基因工程的基本操作程序3)

1、 根據(jù)已知蛋白質(zhì)根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的出相應(yīng)的mRNAmRNA序列，序列，然后按照堿基互補(bǔ)配然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合以單核苷酸為原料合成目的基因成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)目的基因目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成（三）化學(xué)方法人工合成目的基（三）化學(xué)方法人工合成目的基因因從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增

2、技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法 用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出口，露出_。 用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個(gè)重組，形成了一個(gè)重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶1.1.過(guò)程過(guò)程: :二、二、構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體 核心

3、核心2.2.基因表達(dá)載體的目的基因表達(dá)載體的目的（1 1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；并可以遺傳給下一代；（2 2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失敗，科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因抗蟲(chóng)基因插入載插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插

4、入啟動(dòng)子啟動(dòng)子( (抗蟲(chóng)基因首端抗蟲(chóng)基因首端) )，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子終止子( (抗蟲(chóng)基因末抗蟲(chóng)基因末端端) )，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力?？瓜x(chóng)能力。 作為基因工程表達(dá)載體，只需作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？么？ 不可以。不可以。 3.3.基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：a a、目的基因、目的基因b

5、 b、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子c c、終止子、終止子d d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因思考思考1： 表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？ （1 1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)；有利于基因的表達(dá)； （2 2）通過(guò)）通過(guò)cDNAcDNA文庫(kù)獲得的目的基因文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。思考思考2：終止子的作用是什么？終止子的作用是什么？ 終止子是位于基因尾端的一段特終止子是位于基因尾端的一段特殊的殊的DNA片

6、斷，能終止片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。 是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。出來(lái)。思考思考3：標(biāo)記基因有什么作用？標(biāo)記基因有什么作用？思考思考4 4：為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；強(qiáng)子等；二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNADNA片段。表片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)終止子三部分

7、結(jié)構(gòu)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞借鑒借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。的途徑。（一）轉(zhuǎn)化：（一）轉(zhuǎn)化： 目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過(guò)程的過(guò)程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)（二）（二）方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞1.1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿

8、菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法基因槍法 花粉管通道法花粉管通道法1.1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1 1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)：特點(diǎn)： 易感染雙子葉植物和裸易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力物沒(méi)有感染能力原理：原理： TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的并整合到受體細(xì)胞染色體的DNADNA上。上。轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)化過(guò)程: :TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因構(gòu)建構(gòu)建表表達(dá)達(dá)載載體體導(dǎo)入導(dǎo)入植植物物細(xì)細(xì)胞胞插入插入植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色染色DNADNA表達(dá)表達(dá)新新性性狀

9、狀轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌 基因槍法又稱微基因槍法又稱微彈轟擊法，是彈轟擊法，是利用壓利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體面的表達(dá)載體DNADNA打打入受體細(xì)胞中入受體細(xì)胞中，使目，使目的基因與其整合并表的基因與其整合并表達(dá)的方法。達(dá)的方法。（2 2）基因槍法）基因槍法（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱頭植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊。穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃诨ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，前，剪去柱頭，然后，

10、滴加滴加DNADNA（含目的基（含目的基因），使目的基因借因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。體細(xì)胞。胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1 1）方法：顯微注射法）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）提純，用顯微儀注射到受精卵中）（2 2）操作程序）操作程序: :提純含目的基因表達(dá)載體提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵取受精卵顯微注射顯微注射移植到子宮移植到子宮受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物常用法：常用法：CaCa2+2+處理處理常用菌：大腸桿菌常用菌：大腸桿菌微生

11、物作受體細(xì)胞原因：微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過(guò)程：過(guò)程：CaCa2+2+處理大處理大腸桿菌腸桿菌感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)載體與感受態(tài)與感受態(tài)細(xì)胞混合細(xì)胞混合感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞吸細(xì)胞吸收收DNADNA3.3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？處理受體細(xì)胞？用用CaCa2 2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性受體生物受體生物 植物植物 動(dòng)物動(dòng)物 微生物微生物受體細(xì)胞受體細(xì)胞導(dǎo)入方法導(dǎo)入方法受精卵受精卵體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵受精卵細(xì)胞細(xì)胞/ /個(gè)體個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注顯微注射技術(shù)射技術(shù)用用CaCa2+2+處理成處理成感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞采用基因工程的方法培育抗蟲(chóng)棉，下列導(dǎo)入目的基因的作法正確采用基因工程的方法培育抗蟲(chóng)棉，下列導(dǎo)入目的基因的作法正確的是（）的是（）A.A.將毒素蛋白注射到受精卵中將毒素蛋白注射到受精卵中B.B.將編碼毒素蛋白的將編碼毒素蛋白的DNADNA序