生化與分子生物學(xué)技術(shù)原理

1、 一.基本的化學(xué)組成 經(jīng)不同程度水解可獲得核酸各種組成部分 核苷酸核苷酸 nucleotide Nt 核苷核苷 nucleoside Ns 堿基堿基 嘌呤 purine Pu 嘧啶 pyrimidine Py 堿基三字符號(hào) Ade Cyt Gua Thy Ura Ns單字符號(hào) (d) A C G T U Ns, Nt, oligoNts 中均為D-戊糖 堿基可異構(gòu)化 異構(gòu)平衡僅 H 原子位置變化UV,NMR分析 生理 pH 條件下, 5種堿基 99.99% 以氨基與酮式存在。酮式酮式烯醇式烯醇式氨基氨基亞胺亞胺 N-糖苷鍵 C1 與嘧啶 N1 連接 C1 與嘌呤 N9 連接 oligo 表示法

2、 poly U 均聚物 poly (dA-dT) 交替排列 poly (dAdT) 隨機(jī)排列 poly A2poly U 按1:2結(jié)合成復(fù)合物 (三鏈) 二. 糖環(huán)的折疊形式 構(gòu)型構(gòu)型(configuration)(configuration)共價(jià)化合物中,各個(gè)原子在空間的相對(duì)排列關(guān)系。 構(gòu)型的改變涉及到共價(jià)鍵破壞 核酸中核糖僅一種構(gòu)型 ： - D型 構(gòu)象構(gòu)象(conformation) (conformation) 化合物內(nèi)可以自由轉(zhuǎn)動(dòng)的單鍵上的原子或基團(tuán),繞單鍵旋轉(zhuǎn)或隨單鍵扭轉(zhuǎn),產(chǎn)生幾種不同的空間排列形式。 構(gòu)象的改變并不伴隨共價(jià)鍵的破壞 核酸中的核糖有多種構(gòu)象 核糖的五員環(huán)不處于一個(gè)平面

3、，C1，O，和 C4 三個(gè)原子在一個(gè)平面上，C2 或/和 C3 偏離此平面，使核糖產(chǎn)生不同的構(gòu)象。 內(nèi)式構(gòu)象內(nèi)式構(gòu)象(endo)偏離平面的方向和 C5同向 外式構(gòu)象外式構(gòu)象(exo) 偏離平面的方向和 C5反向1. 信封式 (Envelope, E ) 糖環(huán)的 C 2或 C 3 1個(gè)原子偏離平面的折疊 C2-endo ( 2E ) C3-endo ( 3E ) C2-exo ( E2 ) C3-exo ( E3 ) 內(nèi)式內(nèi)式外式外式2. 扭轉(zhuǎn)式 ( Twist, T ) 糖環(huán)的 C2 和 C3 兩個(gè)原子都偏離糖平面,而且取方向相反的折疊。 兩個(gè)原子偏離糖平面的程度可以相等或不等 C2-endo

4、-C3-exo C2-exo-C3-endo 存在 溶液 : Nt , Ns C2-endo C3-endo DNA : B-DNA C2-endo A-DNA(RNA) C3-endo Z-DNA 胞苷(C) C2-endo ( 反式） 鳥苷(G) C3-endo（順式 ）(B-form double DNA)(A-form double DNA)三. 核苷的順?lè)礃?gòu)象( syn-anti 構(gòu)象) 核糖和堿基以N-糖苷鍵連接成核苷，核苷中堿基平面繞糖苷鍵旋轉(zhuǎn)形成核苷的順?lè)礃?gòu)象。 扭轉(zhuǎn)角決定核苷的構(gòu)象 存在 溶液: 順?lè)词娇苫Q 結(jié)晶: 順?lè)词讲豢苫Q C2-endoC3-endo四. 核酸的修

5、飾成分及甲基化 1948年 小牛胸腺DNA分離 m5dC 特點(diǎn): 原有成分的衍生物 含量少(百分之幾萬(wàn)分之幾) 主要化學(xué)鍵不變 1.修飾堿基 60余種 Ura Ade Gua Cyt ThyUra Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 堿基上原子被其他基團(tuán)取代 m p om AA衍生物 Base-CO-NH-AA 糖衍生物 Base-CH2OH-糖(6C) 非嘌呤,嘧啶衍生物 ( tRNA )W異丙烯 GuatRNA anticodon 3鄰位Q 7-去N-GuatRNA anticodon 擺動(dòng)位2.修飾核糖 RNA C2-OH 甲基化 ( Nm ) 抗水解 (Rnase

6、 , OH ) 二聚體 NmpNp3. 糖苷鍵不同 假尿苷 (tRNA rRNA) C5-C1 糖苷鍵4. 修飾符號(hào) m1A m7G Cm m m2G m3 G22.2.75. 分布 a. RNA 70 mRNA ( hnRNA mRNA ) 5-Cap: m7G Nm 分子內(nèi): m6A m5C rRNA 原核 m5C 真核 Nm mN 高度修飾成分( m1ncp3 ) Hela cell 28S rRNA 65Nm ( 70 ) 18S rRNA 40Nm 6mN tRNA 60余種分布在環(huán)區(qū) anticodon loop 高度修飾 Q W SnRNA uRNA 5-end Cap m3 G

7、2.2.7 稀有堿基的形成 酶催化 -CH3 堿基交換 Q tRNA鳥嘌呤鳥嘌呤 糖苷轉(zhuǎn)移酶糖苷轉(zhuǎn)移酶 G34 (tRNA) Q34 (tRNA) Q Gua N- 糖苷鍵打斷、重建 b. DNA 10 種 甲基化 形成 合成時(shí)om5dC參入 phage T 2.4.6 合成后甲基化 m5dC m6dA m4dC DNA 甲基化酶 S-腺苷甲硫氨酸（甲基供體） 6.甲基化與基因表達(dá) a. 原核生物DNA甲基化 限制修飾系統(tǒng) DNA甲基化與復(fù)制 E. coli dam G *ATC dcm C *CA/TGG 完全甲基化 oriC 復(fù)制活性 半甲基化 oriC 抑制復(fù)制活性 oriC, dna

8、甲基化速度與復(fù)制循環(huán) 半甲基化 oriC 與膜結(jié)合抑制復(fù)制(抑制劑) * dam 半甲基化產(chǎn)物積累半甲基化產(chǎn)物積累 b.真核生物DNA甲基化 甲基化在兩條鏈上, 對(duì)稱分布 真核生物真核生物 5-mCpG-3 植物 5-mCNG-3 dC mdC 影響DNA-蛋白質(zhì)相互作用 甲基化格式具有組織專一性 pattern of methylation 格式變化: 配子發(fā)生時(shí)期, 胚胎發(fā)育早 期,病毒感染 格式維持:DNA甲基化酶維持配子和體 細(xì)胞甲基化狀態(tài)甲基化格式的維持甲基化格式的維持C*CGGCCGGCCGG甲基化格式的限制性內(nèi)切酶分析甲基化格式的限制性內(nèi)切酶分析甲基化與基因表達(dá) 雞珠蛋白基因的組

9、織特異性分析(Mspl Hpall) CpG 表達(dá) (紅細(xì)胞） mCpG 不表達(dá)（腎、腦) 肌動(dòng)蛋白( actin gene)表達(dá) 高速率 轉(zhuǎn)錄 肌肉細(xì)胞 actin gene actin gene (CpG) (mCpG) 成纖維細(xì)胞 低速率 轉(zhuǎn)錄 Promoter -CpG- 甲基化與轉(zhuǎn)錄 -globin gene 200 +90 有甲基化基團(tuán) mCpG 轉(zhuǎn)錄受阻 除去部分 mCpG 轉(zhuǎn)錄受阻 除去所有 CpG 轉(zhuǎn)錄 5-氮胞苷抑制甲基化,瞬時(shí)去甲基化 5-NC 成纖維細(xì)胞 肌肉細(xì)胞 ( 多核 ,有條紋, 可收縮 ) 甲基化與小鼠胚胎發(fā)育 knock out 甲基轉(zhuǎn)移酶 gene C 胚胎

10、發(fā)育早期 甲基化格式變換,其后細(xì)胞內(nèi)DNA維持特定的甲基化狀態(tài) 配子發(fā)生期,不同性別配子的甲基化格式是特定的。其區(qū)別使父母等位基因在胚胎中表達(dá)不同。 下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGF-胰島素-like生長(zhǎng) 因子依賴于父本表達(dá) Igf2R gene IGF-R胰島素-like生長(zhǎng) 因子受體依賴于母本表達(dá)一條一條X-染色體的失活染色體的失活 甲基化格式的建立、維持和改變 從無(wú)到有(de novo)甲基化 雙鏈相對(duì)-CpG- -mCpG- 確立新格式 甲基化的維持 脫甲基 被動(dòng) 復(fù)制后不再甲基化 主動(dòng) 甲基轉(zhuǎn)移 堿基切除修復(fù) CpG-rich islands 基因組中存在異常非甲基

11、化-CpG-順序簇 高含量 C+G 高頻率 CG dimer (10/100bp ) 分布不均, 長(zhǎng)1-2 kb，間隔 100 kb 非甲基化 CpG 存在：housekeeping genes tissues specific genes 5- 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄區(qū) 腺嘌呤磷酸核糖腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶CpG密度密度 1/100bpCpG密度密度 10/100bp 100 300 1. 1. 二氫葉酸還原酶基因二氫葉酸還原酶基因 2. 2. 次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖酶基因次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖酶基因 3. 3. 核糖體蛋白質(zhì)基因核糖體蛋白質(zhì)基因123 CG mCG抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì) MeCP-1 *CpG

12、成簇 MeCP-2 *CpGDNA甲基化有助于基因關(guān)閉甲基化有助于基因關(guān)閉五. 核酸及其化學(xué)組分的化學(xué)反應(yīng) 1.水解反應(yīng) 磷酸二酯鍵, 磷酸單酯鍵, N-糖苷鍵 a. 酶水解 b. 酸堿水解 磷酸二酯鍵 酸 熱強(qiáng)酸 dA,dG 0.1NHCl 30mi （100C) rA,rG 1M HCl 60min rC, rU 12M HClO4 60min 堿 DNA 不作用 RNA 鄰接基團(tuán)參與效應(yīng),生成磷酸 基轉(zhuǎn)移中間物,水解。 N-糖苷鍵 堿穩(wěn)定 酸不穩(wěn)定 DNA RNA dNs Ns 嘌呤Ns 嘧啶Ns 酸堿作用比較酸堿作用比較 DNA RNA 堿堿 / 2 or 3-Nt產(chǎn)物產(chǎn)物 酸酸 Pu

13、, Py, Pu, PyNt, 多聚核糖-P碎片 碎片 磷酸二酯鍵 嘧啶糖苷鍵穩(wěn)穩(wěn) 大大 定定 嘧啶糖苷鍵 磷酸二酯鍵 性性 小小 嘌呤糖苷鍵 嘌呤糖苷鍵2. -消除反應(yīng) 連接磷酸基團(tuán)的 -C 原子上有強(qiáng)的吸電子基團(tuán)存在時(shí), 引起 -C 原子和 O 原子間的鍵斷裂。 OH R P O CH2 CH2 Z (CHO, C=O , HC=N A-N1 C-N3 T-N3 DMS作用于dsDNA A-N3(Me) , 阻止DNA pol. 強(qiáng)(Hard) 烷化劑 N-甲基-N-亞硝基脲(MNU) N-乙基-N-亞硝基脲(ENU) Me N , O 核酸 50% 磷酸酯烷化 烷化劑直接致癌 DMS G

14、-O6 : G-N7 = 0.004 : 1 MNU G-O6 : G-N7 = 0.08 : 1 ( 肝 ) G-O6 : G-N7 = 0.15 : 1 ( 腦 ) G-N7(Me)不改變G:C配對(duì) G-O6(Me)不影響 DNA pol,但改變堿基對(duì), G T b. 鹵化反應(yīng) 嘧啶 5 位 5-FU 抗癌藥 鹵素分子 嘌呤 8 位 8-BrPu 標(biāo)記 c. 與醛類反應(yīng) 堿基的環(huán)外環(huán)外 NH2AMP: N6-NH2GMP: N2-NH2 甲醛是DNA不可逆變性劑 鑒定 ssDNA or dsDNA 破壞RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)，消除結(jié)構(gòu)對(duì)電泳遷移 率的影響 d. 核糖上的反應(yīng) 核糖的氧化反應(yīng) 核糖的

15、2，3-順二醇順二醇被高碘酸( HIO4)氧化成順二醛順二醛，胺催化 -消除反應(yīng)消除反應(yīng)，同時(shí)堿基脫落, 生成磷酸，堿基和糖碎片。 5-Nt 定量測(cè)定 RNA 序列測(cè)定 核糖的脫水反應(yīng) 酸性條件下，核糖或脫氧核糖脫水產(chǎn)物與試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)。可用定糖法比色測(cè)定 DNA or RNA 含量。 苔黑酚法測(cè)RNA 核糖 糠醛 二苯胺法測(cè) DNA 脫氧核糖 - 羥基 - 酮基戊醛-3H2O-2H2O六. 核酸組分的分離鑒定 1. 分離 a. 電泳分離 Nt and dNt Nt (dNt ) 的解離及pK值 pH3.5 ， Nts 間凈電荷 差異最大. ADP質(zhì)子化狀態(tài)質(zhì)子化狀態(tài) b. 層析 離子交

16、換層析 高效液相層析 ( HPLC ) 稀有成分纖維素薄板雙向?qū)游?靈敏, 快速, 穩(wěn)定。 20種 3- Nt, 22種 5- Nt, 40種 Ns, 14種抗水 解 NmNp dimer. AmGp GmAp CmUp UmCp2. 鑒定 a. 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(電泳,層析) UV吸收檢出 吸收 UV藍(lán)紫色斑點(diǎn), G藍(lán)色熒光, D無(wú)吸收。 b. 紫外光譜鑒定 溶液樣品在 220-290nm 波長(zhǎng)內(nèi)掃描, 確定 max and min , 對(duì)照參數(shù)(特定pH )。 例: pH 6-7 max min A 260 227 G 253 223 C 271 250 U 262 230 T 267 236

17、不同波長(zhǎng)下吸收比值 A250/A260 A280/A260 A290/A260 注意點(diǎn): 一般 max 250-280, min 220-250 吸收曲線特征與pH 相關(guān), pH 1,7,12 下測(cè)定。 Base 與 Ns 吸收值差異大 NsdNsNm NsNtdNt Gua類在酸性時(shí),UV下蘭色熒光,光譜曲線有 肩。 稀有成分的吸收光譜特征常不同于常見成分 一. 細(xì)胞中的核酸 1. 存在狀態(tài) 與蛋白質(zhì)結(jié)合 (除 tRNA ) 2. 分布 DNA : 原核 核質(zhì)區(qū) 真核 95%核內(nèi) 5%核外（mt,ct ) RNA : 原核 胞質(zhì) 真核 90%質(zhì)(15%細(xì)胞器） 10%核 3.含量 少, 細(xì)胞

18、干重5-15%, 1015-1010g / cell 4.大小 RNA 104-106 Da DNA 106 Da二.制備中注意事項(xiàng) 保持生物學(xué)功能,具有生物活性 分子完整,天然狀態(tài)(未變性) 1.簡(jiǎn)化步驟 2.避免高溫 0-4 3.避免過(guò)酸或過(guò)堿 pH 5-9 4.防止機(jī)械剪切作用（shearing ) 5.防止核酸酶降解作用 5. 防止核酸酶降解作用 a. DNase 活性需要 Me2+( Mg 2+, Ca2+, Mn2+) 螯合劑 SSC 檸檬酸三鈉-NaCl EDTA-Na2 乙二胺四乙酸鈉 ( Me2+) EGTA 乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+ 特異性) b. RNase 活

19、性不需Me2+，熱穩(wěn)定，回復(fù)能力強(qiáng). 防止外源RNase污染 污染源：器皿、溶液、操作者 措施 180高溫處理數(shù)小時(shí) 0.1% DEPC（二乙基焦碳酸鹽)處理 O O蛋白變性劑 C2H5OCOCOC2H5 共價(jià)修飾RNase 操作者 抑制內(nèi)源RNase 盡早、徹底去蛋白 非專一性吸附劑 RNase 堿性蛋白（pI 9.6）,中性pH下 靜電吸附皂土、復(fù)合硅酸鹽（Macaloid）、多聚陰 離子（肝素、聚乙烯硫酸酯） 蛋白變性劑異硫氰酸胍、SDS （十二烷基硫酸鈉）破細(xì)胞同時(shí)使 RNase 失活 RNase 抑制劑 RNasin 465aa 酸性蛋白（鼠肝、人胎盤）與RNase結(jié)合，保護(hù)RNA,

20、 不用于提取 核苷酸底物類似物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 ApUp RNaseA G2-5G RNaseT1三. 核酸的分離提取 總核酸目的核酸 細(xì)胞器 目的核酸 1.破細(xì)胞 物理法物理法石英沙研磨、超聲、勻漿、搗碎器 化學(xué)法化學(xué)法去污劑、蛋白變性劑破膜 生化法生化法溶菌酶、蛋白酶動(dòng)、植物材料液N2, 機(jī)械破碎細(xì)菌溶菌酶水解肽聚糖破壁培養(yǎng)細(xì)胞去污劑與蛋白酶破膜破膜用去污劑 SDSC12-H25-O-SO3 Na 0.5-2% 終濃度Na+ 1 M SDS影響 CsCl 梯度 Sarkosyl（十二烷基肌氨酸鈉）3% 終濃度 異硫氰酸胍 非離子型去污劑TritonX-100、Brij58 作用溫和、膜部 分破

21、2解聚核蛋白并除蛋白a.去污劑核酸 pI 2-2.5 SDS結(jié)合蛋白質(zhì)濃 KAc + SDS SDS-K b有機(jī)溶劑酚、氯仿蛋白質(zhì)變性劑酚、酚氯仿異戊醇、氯仿異戊醇注意：防剪切力（振蕩速度、大口吸管），處理酚（重蒸、緩沖液飽和、0.1% 8-羥基喹啉）cProteinase K 處理廣譜,水解力強(qiáng),可在SDS,EDTA存在下作用3核酸的沉淀a乙醇核酸的 Na, K 鹽在乙醇中 調(diào)節(jié)鹽濃度：0.1M NaCl, 0.3M NaAc, 2.5M NH4Ac 加2-2.5V 冷乙醇（95%） 攪出DNA 或離心 70-75% 乙醇洗滌去鹽 除盡EtOH,干燥 溶于 TE (10mM TrisHCl

22、pH 8.0,1m MEDTA) 核酸濃度0.1g/ml , 加助沉淀劑 重復(fù)沉淀，補(bǔ)鹽! b異丙醇0.3 M NaAc, 0.6-1V 選擇性沉淀 DNA and 大RNA, 體積小，不需低溫放置沸點(diǎn)高，鹽，須 EtOH 洗滌 4. 雜質(zhì)的去除 a. 小分子雜質(zhì) b. 多糖 樣品預(yù)處理 動(dòng)物 饑餓 植物 暗化 選擇性沉淀 異丙醇 糖與小分子RNA不 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨） CH3 | CH3(CH3)15N+CH3 + NA / CH3 CH3 CTANA NaNA (EtOH) + CTAAc（溶）（溶）Br-0.1M NaAc70% EtOH1% CTAB-0.35M NaCl

23、多糖溶解多糖溶解 c. RNA與DNA 互為雜質(zhì) DNP 溶于 1-2M NaCl RNP 溶于 0.14M NaCl 除RNA RNase( 100,15min 處理,除DNase) 除DNA RNase-free DNase 5. 保存 防止降解、變性 措施：滅菌、低溫、鹽濃度、pH、EDTA DNA TE buffer,4- 20, 70 % EtOH RNA 冰凍干燥、低溫6. 純度的初步鑒定 a. UV吸收曲線 b. UV吸收比值 DNA A260/A280 = 1.8 RNA A260/A280 = 2.0 核酸的含量測(cè)定(260nm,1cm 光徑) 1 A260 50g/ml d

24、sDNA 40g/ml ssDNA, RNA 36g/ml oligo Nts c. 膠電泳 定量, 定性四. 核酸的純化 1.超離心 a.類型 沉降速度法 被分離物質(zhì)在強(qiáng)大的離心力場(chǎng)中因沉降速度沉降速度不同而分離. (速度區(qū)帶超離心). 沉降平衡法 被分離物質(zhì)在離心時(shí)因浮密浮密度度 不同進(jìn)行分離.(浮密度梯度 or 等密度梯度超離心). 浮密度是溶劑化密度,即核酸銫鹽水化物( CsCl,H2O,NA )的密度. 不同介質(zhì)下,核酸的不同. CsCl DNA=1.71 ;Cs2SO4 DNA=1.45 pH 不同,堿基結(jié)合 Cs量不同,值不同. 沉降速度超離心沉降速度超離心 沉降平衡超離心沉降平

25、衡超離心原理 沉降速度不同 浮密度不同梯度物質(zhì) 蔗糖 0-70% CsCl 0-7.355M 密度1-1.3470 密度1-1.9052 NA密度 包含DNA1.71離心力場(chǎng) 強(qiáng) 5-6萬(wàn)rpm 稍強(qiáng) 3-5萬(wàn)rpm NA CsCl 成梯度分子運(yùn)動(dòng) 向管底 5S 小 or 于等密度處 16S rRNA (ds,ss,cc,oc,l 23S 大 DNA RNA )離心時(shí)間 較短 免于管底 長(zhǎng) 1-2 天時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 失敗 不變操作 制備梯度鋪樣離 CsCl+樣品混勻 心收集 離心收集應(yīng)用 RNA,ssDNA,限制性 DNA 酶切片段 b.沉降平衡超離心法的應(yīng)用 測(cè) 測(cè)(G + C)% =1.660

26、+ 0.098 (G + C)% 天然、線狀、ds DNA , 修飾少. (G + C)% 20 80% RNA , DNA 和蛋白質(zhì)的分離 中性CsCl RNA 1.9 , DNA 1.7 , 蛋白1.3-1.4 : RNA RNADNA DNA 蛋白質(zhì) 值不同的dsDNA的分離 (值差0.01-0.02) 影響 值的因素： (G + C)% 甲基化 , 重原子取代 N15 N14 重金屬原子結(jié)合 Cs2SO4 Ag+ GC-rich Hg2+ AT-rich 堿性 CsCl 離心分離DNA 兩條互補(bǔ)鏈 dsDNA變性 pH12-12.5 CsCl 離心 兩個(gè) 峰（兩條ssDNA） 變性DN

27、A 輕鏈（L） 重鏈（H） G + T 比例高， 大 pH 12 下, G-N1 and T-N3 解離，結(jié)合 Cs+ 多， 升高. 分離不同構(gòu)型DNA DNA 結(jié)合具插入作用藥物(溴乙錠 EB), 值降低. cc, oc和 l DNA 結(jié)合藥物的量不同, 變化不同. ccDNA結(jié)合少；oc和l DNA結(jié)合多. 純化質(zhì)粒ccDNA , 除RNA , oc ,l DNA 和染色體 DNA. 2. 膠電泳 快速、簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品用量少 a.原理 核酸 pI=2-2.5 , pH 8-8.3 時(shí), NA帶負(fù)電荷. * Pi pK1= 1 , pK2=6 完全解離 * -+NH= -NH= pK=

28、2.4-4.4 完全解離 * -NH- -N- + H+ pK=9.4-10 基本未解離 核酸分子大小不同,荷質(zhì)比相同.荷/質(zhì) = n+1/n 電泳緩沖液: TAE Tris-NaAc-EDTA pH 8.3 TBE Tris-Boric acid-EDTA pH 8.3 - b.膠類型的選 agarose gel 0.250kb (恒電場(chǎng)) 3010,000kb (交變脈沖電場(chǎng)） PAGE 51000 bp , 分辨率1bp 192-5-13-29 -32-39 -49-60溫度溫度(電壓電壓)對(duì)遷移率的影響對(duì)遷移率的影響鹽濃度對(duì)遷移率的影響鹽濃度對(duì)遷移率的影響c.核酸高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)分離的影響 分子量相同,構(gòu)型不同,遷移率不同 遷移率: cc l oc ccDNA超螺旋數(shù)不同,遷移率不同 ssDNA or RNA分子內(nèi)折疊影響遷移率 變性膠(脲、甲酰胺），醛處理RNA 線狀DNA的形狀 彎