實(shí)驗(yàn)二動(dòng)物基因組DNA的提取

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 動(dòng)物動(dòng)物基因組基因組DNADNA的的提取提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?.說(shuō)出提取真核生物基因組DNA的原理和步驟、現(xiàn)象2.熟練地進(jìn)行真核生物基因組DNA的提取操作二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，將DNA從細(xì)胞中析出并與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，再用飽和氯化鈉溶液代替有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)，獲得DNA三、儀器三、儀器、材料及、材料及試劑試劑1 1. .儀器儀器主要設(shè)備：主要設(shè)備：電熱恒溫干燥箱（烘箱）、低溫離心機(jī)、移液器（2,10,20,30,200,1000l）、槍頭、1ml離心管（滅菌）、塑料離心管架、吸頭（滅菌）、高壓滅菌鍋、冰箱其它用品：其它用品：一次性

2、塑料手套、無(wú)粉橡膠手套、小型剪刀、小型鑷子2.2.材料、試劑材料、試劑材料：鯉材料：鯉尾鰭尾鰭組織組織試劑：瓊脂糖（檢測(cè)用）、蛋白酶K、溴化乙錠（EB） （檢測(cè)用） 、Na2EDTA2H2O、Tris base堿(MW 121.1)、十二烷基硫酸鈉（SDS）、NaOH、氯化鈉、無(wú)水乙醇、Tris-HCl 、乙二胺四乙酸（EDTA）。DNA提取所需的試劑配制HOM BufferHOM Buffer：稱取29.8g Na2EDTA2H2O 溶于700mL雙蒸水中，加入12.1g Tris base堿和5g SDS，NaOH調(diào)至pH=8.0，定容至1000mL。蛋白酶蛋白酶K K：15mg蛋白酶K溶

3、于1mL雙蒸水，-20冷凍保存。4.5 4.5 M M氯化鈉氯化鈉：稱取263.25g氯化鈉溶于700mL雙蒸水中，定容至1000mL。7575乙醇乙醇：750mL的無(wú)水乙醇溶于200mL的雙蒸水，定容至1000mL。 4預(yù)冷。TE TE 緩沖液緩沖液：1M Tris-HCl (pH=8.0 ) 2mL，0.5M EDTA (pH=8.0 ) 0.2mL與97.8mL雙蒸水混勻。四、實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)步驟步驟（一）動(dòng)物（一）動(dòng)物組織材料的采集、保存組織材料的采集、保存( (以魚類分子材料的采集為例以魚類分子材料的采集為例) )鰭條鰭條通常采集各鰭條，因?yàn)槲馋挷杉奖悖枯^大。1）剪取鰭條（注意鰭條量

4、不要太多，過(guò)多脫水不完全，容易造成材料損壞。通常為離心管的一半就可以了）；剪取鰭條前洗凈手、剪刀，不要粘附有上一尾魚的材料，包括鮮血。2）將鰭條放入10mL離心管中 ；3）加入95-100%的酒精（加滿）；4）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更換酒精（后2次可依具體情況更換）。5）用中性筆寫上標(biāo)簽，編號(hào)為“地點(diǎn)編號(hào)年月日001”起，如020120728001，其中0（地點(diǎn)編號(hào)）2012（年）07（月）08（日）001（當(dāng)天編號(hào)）。將標(biāo)簽放入離心管中。肌肉肌肉1）洗凈手、剪刀，不要粘附有上一尾魚的材料，包括鮮血。2）用剪刀去除魚類皮膚3）剪取長(zhǎng)條形肌肉（不要太厚，可以適當(dāng)長(zhǎng)一些，薄一

5、些，便于脫水、固定DNA）4）將肌肉放入10mL離心管中5）加入95-100%的酒精（加滿）；6）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更換酒精（后2次可依具體情況更換）。7）用中性筆寫上標(biāo)簽，編號(hào)為“地點(diǎn)編號(hào)年月日001”起，如020120728001，其中0（地點(diǎn)編號(hào)）2012（年）07（月）08（日）001（當(dāng)天編號(hào)）。將標(biāo)簽放入離心管中。魚類分子樣品的保存每個(gè)地方，不同魚類材料放到不同封口袋中保存，注意防止酒精揮發(fā)。溫度最好保持在4 以下。（二）DNA提取(高鹽法) 取0.05-0.1g 左右的尾鰭組織，充分剪碎，放入1.5mL離心管中； 向離心管中加入1015L的蛋白酶K 、5

6、00L的HOM buffer，在55消化至少2-3h，每隔0.5-1h搖動(dòng)一次； 加500L氯化鈉（4.5M），300L氯仿，混5-20min，期間劇烈搖動(dòng)。13000r/min下離心10min； 轉(zhuǎn)移上清液到新管（大概850L左右），加595L無(wú)水異丙醇（0.7volume）,混20min， 13000r/min下離心10min，倒掉上清； 加500L 75乙醇，置5min，13000r/min下離心20min，倒掉上清液； 將試管倒立于吸水紙上，室溫下自然干燥； 加50100L的滅菌雙蒸水或TE溶解，-20(4)保存。注意事項(xiàng) （1）材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低； （

7、2）離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間； （3）沉淀后應(yīng)用75的乙醇洗滌，以除去鹽離子等； （4）室溫干燥DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）； （5）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解（pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解，TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase）。五、實(shí)驗(yàn)安排五、實(shí)驗(yàn)安排本實(shí)驗(yàn)一天內(nèi)可做完。第一次，約2.5h，取樣與酶解。酶解完成后，以班級(jí)為單位放入1.5mL離心管盒。第二次，約4h，DNA提取。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告/作業(yè) 1 1）蛋白酶）蛋白酶K K、7575乙醇的作用是什么？其使用量如何乙醇的作用是什么？其使用量如何掌握？掌握？ 2 2）你的組織材料消

8、化后消化液的顏色、透明度如何？）你的組織材料消化后消化液的顏色、透明度如何？是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？ 3 3）在試驗(yàn)的各步驟你看到什么現(xiàn)象？）在試驗(yàn)的各步驟你看到什么現(xiàn)象？ 4 4）敘述高鹽法提取動(dòng)物基因組）敘述高鹽法提取動(dòng)物基因組DNADNA的的步驟步驟。 5 5）生物科學(xué)專業(yè)作業(yè)：）生物科學(xué)專業(yè)作業(yè)：DNADNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)是人教版實(shí)驗(yàn)是人教版全日制普通高級(jí)中學(xué)全日制普通高級(jí)中學(xué)生物生物必修二中要求學(xué)生掌握并完必修二中要求學(xué)生掌握并完成的一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)成的一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)。（。（1 1）請(qǐng)）請(qǐng)你查閱資料，編制該實(shí)驗(yàn)的你查

9、閱資料，編制該實(shí)驗(yàn)的方案，說(shuō)明每一步驟的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模梢陨暾?qǐng)自行到實(shí)驗(yàn)室方案，說(shuō)明每一步驟的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模梢陨暾?qǐng)自行到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)）進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)）。（。（2 2）為什么）為什么是粗提（粗在什么地方）？是粗提（粗在什么地方）？并對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行改進(jìn)以獲得純度較高的并對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行改進(jìn)以獲得純度較高的DNADNA。（。（3 3）現(xiàn)在現(xiàn)在如果要進(jìn)一步地拓展中學(xué)生的能力，需要在植物如果要進(jìn)一步地拓展中學(xué)生的能力，需要在植物 提提取取DNADNA，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)中學(xué)能夠開展的生植物，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)中學(xué)能夠開展的生植物DNADNA提取實(shí)驗(yàn)。提取實(shí)驗(yàn)。6 6）生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)作業(yè)：在制藥企業(yè)中，往往需鑒定）生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)作業(yè)：在制藥企業(yè)中，往往需鑒定中藥材的來(lái)源和純度。鑒定過(guò)程中需要進(jìn)行中藥材的來(lái)源和純度。鑒定過(guò)程中需要進(jìn)行DNADNA提取。請(qǐng)?zhí)崛?。?qǐng)查閱資料，設(shè)計(jì)一個(gè)在植物