農藥測定儀 1臺天平（0.01g） 1臺一次性手套 1雙金屬鑷子 1支1000ml玻璃瓶 1個移液槍（50-250L） 1套剪刀 1把3.2試劑提取液：把提取液甲乙粉末倒入大玻璃瓶中，并加510ml蒸餾水溶解。酶試劑(乙酰膽堿酯酶)：用移液槍

16、取3.1ml提取液，加入酶試劑瓶中。顯色劑(二硫代硝基苯甲酸)：用移液槍取20ml提取液，加入顯色劑瓶，溶解后倒入棕色瓶中。底物(乙酰膽堿)：用移液槍取3.1ml蒸餾水，加入底物瓶中。4、實驗步驟4.1 儀器連接將CL-BIII四通道殘留農藥測定儀連接電源，把RS232/RS485的轉換器接入電腦主機背后的COM口（串口）上，然后把數據信號線與轉換器連接上，這樣就完成了儀器與電腦的硬件連接。4.2檢測操作把“農產品質量安全檢測軟件”光盤放入電腦光驅中，等自動讀取或在光盤目錄下找到并雙擊“setup”后，按提示點擊“下一步”安裝。安裝完成以后，桌面上會出現“食品質量安全檢測平臺”的圖標。首先按儀

17、器“設置”鍵，選擇為“受控”。然后再打開檢測軟件，檢測軟件的用戶名默認為“管理員”，密碼是“111111”。這樣檢測軟件對檢測儀器進行控制了。4.3 操作步驟整個的實驗操作過程可以分為三個大部分：調0、調100，空白對照，樣品分析。4.3.1 調0/100（注：以下是一個檢測窗口的步驟，其他三個窗口都是如此。）等待10-15秒按“確定”放入黑塊等待10-15秒按“確定”拿出黑塊按“ ”鍵按“ ”鍵按“ ”鍵按“ ”鍵4.3.2 空白對照用大移液槍抽取2.5ml提取液放入試管中，用小移液槍取0.1ml酶試劑加入試管中，用小移液槍取0.1ml顯色劑加入試管中，用小移液槍取0.1ml底物加入試管中，迅速搖勻并倒入比色皿，放入比色池，按“開始對照分析”鍵，等待對照結束。4.3.3 裝入對照按“裝入對照分析”鍵，選擇所需對照，選擇需要裝入對照的通道號（在通道號碼前打），“讀取”鍵完成裝入工作。4.3.4 裝入標準對照庫按“裝入對照分析”鍵，選擇所需的空白對照和相應的樣品修正值，選擇需要裝入對照的通道號（在通道號碼前），按“讀取”鍵完成裝入工作。4.3.5 樣品檢測用天平稱取1克果蔬，剪成2cm見方，放入燒杯中，用大移液槍抽取5ml提取液加入到燒杯中，靜置15分鐘（或震蕩1分鐘），用大移液槍從燒杯中抽取2.