基因工程的基本步驟

1、課題導(dǎo)入： 請(qǐng)從基因工程的概念思考獲得請(qǐng)從基因工程的概念思考獲得“藍(lán)色妖姬藍(lán)色妖姬”的基本操作程序的基本操作程序1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目標(biāo)引領(lǐng)：目標(biāo)引領(lǐng)：1 1、能說出基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟、能說出基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟2 2、能準(zhǔn)確描述獲取目的基因的方法、能準(zhǔn)確描述獲取目的基因的方法3 3、能說出基因表達(dá)載體的具體元件、能說出基因表達(dá)載體的具體元件獨(dú)立自學(xué)：閱讀教材獨(dú)立自學(xué)：閱讀教材P8-10思考：思考：1 1、基因工程的基本操作程序包括那、基因工程的基本操作程序包括那四個(gè)步驟四個(gè)步驟2 2、何為目的基因，獲取目的基因的、何為目的基因，獲取目

2、的基因的方法方法有那幾種？有那幾種？3 3、何為、何為基因文庫基因文庫，有幾種類型，如何構(gòu)建？它們之，有幾種類型，如何構(gòu)建？它們之 間有何區(qū)別？間有何區(qū)別？4 4、PCRPCR技術(shù)的具體過程包括技術(shù)的具體過程包括幾步幾步，需要哪些條件？，需要哪些條件？6 6、基因表達(dá)載體構(gòu)建的、基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的是什么目的是什么？應(yīng)包括那些具？應(yīng)包括那些具 體元件？體元件？5 5、人工合成目的基因、人工合成目的基因如何進(jìn)行如何進(jìn)行？引導(dǎo)探究：引導(dǎo)探究：1 1、為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生、為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取行嗎？物體內(nèi)提取行嗎？2 2、為什么、為什么cD

3、NAcDNA文庫中的基因不含有啟動(dòng)子和內(nèi)含子？文庫中的基因不含有啟動(dòng)子和內(nèi)含子？為什么基因組文庫中的基因只有部分能進(jìn)行物種間基為什么基因組文庫中的基因只有部分能進(jìn)行物種間基因交流？因交流？3 3、PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的方法應(yīng)具備什么條件？技術(shù)擴(kuò)增目的基因的方法應(yīng)具備什么條件？4 4、如何構(gòu)建基因表達(dá)載體？、如何構(gòu)建基因表達(dá)載體？5 5、基因表達(dá)載體各元件分別有那些、基因表達(dá)載體各元件分別有那些具體作用具體作用1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 第二課時(shí)第二課時(shí)目標(biāo)引領(lǐng)：目標(biāo)引領(lǐng)：1 1、能說出目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的基本方法、能說出目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的基本方法2

4、2、能準(zhǔn)確描述目的基因檢測(cè)與鑒定的方法和步驟、能準(zhǔn)確描述目的基因檢測(cè)與鑒定的方法和步驟獨(dú)立自學(xué)：閱讀教材獨(dú)立自學(xué)：閱讀教材P10-15思考：思考：1 1、何為、何為轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化？將目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的方法？將目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的方法 一樣嗎？請(qǐng)舉例說明一樣嗎？請(qǐng)舉例說明2 2、如何確定、如何確定轉(zhuǎn)化成功轉(zhuǎn)化成功？需要確認(rèn)那些信息？用什么？需要確認(rèn)那些信息？用什么 具體的方法？具體的方法？引導(dǎo)探究：引導(dǎo)探究：1 1、農(nóng)桿菌有何特點(diǎn)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的、農(nóng)桿菌有何特點(diǎn)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是什么原理是什么？用？用 文字和箭頭寫出具體過程文字和箭頭寫出具體過程2 2、根據(jù)農(nóng)桿菌可以將目的基因?qū)腚p

5、子葉植物的機(jī)理，、根據(jù)農(nóng)桿菌可以將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理，你能否設(shè)計(jì)一個(gè)方案將一個(gè)抗病基因?qū)雴巫尤~植物你能否設(shè)計(jì)一個(gè)方案將一個(gè)抗病基因?qū)雴巫尤~植物中？中？3 3、請(qǐng)用文字和箭頭寫出顯微注射法的、請(qǐng)用文字和箭頭寫出顯微注射法的具體過程具體過程4 4、作為受體生物原核生物有何優(yōu)點(diǎn)？請(qǐng)用文字和箭、作為受體生物原核生物有何優(yōu)點(diǎn)？請(qǐng)用文字和箭頭寫出目的基因?qū)朐思?xì)胞的頭寫出目的基因?qū)朐思?xì)胞的具體過程具體過程5 5、請(qǐng)具體描述各種檢測(cè)和鑒定方法的、請(qǐng)具體描述各種檢測(cè)和鑒定方法的具體操作過程具體操作過程歸納: 基因工程的基本操作程序1.1. 獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利

6、用利用PCRPCRu化學(xué)方法人工合成化學(xué)方法人工合成2.2. 構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體u目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.3. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.4. 目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定u檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：抗蟲性、抗病性等鑒定：抗蟲性、抗病性等目標(biāo)升華目標(biāo)升華1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定

7、、目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用 載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。中的轉(zhuǎn)化。 才能確定目的基因是否才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。遺傳和正確表達(dá)。一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取（一）、目的基因主要是（一）、目的基因主要是_編碼

8、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫中獲取、從基因文庫中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增3 3、人工合成、人工合成1、從基因文庫中直接獲取、從基因文庫中直接獲取（1 1）基因文庫：）基因文庫：概念見概念見P9P9（2 2）基因文庫的分類）基因文庫的分類: :按外源按外源DNADNA片段的來源分類片段的來源分類種種類類基因組基因組DNA文庫：文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：

9、cDNA文庫文庫提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖杏眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫基因組文庫（3 3）基因文庫的構(gòu)建方法）基因文庫的構(gòu)建方法1 1、直接分離法、直接分離法( (鳥槍法鳥槍法) )某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈互補(bǔ)單鏈互補(bǔ)DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶2 2、反轉(zhuǎn)錄法：、反轉(zhuǎn)錄法：cD

10、NAcDNA的合成流程圖解的合成流程圖解（4 4）兩種基因文庫的區(qū)別）兩種基因文庫的區(qū)別 過程過程高溫變性（高溫變性（解旋為單鏈解旋為單鏈）低溫退火（低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（適溫延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 與模板互補(bǔ)的與模板互補(bǔ)的DNADNA雙鏈雙鏈）重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（預(yù)變性（增加增加DNADNA變性的概率變性的概率）2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸(dNTP(dNTP) ) 引物引物：熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA(

11、需需含有目的基因含有目的基因 ) ) 緩沖溶液緩沖溶液寡核苷酸序列：與目的基因的起寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)始段互補(bǔ)3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用?；蚰軌虮磉_(dá)和發(fā)揮作用。2 2、基因表達(dá)載體的組成：、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+ +目的基因目的基因+ +啟動(dòng)子啟動(dòng)子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基因標(biāo)記基因啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子

12、：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來胞篩選出來載體載體與與表達(dá)載體表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因的區(qū)別：二

13、者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNADNA片段。表達(dá)載體在載體片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部三部分結(jié)構(gòu)分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又既用到限制酶切割載體，又用到用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子、終止子啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去

14、。注意注意三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的

15、基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢查是否成功1 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力數(shù)單子

16、葉植物沒有感染能力原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的色體的DNA上。上。過程：過程：優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)2 2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法：用用Ca2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 表表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞吸收細(xì)胞吸收DNA分子分子（一）、檢測(cè)（一）、檢測(cè)1 1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟) ).首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA.將含目的基因的將含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作標(biāo)記等作標(biāo)記,以此做探針以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯若顯示出雜交帶示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNA中中（1）方法方法: