食品毒理學(xué)_04食品毒理學(xué)實訓(xùn)

1、第四章第四章 食品毒理學(xué)實訓(xùn)食品毒理學(xué)實訓(xùn)實訓(xùn)一實訓(xùn)一 實驗動物的飼養(yǎng)管理實驗動物的飼養(yǎng)管理實訓(xùn)二實訓(xùn)二 實驗動物分組、標(biāo)記和染毒技術(shù)實驗動物分組、標(biāo)記和染毒技術(shù)實訓(xùn)三實訓(xùn)三 實驗動物解剖和生物樣本采集、制實驗動物解剖和生物樣本采集、制 備技術(shù)備技術(shù) 實訓(xùn)四實訓(xùn)四 小鼠急性毒性試驗小鼠急性毒性試驗實訓(xùn)五實訓(xùn)五 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗實訓(xùn)六實訓(xùn)六 小鼠精子畸變試驗小鼠精子畸變試驗 實訓(xùn)一實訓(xùn)一 實驗動物的飼養(yǎng)管理實驗動物的飼養(yǎng)管理一、實訓(xùn)目的一、實訓(xùn)目的實驗動物的飼養(yǎng)管理是保障食品毒理學(xué)動物實驗的基礎(chǔ)技術(shù)，通過本次實訓(xùn)了解實驗動物房的環(huán)境要求及管理要點，掌握實驗動物飼養(yǎng)管理的操

2、作方法和程序，掌握實驗動物健康的觀察和評價方法。二、儀器和材料小鼠、大鼠、兔、飼養(yǎng)盒、墊料、水瓶及輔助器材、開口器、體溫表等三、操作方法 1.大、小鼠的日常飼養(yǎng)管理 (1) 進(jìn)入屏障動物房的準(zhǔn)備 (2) 進(jìn)入動物房后的觀察 (3) 大、小鼠的喂料 (4) 大、小鼠的喂水 (5) 大、小鼠換飼養(yǎng)盒 (6) 清潔衛(wèi)生和消毒 (7) 記錄 2.兔的日常飼養(yǎng)管理 (1) 工作人員進(jìn)入兔室前須著工作服，穿膠鞋，戴口罩，戴手套、帽子。 (2) 進(jìn)入兔室后先觀察兔只健康狀況，記錄異常兔只并交由獸醫(yī)師處置。 (3) 飲水 (4) 飼料 (5) 衛(wèi)生消毒 (6)記錄 3.實驗動物健康的觀察和評價（1）動物的外表

3、與行為觀察（2）個體檢查（3）采食和飲水觀察四、實訓(xùn)結(jié)果四、實訓(xùn)結(jié)果1.計算動物一晝夜之內(nèi)的攝食量和飲水量。2.對動物進(jìn)行觀察檢查后，認(rèn)真填寫以下記錄表，作出相應(yīng)評價。 健康觀察記錄表動物品系：動物品系：綜合評價： 觀察人： 日期： 實訓(xùn)二實訓(xùn)二 實驗動物的分組、實驗動物的分組、 標(biāo)記和染毒技術(shù)標(biāo)記和染毒技術(shù)一、實訓(xùn)目的一、實訓(xùn)目的實驗動物科學(xué)的分組、標(biāo)記和合理的染毒是取得良好試驗結(jié)果和結(jié)論的前提，也是每一項毒理學(xué)試驗首先要做的工作。通過本次試驗掌握實驗動物雌雄鑒別方法、科學(xué)分組、標(biāo)記和常用基本染毒技術(shù)。二、儀器和材料二、儀器和材料 1實驗動物：成年健康小鼠、大鼠、豚鼠、家兔若干只。 2染料：

4、結(jié)晶紫、苦味酸、品紅。 3毛筆或棉簽。 4動物稱或天平 5灌胃針 三、操作方法和步驟(一)健康動物的選擇和性別鑒定1.健康動物選擇：2.性別鑒定： 大、小鼠；豚鼠；家兔。 （二（二)稱重、分組與標(biāo)記稱重、分組與標(biāo)記 1稱重：根據(jù)不同試驗要求，選擇不同體重的動物。在同一組內(nèi)，同性別動物體重差異應(yīng)小于平均體重的10，組間同性別動物體重均值應(yīng)小于5。稱量大、小鼠體重時天平的感量要求在0.1 g以下。 隨機分組表 3.編號及標(biāo)記編號及標(biāo)記（1）染色法。染料有苦味酸酒精飽和液(黃色)、甲基紫酒精飽和液(紫色)或美藍(lán)溶液(藍(lán)色)、0.5中性紅或品紅溶液(紅色)等。具體方法：a.按右上肩、右肋、右后肢、頸部

5、、背中、尾根、左前肢、左肋、左后肢順序分別為1-9號，不染色為10號圖4-1(a)；b.以頭部為1號，按順時針方向依次在右耳、右前肢、右后肢、頸部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢染色，分別為2-10號圖4-1(b) 。 圖4-1大鼠和小鼠染色標(biāo)號法 （2）耳緣孔口法。大、小鼠常用此法。在耳緣不同部位（圖4-2)用針穿孔和剪刀剪口，穿孔和剪口后，用墨黑酒精液涂抹，使其著色，不易脫失。常以右耳代表個位，左耳代表十位?？妆硎?號、2號、3號和10號、20號、30號，一道口為4號、5號、6號和40號、50號、60號，二道口為7號、8號、9號和70號、80號、90號。穿孔和剪口配合，也可編1-99號，

6、不穿不剪為100號。 圖4-2 耳緣孔口標(biāo)號法 （3）烙印法。適用于兔以上的動物。耳部消毒后，用刺數(shù)鉗在動物耳上刺號，再以墨黑酒精液著色。也可用鑄鐵號碼燒紅后烙在動物體表部位，留下標(biāo)記。這種方法可較長時間保留記號，適用于大動物標(biāo)記。（4）號牌法。適用于大動物。將金屬或塑料牌號固定在該動物的耳上或頸下，也可掛在飼養(yǎng)動物的籠上。 （三)抓取和固定方法 1.小鼠 捉拿方法有二種：一種辦法是用右手提起尾部，放在鼠籠蓋或其它粗糙面上，向后上方輕拉，此時小鼠前肢緊緊抓著粗糙表面，輕輕撫摸，使安靜，然后迅速用左手拇指和食指捏住小鼠雙耳和頸背部皮膚，并以小指和手掌尺側(cè)夾持其尾部固定于手中(如圖4-3)；另一種

7、抓法只用左手，先用食指和拇指抓住尾都，再用手掌尺側(cè)及小指夾住尾根，然后用拇指及食指捏住其頸部皮膚。后者適于快速捉拿給藥。 圖4-3 小鼠抓取法 圖4-4 大鼠抓取法2大鼠 基本同小鼠，但大鼠牙齒很尖利，不要突然襲擊式去抓。捉拿時右手慢慢伸向抓鼠尾，盡可能向尾根部靠近，將大鼠放在粗糙面上；左手戴防護手套，抓起其頸背部盡可能多的皮膚并固定其頭部以防咬傷(如圖4-4)。也可將大鼠固定在固定器。注意捉拿時勿用劇烈動作激怒之。3豚鼠 以拇指和中指從豚鼠背部繞到腹下，另一只平托其臀部(如圖4-5)。體重小時可用一只手捉拿，體重大時宜用雙手。4家兔 用右手大把抓住頸背部皮膚，輕輕提起，左手立即托住家兔的臀部

8、或腹部，使其重量移向左手(圖4-6)，這樣既不傷害家兔，也避免兔抓傷人。捉家兔切忌只抓兩耳。圖圖4-5 豚鼠抓取法豚鼠抓取法 圖圖4-6 家兔抓取法家兔抓取法（四四)染毒方法染毒方法 1大、小鼠灌胃法： 使用lmL注射器和灌胃針，用左手拇指和食指捏住大、小鼠兩耳及頭后皮膚，其余手指將大鼠或小鼠的背部皮膚和尾巴壓在手掌間，使其軀干垂直，腹部朝內(nèi)，頭部向上，略有一個傾斜度，固定好后，右手持注射器，將針頭由動物口角插入口腔，避開牙齒，再從舌面沿咽后壁順著吞咽動作徐徐滑入食道下端，遇有阻力時，可輕輕上下左右滑動，一旦感覺阻力消失，即可滑入胃內(nèi)(如圖4-5)。灌胃針插入深度，一般小鼠34cm，大鼠、豚鼠

9、46cm。 2.小鼠腹腔注射法：左手緊握動物，右手將注射針頭從左或右下腹部朝頭部方向插入，針頭與腹壁角度不宜太小，否則易人皮下。針頭插人不宜太深或太近上腹部，以免刺傷內(nèi)臟。(如圖4-6)3.小鼠皮下注射法：可由兩人合作，一人抓住小白鼠，另一人左手捏起背部皮膚，右手持注射器將針頭刺人背部皮下。若熟練，也可一人操作(如圖4-7)。 圖4-5 小鼠灌胃法 圖4-6小鼠腹腔注射法 圖4-7小鼠皮下注射法 4.小鼠尾靜脈注射法：一人抓住小鼠，或?qū)⑿“资笾糜诠潭ㄆ鲀?nèi)，使鼠尾外露，用酒精棉球涂擦，或?qū)⑹笪步?0熱水中0. 5min，使血管擴張。用左手拉住尾尖，選擇一條擴張最明顯、距尾尖1/4處的尾靜脈，右

10、手持帶有4號針頭的注射器刺人血管注射。如注射有阻力，且局部變白，應(yīng)拔出針后，在第一次刺點的上方重新進(jìn)行(如圖4-8)。5.小鼠腦室注射法：由兩人合作，一人固定好小鼠，另一人用眼科鑷提起兩耳連線中間處的皮膚，用手術(shù)剪快速剪去距鑷尖0.3cm處的皮膚，暴露出顱骨。在距冠狀縫和矢狀縫各砰1.5mm左右處，先用小號鐘表改刀(固定刀頭深為2.0mm)在顱骨上穿一小孔，然后將4號或5號針頭垂直插入2-2.5mm，進(jìn)行腦室注射(如圖4-9)。圖4-8 小鼠尾靜脈注射法 圖4-9 小鼠腦室注射法實訓(xùn)三實訓(xùn)三 實驗動物解剖和生物樣實驗動物解剖和生物樣 本采集、制備技術(shù)本采集、制備技術(shù) 一、實訓(xùn)目的一、實訓(xùn)目的實

11、驗動物解剖和生物樣本采集、制備是毒理學(xué)研究中極為重要的基本操作技術(shù)，通過本次實訓(xùn)了解實驗動物的內(nèi)臟形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，掌握實驗動物的處死方法、解剖技術(shù)，能辨認(rèn)內(nèi)部器官、正確分離組織器官；掌握血液采集方法、血清和血細(xì)胞分離技術(shù)，大鼠尿液收集方法、組織勻漿制備技術(shù)。二、儀器和材料二、儀器和材料 (1)實驗動物 成年健康小鼠、大鼠、家兔。 (2)器材 鼠籠，大鼠代謝籠，大、小鼠固定板。手術(shù)剪，鑷子，兒科小骨鉗，塑料離心管(210 mL)，玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑l1.5mm)，注射器(1mL、2mL和5mL)，吸管，滴管，勻漿器。離心機，電子天平。 (3)試劑 抗凝劑(0.5肝素生理鹽水溶液)；溶液(生理鹽水或某

12、種緩沖液)。 (4)其他 碘酒，酒精棉球，干棉球，濾紙。1.采血 (1) 鼠尾采血 (4) 腹主動脈或股動(靜)脈采血 (2) 眼眶靜脈叢采血 (5) 斷頭采血 (3) 摘眼球采血 (6) 心臟采血 實驗動物安全采血量 2血清與血細(xì)胞分離血清與血細(xì)胞分離 (1) 血清的制備 將全血置37溫箱保溫lh，4冰箱中保存34h，以30004000rmin離心15min，取上清液低溫保存?zhèn)溆?。血清呈淡黃色，如呈淡紅色或紅色，表明有溶血，可能影響許多指標(biāo)的測定，一般應(yīng)廢棄。 (2) 血細(xì)胞分離 將血液采集在經(jīng)抗凝劑處理的容器中，混勻，2000rmin離心20min，小心吸出血漿。血漿與紅細(xì)胞之間有一薄層白

13、細(xì)胞，需要時小心吸出置另一離心管中，不需要時可棄去。離心管中的沉淀為紅細(xì)胞，加入等體積生理鹽水，輕輕混勻，使紅細(xì)胞懸浮，再次離心，棄上清液。如此重復(fù)3次，直至上清液無色透明為止，即獲得紅細(xì)胞。白細(xì)胞可依同法洗滌處理。3尿液收集尿液收集 (1) 代謝籠法 適用于大、小鼠，尿液通過代謝籠的大小便分離漏斗與糞便分開。因大、小鼠尿量較少，操作中有損失和蒸發(fā)可造成較大的誤差，故一般要采集5h以上的尿液，取平均值。 (2) 反射排尿法 適用于小鼠，提起小鼠，可反射性排尿。4實驗動物的處死方法 (1) 頸椎脫臼法： 多用于小鼠。 (2) 空氣栓塞法：多用于兔、犬、猴等大動物。 (3) 斷頭法：用于大、小鼠、

14、琢鼠。 (4) 急性放血法：用于大鼠、小鼠。 (5) 擊打法：適用于較小的動物。 (6) 化學(xué)藥物致死法：適用于各種動物。 (8) 其他：電擊法、槍擊法、微波法等。5.5.實驗動物的大體解剖實驗動物的大體解剖 在實驗動物處死后應(yīng)立即解剖，越早越好。小鼠仰放在解剖盤上，用大頭針固定住四肢，提起生殖器前方的皮膚，用剪子剪一小口，沿腹中線剪到頜下，把皮膚向兩邊分離。再剪開下腹部的肌肉，也沿中線剪開肌肉到胸骨下緣，向左側(cè)剪斷肋骨下端后，向前上方剪，直到斷開左邊鎖骨。剪時注意刀尖稍向上挑以免傷及內(nèi)臟。右側(cè)也同樣處理后就可以揭去胸部前壁，這樣就顯示出其內(nèi)部器官自然排列位置。將肝臟和胃向后推可見橫膈，隔開胸

15、腔和腹腔，中央為結(jié)締組織的中央腱，其他部分為膈肌，為哺乳類所特有。觀察心臟跳動情況以及腸蠕動的情況；觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。 依次完整的取出腹腔臟器；胸腔臟器；腎臟和腎上腺；泌尿器官和生殖器官；顱腔臟器并對指定的臟器稱重，并計算臟器系數(shù)。6. 組織病理學(xué)檢查組織病理學(xué)檢查常用部位有心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、睪丸、腸等。對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應(yīng)統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應(yīng)詳細(xì)記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。必要時，請其他的病理學(xué)家對有疑問的或有爭論的發(fā)現(xiàn)進(jìn)

16、行復(fù)查。利用特殊染色、組織化學(xué)及電子顯微鏡技術(shù)研究毒作用機制。 7.組織勻漿的制備 (1) 動物處死 應(yīng)根據(jù)試驗要求選擇合適的方法，如制備肺組織勻漿時不能用斷頭法處死，因易引起肺淤血(2) 臟器制備 動物處死后快速取出所需完整臟器，迅速置冰浴中，用冷生理鹽水洗去血污，必要時用冷生理鹽水灌流以除去血液。剝?nèi)ヅK器外膜，用濾紙吸干臟器表面水分，稱重、定位留取所需組織備用或置冰箱(或液氮)中凍結(jié)保存。(3) 勻漿制備 定量稱取臟器、剪碎，置勻漿機中，按設(shè)計要求加入一定量比例的溶液(生理鹽水、緩沖液、有機溶劑等)，在一定轉(zhuǎn)速下研磨一定時間，有時需在冰浴中研磨，如制備肝勻漿S9上清液或分離細(xì)胞組分，全部操

17、作均應(yīng)在低溫(010)下進(jìn)行四、實訓(xùn)結(jié)果四、實訓(xùn)結(jié)果(1) 數(shù)據(jù)記錄，如下表所示，并計算臟體比（如肝體比、腎體比、脾體比等)。(2) 器官顏色和形態(tài)描述。 實訓(xùn)四實訓(xùn)四 小鼠急性毒性試驗小鼠急性毒性試驗 一、實訓(xùn)目的一、實訓(xùn)目的將外源化學(xué)物經(jīng)口染毒求出LD50是毒理學(xué)研究中重要的基本技術(shù)和基礎(chǔ)工作之一。通過該試驗了解受試物的毒性大小、毒性特點及安全性，掌握改良寇氏法或霍恩氏法的試驗設(shè)計及LD50的計算方法，掌握化學(xué)毒物的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)和評價方法。 二、實訓(xùn)原理二、實訓(xùn)原理急性毒性試驗的原理是動物一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，觀察急性毒性反應(yīng)及其程度，以及中毒死亡的原因及特征，了解受試動

18、物毒性反應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系，求出LD50。三、儀器和材料三、儀器和材料1體重l822g小鼠。 2灌胃針、注射器5套。325mL容量瓶、小燒杯各5個。410mL及l(fā)mL刻度吸管各5個。5飼養(yǎng)籠。6HgCl2粉末四、操作方法及步驟四、操作方法及步驟(一一)改良寇氏法改良寇氏法(Karber) 1本次實驗設(shè)5個劑量組(急性毒性試驗一般設(shè)57個劑量組)，試驗動物隨機分到五組。2確定染毒劑量。經(jīng)預(yù)試驗知到HgCl2的0l00的致死劑量范圍為8210mg/kg。 由r=lg-1(lgblga)/(n-1)，計算得r=2.27式中，r為各組劑量組公比。各組劑量按等比級數(shù)遞增，則各組正式劑量確定為：8，18.

19、2，41.3，93.8，213mgkg。3配制藥液 按20mL/kg體重等容積灌胃。先從高劑量組配制，再按公比稀釋配制各組藥液(CCCCC)。那么C=213mg/kg20mL/kg=10.65mg/mL藥液配制： a.配制25mLC即取HgCl2266.25mg定容至25mL。將C濃度依次釋稀2.27倍。 b.配制C，把C稀釋2.27倍。配制25mLC需C液 M=11mL4.計算每只動物實際灌胃量。每只小鼠實際灌胃量=0.02ml/g該鼠體重g 5. 灌胃。灌胃前應(yīng)禁食4小時，空腹灌入，灌胃后34h再喂食。灌胃方法如實訓(xùn)二所述。若遇動物掙扎，應(yīng)立即停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，絕不可進(jìn)針不順而硬向內(nèi)插，

20、以免損傷或穿破食道或誤入氣管、肺，造成動物立即死亡。立即死亡的，要另補動物。 6觀察記錄表4-9 急性毒性反應(yīng)觀察記錄表7.統(tǒng)計及計算（1）LD50=lg-1Xm-i(P-0.5) 式中 Xm：最大劑量組劑量對數(shù)值；i：相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對數(shù)(相鄰兩組對數(shù)劑量的差值)；P：各組動物死亡率，用小數(shù)表示(如果死亡率為80應(yīng)寫成0.80)；P：各組動物死亡率之總和。（2）SlgLD50=i 式中 SlgLD50：lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤；p: 各組實驗動物死亡率；q:各組實驗動物存活率；n：實驗動物組數(shù)。（3）LD50的95可信限=1g-1(lgLD50士1.96SlgLD50) LD50

21、的平均可信限= LD50士(LD50的95可信限的高限-低限)2 npq五、結(jié)果分析與毒性評價五、結(jié)果分析與毒性評價1.急性毒性分級 對人可能致死的估計量表4-10 外源化學(xué)物急性毒性分級（WHO）2.急性毒性評價 外源化學(xué)物的經(jīng)口LD50 （1）大于10g/kg.bw，安全（2）大于人可能攝入量的10倍，有希望使用，應(yīng)進(jìn)入下一階段試驗（3）在人可能攝入量10倍左右，重復(fù)試驗（4）小于人可能攝入量的10倍，放棄不用3.確定受試物HgCl2的毒性大小和安全性實訓(xùn)五實訓(xùn)五 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 一、實訓(xùn)目的一、實訓(xùn)目的學(xué)習(xí)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核測定方法，

22、了解化學(xué)毒物對骨髓細(xì)胞染色體的損傷作用，掌握骨髓細(xì)胞微核測定的原理和操作方法。二、實訓(xùn)原理二、實訓(xùn)原理l微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，由于比核小得多故稱微核。這種情況的出現(xiàn)往往是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果。另外，也可能在受到紡綞體毒物的作用時，主核沒有能夠形成，代之以一組小核。此時小核往往比一般典型的微核稍大。 三、儀器和材料 (一)試劑 1.甲醇(分析純)。 2.冰醋酸(分析純)。 3.吉姆薩(Giemsa)儲備液：稱取Giemsa染

23、料lg，逐漸加入少許甘油在研缽中研細(xì)溶解，共加入66mL，甘油混勻，于60溫箱中保溫90min，冷卻后再加入66mL甲醇混勻，于室溫中靜置12周，然后過濾，用棕色瓶貯存?zhèn)溆谩?.吉姆薩(Giemsa)應(yīng)用液取Giemsa貯備液1份，加pH6.8的磷酸緩沖液9份，混勻，臨用時配制。 5.小牛血清。 6.pH6.8磷酸鹽緩沖液：取甲液49.5ml,乙液50.5 ml混勻即可。 （1）甲液(即1/15mol/L Na2 HP04)：稱取無水Na2 HP04 9.47g溶于l000mL蒸餾水中(Na2 HP04 ,若含有2、7或l2分子結(jié)晶水時，分別稱取11.87g,17.87g或23.88g)。 （

24、2）乙液(即1/15mol/L KH2P04)：稱取KH2P04 ，9.48g溶于l000mL蒸餾水中。 7. 受試毒物：環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C ( (二二) )器材器材 手術(shù)剪，晾片架，電吹風(fēng)機，2mL注射器及針頭，載玻片及推片，定時鐘，止血鉗，顯微鏡(具油鏡頭)，細(xì)胞計數(shù)器。 四、操作方法與步驟 1.動物選擇：常用的實驗動物為大、小鼠。以小鼠用得最多，要求體重1820g，712周齡。每組l0只左右。2.染毒次數(shù)與取樣時間：采用多次染毒的方案。每天染毒一次，共4d，第5天取樣。這樣，僅取樣一次就能覆蓋2472h高峰，如果高峰延遲到96h也不會漏掉。故推薦以4次染毒后取樣為常規(guī)方案。3.劑量選擇

25、：受試物的最大劑量除因溶解度所限外，應(yīng)達(dá)最大耐受量，或以該化合物的80LD50為最高劑量。在一般情況下，應(yīng)設(shè)45或更多試驗組，劑量水平跨3個以上數(shù)量級。另設(shè)陽性和陰性對照組。4.陽性對照：可用環(huán)磷酰胺(50100mg/kg)或絲裂霉素C(10mg/kg)。腹腔注射一次或二次均可。（二）操作步驟 1.染毒：按確定途徑給動物染毒，同時做陽性及陰性對照 2.涂片：用頸椎脫臼方法處死動物，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕。剖開胸腹部，取下胸骨，剔去肌肉。將胸骨骨髓擠于有一滴小牛血清的載玻片上，推片。 3.固定：將推好晾干的標(biāo)本玻片放入染色缸中用甲醇溶液固定15min，取出晾干。 4.染色：用新鮮配制

26、的l0Giemsa染液(Giemsa原液l份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色l015min。沖洗后晾干。 5.觀察計數(shù)：先在低倍鏡下觀察，選擇分布均勻、染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計數(shù)。PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，一個細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一個或多個微核；NCE呈橘黃色，無核。微核發(fā)生率（）=含微核的PEC數(shù)/觀察的PEC數(shù)1000實訓(xùn)六實訓(xùn)六 小鼠精子畸變試驗小鼠精子畸變試驗 一、實訓(xùn)目的一、實訓(xùn)目的精子畸變試驗是檢測受試化學(xué)毒物能否破壞哺乳動物精子正常形態(tài)的試驗方法，通過本次實驗，了解正常精子和畸變精子的形態(tài)，掌握精子畸變試驗的原理和步驟。二、實訓(xùn)原理二、實訓(xùn)原理 引起精子畸變的原因很多，畸變的機理也

27、無定論。其中一些理引起精子畸變的原因很多，畸變的機理也無定論。其中一些理論認(rèn)為化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致精子形成的有關(guān)基因發(fā)生突變，引起論認(rèn)為化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致精子形成的有關(guān)基因發(fā)生突變，引起精子畸變率增高。精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過程受多種基因精子畸變率增高。精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過程受多種基因控制，當(dāng)這些基因中的任一個基因在化合物的作用下發(fā)生突變，控制，當(dāng)這些基因中的任一個基因在化合物的作用下發(fā)生突變，就會導(dǎo)致精子的畸形率增高。某些特殊的染色體重排，如性就會導(dǎo)致精子的畸形率增高。某些特殊的染色體重排，如性-常常染色體易位，是化合物誘發(fā)精子發(fā)生畸形率增高的主要機理。染色體易位，是化合物誘發(fā)精子發(fā)生畸形率增高的主要機理。但是公認(rèn)精子畸形率增高，并非必然意味著是受試物誘發(fā)突變但是公認(rèn)精子畸形率增高，并非必然意味著是受試物誘發(fā)突變的結(jié)果，某些其他因素，如缺血、變態(tài)反應(yīng)、感染和體溫增高的結(jié)果，某些其他因素，如缺血、變態(tài)反應(yīng)、感染和體溫增高等，亦可能導(dǎo)致精子畸形率增高。等，亦可能導(dǎo)致精子畸形率增高。 三、儀器和材料三、儀器和材料(一一)器材器材手術(shù)剪刀、眼科直頭小鑷子、大鑷子、載玻片、染色缸、晾片板、擦鏡紙、干凈紗布、吸頭滴管、顯微鏡，離心機、離心管等(二二)試劑試劑生理鹽水、甲醇、1伊紅染液。受試毒物：環(huán)磷酰胺或甲基磺酸乙酯。 四、操作方法與步驟四、操作方法與步驟