實(shí)驗(yàn)一血清蛋白質(zhì)測定(范玉平)

1、1生化實(shí)驗(yàn)室規(guī)則穿好工作服穿好工作服不得遲到早退保持安靜預(yù)習(xí)聽從教師指導(dǎo)認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告加強(qiáng)安全觀念加強(qiáng)安全觀念愛護(hù)公共財(cái)物愛護(hù)公共財(cái)物money洗凈一切儀器用品，洗凈一切儀器用品，桌面整潔干凈桌面整潔干凈凈儀器洗滌要求試管、燒杯量筒、 吸管2 桌面，邊臺，水池，窗臺，儀器要桌面，邊臺，水池，窗臺，儀器要一塵不一塵不染染，請值日生用抹布擦，請值日生用抹布擦干凈干凈。1 實(shí)驗(yàn)課結(jié)束后，請大家把凳子擺放實(shí)驗(yàn)課結(jié)束后，請大家把凳子擺放整齊整齊。 3 值日生最后掃地和拖地，值日生最后掃地和拖地，關(guān)閉關(guān)閉水電門窗，水電門窗， 帶教老師帶教老師檢查合格檢查合格后方可離開教室。后方可離開教室。 4 實(shí)驗(yàn)報(bào)告

2、下次實(shí)驗(yàn)課前交給老師。實(shí)驗(yàn)報(bào)告下次實(shí)驗(yàn)課前交給老師。10一、血清總蛋白質(zhì)測定（雙縮脲法）一、血清總蛋白質(zhì)測定（雙縮脲法）二、血清白蛋白測定（溴甲酚綠法）二、血清白蛋白測定（溴甲酚綠法） 三、三、A/G比值計(jì)算比值計(jì)算方法學(xué)介紹方法學(xué)介紹蛋白質(zhì)測定方法很多，常用的有：蛋白質(zhì)測定方法很多，常用的有：n化學(xué)法n物理法n染料結(jié)合法等 一一.化學(xué)法化學(xué)法凱氏定氮法：凱氏定氮法：用于測定生物物質(zhì)中總氮含量的方法，其準(zhǔn)確度高、精密度好，成為測定蛋白質(zhì)的最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于其測定手續(xù)繁瑣，操作復(fù)雜，費(fèi)時，除用作血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品定值及參考性測定工作外，現(xiàn)已很少在血清總蛋白測定中使用，不適合血清TP的常規(guī)測定

3、。一一.化學(xué)法化學(xué)法n酚試劑法：酚試劑法：靈敏度較高，可用于測定腦脊液和尿液中的微量蛋白質(zhì)，但由于該法是先測定出酪氨酸的量，再根據(jù)酪氨酸在蛋白質(zhì)中含量而得出蛋白質(zhì)的含量，因而準(zhǔn)確度較差。一一.化學(xué)法化學(xué)法雙縮脲法：雙縮脲法：測定蛋白質(zhì)最古老的方法之一，此反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是對白、球蛋白產(chǎn)生的顏色反應(yīng)相近，干擾物質(zhì)小，且不受溫度影響，唯一的缺點(diǎn)是靈敏度較低，比酚試劑法低約100倍。但本法的檢出限為0.21.7g/L，這相當(dāng)于70g/L的血清324l，已能滿足臨床生化檢驗(yàn)的需要，成為臨床實(shí)驗(yàn)室血清TP首選的最方便，實(shí)用的常規(guī)方法。二二 物理法：物理法： 又可分為紫外吸收法、折射法和重量法等。除紫外吸收法外

4、，其他方法現(xiàn)已很少使用或被淘汰。三三 蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的方法蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的方法 是比較靈敏而特異的一類方法。用的較多的染料有麗春紅、考馬斯亮藍(lán)G250和鄰苯三酚紅鉬。麗春紅蛋白結(jié)合法測得的結(jié)果與凱氏定氮法相符，并且顯色后在室溫可穩(wěn)定24小時；考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合蛋白法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡便，廣泛用于尿蛋白，腦脊液蛋白及各種微量蛋白的檢測，但該方法測定蛋白濃度的線性范圍不寬，與白、球蛋白反應(yīng)的靈敏度不同，反應(yīng)強(qiáng)度亦受溫度的影響，且比色杯吸附色素而干擾測定，不能用于自動化分析儀，因此該法的應(yīng)用受到了一定的限制；鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合顯色法克服了考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合蛋白法的上述缺點(diǎn)，且具有簡

5、便、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于自動化分析儀。雙縮脲法測定血清總蛋白雙縮脲法測定血清總蛋白【目的與要求目的與要求】1.掌握雙縮脲法測定血清總蛋白的原理和方法；2.掌握分光光度計(jì)的使用方法和日常維護(hù)；3.熟悉血清總蛋白各種測定方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。 18【原理】血清(漿)中蛋白質(zhì)的肽鍵(-CO-NH-)在堿性溶液中能與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)和兩個尿素分子縮合后生成的雙縮脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應(yīng)相似，故稱之為雙縮脲反應(yīng)。這種紫紅色絡(luò)合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內(nèi)與血清蛋白含量呈正比關(guān)系，經(jīng)與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比

6、較，即可求得蛋白質(zhì)含量。雙縮脲法測定血清總蛋白雙縮脲法測定血清總蛋白19 16 mol/L NaOH溶液溶液 2雙縮脲試劑 3雙縮脲空白試劑 46070g/L蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液 5儀器 分光光度計(jì)。 20操作步驟操作步驟n1.取試管4支，標(biāo)明測定管（U）、標(biāo)準(zhǔn)管（S）、標(biāo)本空白管（B）、試劑空白管（RB）。操作步驟操作步驟2.按下表操作。 加入物(ml)空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣本管血清0.05蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.05蒸餾水0.05TP試劑3.03.03.0混勻,37度孵育20分鐘,540nm比色,空白管調(diào)零操作步驟操作步驟n3.混勻，置25 30min或37 10min，n4.在波長540nm處比色，用蒸餾水調(diào)零，

7、測各管吸光度。n5.手工操作參數(shù)：手工操作參數(shù)：波長540nm，光徑1cm；溫度：室溫（18-26 ）；模式：終點(diǎn)法；反應(yīng)時間：30min，樣本量：100ul，試劑量：5ml.5.計(jì)算計(jì)算 血清總蛋白(g/L)=樣本管吸樣本管吸光度光度xC標(biāo)準(zhǔn) (g/L) -標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度血清總蛋白血清總蛋白參考范圍參考范圍 正常成人血清總蛋白參考范圍 6080g/L。長久臥床者約低3-5g/L，60歲以上約低2g/L ，新生兒TP濃度較低，隨后逐月緩慢上升，大約1歲后達(dá)成人水平。【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】1.測定的血清以新鮮為宜，但在冰箱保存而不混濁的標(biāo)本也可應(yīng)用，高脂血癥混濁血清會干擾比色，可采用下述

8、方法消除：取2支帶塞試管或離心管，各加待測血清0.1ml，再加蒸餾水0.5ml和丙酮10ml，塞緊并顛倒混勻10次后離心，傾去上清液，將試管倒立于濾紙上吸去殘余液體。向沉淀中分別加入雙縮脲試劑及雙縮脲空白試劑，再進(jìn)行與上述相同的其他操作和計(jì)算?！咀⒁馐马?xiàng)注意事項(xiàng)】2.膽紅素和血紅蛋白本身的顏色可引起吸光值增加，造成陽性干擾，但經(jīng)樣品空白校正后可忽略不計(jì)。由于血紅蛋白本身能與雙縮脲試劑反應(yīng)，產(chǎn)生與血清白蛋白和球蛋白相近的顯色效價，故應(yīng)注意高血紅蛋白的影響?！咀⒁馐马?xiàng)注意事項(xiàng)】3. 酚酞、溴磺酞鈉在堿性溶液中呈色，影響測定結(jié)果，右旋糖酐可使測定管混濁亦影響結(jié)果，理論上這些干擾均可用相應(yīng)的標(biāo)本空白管

9、來消除。 【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】n4.蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑反應(yīng)生成紫色復(fù)合物的吸光度與試劑的組分、pH、反應(yīng)溫度以及蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，所以在做蛋白質(zhì)標(biāo)化測定時，實(shí)驗(yàn)儀器的技術(shù)狀態(tài)和反應(yīng)條件等都必須嚴(yán)格加以控制?！咀⒁馐马?xiàng)注意事項(xiàng)】5.血清蛋白質(zhì)的含量一般用g/L表示，因?yàn)楦鞣N蛋白質(zhì)的分子量不同，不能用mol/L表示。注意要點(diǎn)：1黃疸血清，溶血，高糖，酚酞等干擾用樣本空白來消除。2加入顯色劑要準(zhǔn)確，加入后立即混勻。3. 本反應(yīng)是TP的最常用和方便的方法，也便于自動化分析。4. 其與蛋白質(zhì)中的肽鍵成正比關(guān)系，與蛋白質(zhì)的種類及AA的組成無明顯關(guān)系.【臨床意義臨床意義】1血清總蛋白濃度降低（1）蛋白質(zhì)合成

10、障礙（2）蛋白質(zhì)丟失增加（3）營養(yǎng)不良或消耗增加（4）血漿稀釋2血清總蛋白濃度增高（1）蛋白質(zhì)合成增加（2）血漿濃縮血清白蛋白測定血清白蛋白測定 血清白蛋白測定法主要有色氨酸含量法、染料結(jié)合法、電泳法、免疫化學(xué)法和電化學(xué)測定法，但目前國內(nèi)最常用的是染料結(jié)合法中的溴甲酚綠法。血清白蛋白測定（血清白蛋白測定（BCG法）法）【目的與要求目的與要求】 1.掌握BCG法測定血清白蛋白的原理和方法及影響因素、條件控制； 2.熟悉微量加樣的基本技能； 3.了解血清白蛋白各種測定方法的優(yōu)缺點(diǎn)。血清白蛋白測定（血清白蛋白測定（BCG法）法） 【原理原理】 血清白蛋白在pH4.2的緩沖液中帶正電荷，在有非離子型表

11、面活性劑存在時，可與帶負(fù)電荷的染料溴甲酚綠(bromocresol green，BCG)結(jié)合形成藍(lán)綠色復(fù)合物，在波長630nm處有吸收峰，其顏色深淺與白蛋白濃度成正比例，與同樣處理的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較，可求得血清中白蛋白含量?！驹噭┰噭?0.5mol/L琥珀酸緩沖貯存液(pH4.0) 210mmol/L BCG貯存液 3疊氮鈉貯存液 4聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)貯存液 5BCG試劑 660g/L白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 7. 儀器 分光光度計(jì)。 【操作步驟操作步驟】 n取試管3支，標(biāo)明空白管（B）、標(biāo)準(zhǔn)管（S）、測定管（U）n【操作步驟操作步驟】n按表操作。加入物(ml)空白管（B)標(biāo)準(zhǔn)管（S）測定

12、管（U）血清-0.01蛋白標(biāo)準(zhǔn)液-0.01-蒸餾水0.01-BCG試劑3.03.03.0 【操作步驟操作步驟】在波長630nm處用空白管調(diào)零，用定量加液器加BCG試劑，與測定管血清混合后，立即在303s內(nèi)，讀取吸光度。4.手工操作參數(shù)：手工操作參數(shù)：波長630nm，光徑1cm；溫度：室溫（18-26 ）；模式：終點(diǎn)法；反應(yīng)時間：30s，樣本量：0.02ml，試劑量：4ml計(jì)算結(jié)果計(jì)算結(jié)果血清白蛋白(g/L)=A A測定測定xC標(biāo)準(zhǔn) (g/L) -A A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 參考范圍參考范圍正常成人血清白蛋白參考范圍 :3555g/L。*注意注意:如標(biāo)本因嚴(yán)重高脂血癥而混濁，需加做標(biāo)本空白管(取血清0.02

13、ml，加入琥珀酸緩沖貯存液4.0ml)，用琥珀酸緩沖貯存液調(diào)零，測定標(biāo)本空白管吸光度。用測定管吸光度減去標(biāo)本空白管吸光度后，再計(jì)算結(jié)果。【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】 1. BCG是一種pH指示劑，變色域?yàn)閜H3.8(顯黃色)5.4(顯藍(lán)綠色)，受酸、堿影響較大，故所用的器材必須無酸、堿污染，BCG工作液的pH必須精確度監(jiān)測，務(wù)必使其保持在pH4.150.05限度內(nèi)。【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】 2.BCG與球蛋白的反應(yīng)強(qiáng)度與環(huán)境溫度有關(guān)（溫度升高，呈色加速加深）。BCG工作液中的表面活性劑雖有延緩BCG與球蛋白的非特異性反應(yīng)的作用，但亦將測定標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液置于同一溫度下操作，以抵消溫度的干擾作用。【注意事項(xiàng)注意

14、事項(xiàng)】 3.Brij-35是非離子型表面活性劑，其濃度大小對結(jié)果測定有影響，濃度越大，吸光度越低，但顯色穩(wěn)定。Brij-35也可用其他表面活性劑代替，如吐溫-20或吐溫-80，終濃度為2ml/L，靈敏度和線性范圍不變?！咀⒁馐马?xiàng)注意事項(xiàng)】4. 實(shí)驗(yàn)證明，BCG不但與白蛋白呈色，而且與血清中多種蛋白質(zhì)成分呈色，其中以1-球蛋白、運(yùn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白更為顯著，其反應(yīng)速度較白蛋白稍慢。由于在30s內(nèi)呈色對白蛋白特異，故BCG與血清混合后，在30s讀取吸光度，可明顯減少非特異性呈色反應(yīng)。為了減少本法基質(zhì)效應(yīng)的影響，最好用參考血清作標(biāo)準(zhǔn)。【方法學(xué)評價方法學(xué)評價】1.本法操作簡便、快速，膽紅素和一般脂血對測定無明顯干擾?！痉椒▽W(xué)評價方法學(xué)評價】2.血紅蛋白和BCG產(chǎn)生與白蛋白相等的顏色強(qiáng)度，血紅蛋白在1g/L以下無明顯干擾，2g/L使吸光度增高3.2%，3g/L使吸光度增高7.4%，4g/L使吸光度增高7.7%，5g/L使吸光度增高8.8%，所以溶血標(biāo)本不宜做BCG法白蛋白測定?！痉椒▽W(xué)評價方法學(xué)評價】3.本法既可手工操作，也能自動化分析，是目前國內(nèi)測定血清白蛋白的最常用方法。本法線性范圍為1060g/L，RCV4%。但該法與溴甲酚紫法比較，對血清白蛋白特異性稍差。 三、三、A/G比值計(jì)算比值計(jì)算1.用雙縮脲法測定血清標(biāo)本中總蛋白濃度，用溴甲溴甲酚綠法測定血清