人類輔助生殖技術(shù)中的胚胎培養(yǎng)與篩選

1、人類輔助生殖技術(shù)中的胚胎培養(yǎng)與挑選人類輔助生殖技術(shù)中的胚胎培養(yǎng)與挑選【關(guān)鍵詞】遼寧沈陽，沈陽204醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心隨著生殖生物學(xué)領(lǐng)域的不斷拓展，人類輔助生殖也相應(yīng)得到了飛速的開展，自世界首例體外受精-胚胎移植(ivf)嬰兒誕生以來1，該技術(shù)已開展了約三十年。但是，盡管ivf已成為目前治療不孕不育的完善方案，其成功率仍然較低。大局部的胚胎死亡似乎發(fā)生在移植前的培養(yǎng)階段，僅有50的體外培養(yǎng)胚胎能在第六天發(fā)育到囊胚階段2，移植后的胚胎發(fā)育為胎兒的比例也缺乏15。為了進(jìn)步妊娠率，將多個(gè)胚胎一同植入時(shí)，卻導(dǎo)致了多胎妊娠率的大幅升高。因此，如何通過改善培養(yǎng)條件、優(yōu)化配子質(zhì)量和開發(fā)新的胚胎挑選技術(shù)以進(jìn)步

2、胚胎種植率一直是輔助生殖實(shí)驗(yàn)室研究人員所關(guān)注的焦點(diǎn)和努力的方向。1胚胎的體外培養(yǎng)在過去的十多年里，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到通過優(yōu)化培養(yǎng)基，可以改善ivf胚胎的體外發(fā)育和胚胎的植入率。通過降低培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度、添加氨基酸和生長因子可以進(jìn)步囊胚形成率和細(xì)胞數(shù)。在ivf胚胎的培養(yǎng)基成分改進(jìn)上，已經(jīng)沒有多大的研究空間。據(jù)報(bào)道，即使使用無葡萄糖培養(yǎng)基來改進(jìn)胚胎質(zhì)量，妊娠率也沒有升高3。人類胚胎在植入前的發(fā)育期間，營養(yǎng)需求的變化為：卵裂早期主要是對(duì)丙酮酸的需要，隨著發(fā)育的進(jìn)展，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟遗咂趯?duì)丙酮酸和葡萄糖都有較高的需要。受精卵在早期發(fā)育階段從輸卵管挪動(dòng)到子宮，發(fā)育所處的體內(nèi)環(huán)境發(fā)生了變化，因此導(dǎo)致了胚胎營養(yǎng)

3、需求的上述變化，也因此促成了囊胚階段培養(yǎng)基和序貫培養(yǎng)基的問世4。隨著這些新型培養(yǎng)基的出現(xiàn)，新的胚胎挑選技術(shù)也接踵而來。2胚胎的挑選2.1植入前胚胎的遺傳學(xué)診斷pgdpgd是在胚胎植入子宮前對(duì)其進(jìn)展遺傳性障礙的診斷。pgd可以降低父母將遺傳性疾病傳給子女的風(fēng)險(xiǎn)。常規(guī)的胎兒診斷是在妊娠1216周，通過絨毛膜絨毛樣本或羊膜穿刺術(shù)對(duì)胎兒進(jìn)展檢查。假如胎兒有遺傳缺陷，夫妻雙方就要考慮終止妊娠。一種替代途徑是，從ivf后的8-細(xì)胞階段胚胎中取出12個(gè)卵裂球，用熒光原位細(xì)胞雜交交融fish或pr對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)展分析，確定有遺傳缺陷的胚胎。只有那些通過pgd檢查無遺傳缺陷的胚胎才能植入子宮，這樣就防止了妊娠終止

4、。第一例通過此項(xiàng)技術(shù)的試管嬰兒出生于1990年5，之后通過pgd檢查出生的安康孩子已超過150個(gè)。fish可以對(duì)處于分裂間期或中期的完好細(xì)胞核中的特殊染色體進(jìn)展檢查，以鑒別胚胎的性別這對(duì)于防止x-染色體的伴性遺傳疾病非常重要和檢查染色體的非整倍性(如dn氏綜合征)和主要的染色體畸形(如染色體易位)6，而用pr技術(shù)擴(kuò)增特殊的基因序列可以對(duì)單個(gè)基因的進(jìn)展檢查5。盡管用于pgd的單細(xì)胞pr診斷具有極高的敏感性，但其準(zhǔn)確性和可靠性仍會(huì)受到擴(kuò)增失敗、污染和等位基因缺失等因素的影響，所以新的pr方法正在被不斷研究評(píng)估當(dāng)中。經(jīng)過有效的pgd循環(huán)，大量的卵母細(xì)胞都需要回收處理，因?yàn)椴⒉皇撬械穆涯讣?xì)胞都會(huì)受精

5、、卵裂，進(jìn)展有效的活體檢查并被確定為適于移植。自從這項(xiàng)技術(shù)被首次應(yīng)用于臨床5，對(duì)人類胚胎的更深化檢查就顯示了胚胎中細(xì)胞間的差異性是普遍存在的，包括相鄰的正常細(xì)胞和異常細(xì)胞。在4日齡的人類胚胎中，約有60%的胚胎含有一個(gè)或多個(gè)雙核細(xì)胞，約40%的胚胎含有染色體異常的細(xì)胞，包括單倍體、多倍體和非整倍體7。這種鑲嵌性對(duì)pgd的準(zhǔn)確性有嚴(yán)重的影響，因?yàn)橥ㄟ^胚胎生物觀察取出的那個(gè)用于分析胚胎的細(xì)胞，并不一定代表胚胎中其余細(xì)胞的狀態(tài)5。許多研究組從8-細(xì)胞胚胎中取2個(gè)細(xì)胞進(jìn)展分析，以加強(qiáng)診斷的可靠性，但是我們應(yīng)該認(rèn)識(shí)到50%以上的pgd都是用于伴性遺傳疾病的診斷，并且是在性別的根底上做診斷。在這種情況下，

6、鑲嵌性不一定會(huì)導(dǎo)致診斷錯(cuò)誤，因?yàn)橐粋€(gè)胚胎只可能是男性或女性，與鑲嵌性無關(guān)?？偟膩碚f，fish使用多探針進(jìn)展檢測(cè)，在分析中一定可以觀察到兩個(gè)x標(biāo)記或一個(gè)y和一個(gè)x標(biāo)記還有一個(gè)用以確定倍性的常染色體標(biāo)記，以準(zhǔn)確診斷性別。用基因產(chǎn)物rna而不是基因本身進(jìn)展胚胎遺傳缺陷診斷的可能性正在研究中。這項(xiàng)研究涉及開發(fā)高靈敏度的rt-pr技術(shù)，應(yīng)用于單個(gè)卵裂球中的rna的分析。目前僅從卵母細(xì)胞胞質(zhì)中取樣而不是整個(gè)卵裂球中獲得足夠確診胚胎缺陷的rna的研究有望獲得成功8，但是，母體卵母細(xì)胞中的rna的存留時(shí)間超過了胚胎基因組啟動(dòng)的時(shí)間，這可能會(huì)對(duì)診斷造成影響，而且相應(yīng)的技術(shù)也尚未成熟。2.2胚胎非整倍性的挑選在妊

7、娠第7周發(fā)生自然流產(chǎn)的病例中，胎兒染色體異常的發(fā)生率60%，顯著高于同期引產(chǎn)胎兒的3%9%的發(fā)生率9。這一發(fā)現(xiàn)提示，胚胎的非整倍性是導(dǎo)致移植失敗進(jìn)而使ivf成功率低的主要原因。在形態(tài)正常的人類體外發(fā)育胚胎中，20%左右患有不同程度的染色體異常，且這種異常導(dǎo)致了植入前胚胎的凋亡，大約70%的凋亡胚胎是異常胚胎7。在試圖進(jìn)步移植率的探究中，進(jìn)展移植前胚胎挑選的可能性越來越引起人們的關(guān)注，尤其是對(duì)那些年齡較大的患者和ivf反復(fù)失敗或習(xí)慣性流產(chǎn)的女性，移植前胚胎挑選更為重要。研究已說明fish技術(shù)結(jié)合胚胎的活體檢查可以顯著進(jìn)步妊娠率10，盡管fish在提供間期細(xì)胞核信息的方面有很大的優(yōu)點(diǎn)，但僅有有限數(shù)

8、量的染色體可以隨時(shí)進(jìn)展分析。因此，目前從細(xì)胞中獲得完好的染色體信息的最有效方法是選取染色體組型最明顯的中期的細(xì)胞核繼續(xù)分析，但到目前為止從單個(gè)卵裂球細(xì)胞獲得中期信息的常規(guī)方法仍有相當(dāng)高的技術(shù)要求，這使得中期的可分析比率非常校然而將卵裂球細(xì)胞與一個(gè)完好的或去核的哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞交融，那么可以在90%的情況下產(chǎn)生明顯的中期11。隨著光譜圖像的進(jìn)步，對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的23條染色體或極體的分析得以實(shí)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)允許對(duì)染色體數(shù)量上和構(gòu)造上的異常進(jìn)展檢查，且無需借助探針，也就省去了復(fù)雜的消費(fèi)特殊化探針的過程。與pgd一樣，上述方法也存在同樣的問題，那就是用于分析的細(xì)胞相對(duì)于整個(gè)胚胎的代表性有多大。近乎40%的

9、人類胚胎存在鑲嵌現(xiàn)象7，即形成含有正常的二倍體卵裂球與異常的非整倍體卵裂球的混合體。這些非整倍體細(xì)胞以后的命運(yùn)還有待進(jìn)一步的研究，因?yàn)樗鼈冊(cè)谂咛グl(fā)育中將在何時(shí)以怎樣的方式被淘汰還不得而知。隨著年齡的增長，卵母細(xì)胞非整倍性的發(fā)生率不斷升高，這被認(rèn)為是造成ivf成功率隨年齡下降的主要原因。因此，對(duì)年齡較大的女性來說，用胚胎遺傳疾病的移植前診斷技術(shù)對(duì)非整倍胚胎進(jìn)展挑選，是很好的進(jìn)步妊娠率的方法。2.3卵母細(xì)胞質(zhì)量的挑選vanblerk等12曾提出小鼠和人類的早期胚胎的發(fā)育活力與線粒體的代謝才能有關(guān)。他們認(rèn)為，胚胎自身的線粒體的復(fù)制要到著床以后才開場(chǎng)，而父本的奉獻(xiàn)又很小，所以植入前胚胎完全依靠母體通過

10、卵母細(xì)胞遺傳下來的線粒體提供能量12。卵母細(xì)胞中tdna的缺失和突變可能會(huì)引起線粒體功能障礙，影響能量消費(fèi)，使卵母細(xì)胞和早期胚胎凋亡，導(dǎo)致染色體片段發(fā)生畸變或胚胎發(fā)育終止12。為了進(jìn)步ivf反復(fù)失敗的女性的卵母細(xì)胞的質(zhì)量，將期的供體卵母細(xì)胞的胞質(zhì)移植到成熟的受體卵母細(xì)胞中，以使發(fā)育不良的卵母細(xì)胞和胚胎恢復(fù)正常的生長才能。hen等13報(bào)道了第一例胞漿移植試管嬰兒的誕生，此后，全世界有30多例胞漿移植試管嬰兒相繼誕生14。但后來有報(bào)道指出，在同系列的17個(gè)胞漿移植胚胎里有2個(gè)胚胎出現(xiàn)染色體組型異常，只有45條染色體，一條x染色體缺失(x0)14，因此，這項(xiàng)技術(shù)的平安性開場(chǎng)引起廣泛重視。而且，發(fā)育中

11、的胚胎應(yīng)該是三個(gè)基因型的組合體，即來自父母的細(xì)胞核遺傳物質(zhì)以及來自供體的局部或全部的線粒體遺傳物質(zhì)。不僅如此，供體卵母細(xì)胞還可能引起tdna的重排，應(yīng)該將這類胚胎淘汰。當(dāng)然，在細(xì)胞核移植和胞漿移植應(yīng)用于常規(guī)的臨床理論以前，還需要做更多的實(shí)驗(yàn)性工作。細(xì)胞核移植的目的也是治療線粒體疾病15，對(duì)于因卵母細(xì)胞質(zhì)缺陷造成反復(fù)性胚胎死亡的女性，可采用細(xì)胞核移植技術(shù)，將其期卵母細(xì)胞的核體取出，植入去核的供體卵母細(xì)胞中，以彌補(bǔ)其細(xì)胞質(zhì)的缺陷。3胚胎的移植進(jìn)步妊娠率的一種途徑就是更準(zhǔn)確地選擇具有發(fā)育潛能的胚胎。一種方法是在ivf后的第2天或第3天進(jìn)展胚胎移植，此時(shí)胚胎處于28細(xì)胞階段。將胚胎按照形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和發(fā)育

12、速率進(jìn)展挑選，挑選發(fā)育最快且形態(tài)最正確的胚胎用于移植。盡管胚胎的形態(tài)與囊胚的形成率以及胚胎的著床有一定的相關(guān)性，但僅憑形態(tài)和發(fā)育速率來挑選胚胎仍是一種不準(zhǔn)確、不理想的方法，因?yàn)閱螒{可視的早期卵裂情況還不能準(zhǔn)確的反映胚胎的繼續(xù)發(fā)育潛能。另一種方法是將胚胎培養(yǎng)56天，形成囊胚后進(jìn)展移植，這樣既能進(jìn)一步的判斷胚胎的發(fā)育潛能，同時(shí)也能保證胚胎與子宮內(nèi)膜之間的同步性。已經(jīng)有研究證實(shí)，染色體異常的早期卵裂期的胚胎發(fā)生凋亡的幾率非常大7，不能順利著床。然而，盡管只有小局部的人類囊胚存在全部染色體異常的情況，但很多囊胚中存在很大比例的異常細(xì)胞，并且容易出現(xiàn)嵌合表達(dá)象16。囊胚移植的臨床妊娠率各中心報(bào)道不一，一

13、般都在45%65%以上4。而一項(xiàng)對(duì)1299例患者的隨機(jī)性雙盲的前瞻性的研究報(bào)道，胚胎在第2天和第5天移植后的妊娠率分別為25%和28%，沒有顯著性差異。huisan等17研究顯示，胚胎在第5天囊胚階段進(jìn)展囊胚移植，每個(gè)胚胎的妊娠率為26%，而在第3天8-細(xì)胞階段移植，妊娠率為18%。在對(duì)大量本地品種的嚙齒動(dòng)物和牛的后代病癥進(jìn)展觀察，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)對(duì)其胚胎的基因表達(dá)和印跡18的影響較大，從而推斷人類胚胎的延期培養(yǎng)對(duì)胎兒和成人安康可能有危害。但是，最近的一項(xiàng)回憶性研究說明，人類胚胎的囊胚培養(yǎng)對(duì)嬰兒的出生重并沒有影響，然而對(duì)后代的性別確有影響，表現(xiàn)為男性胎兒的比例增加19。這可能是由于男性胚胎發(fā)育較快

14、，在對(duì)第5天的囊胚進(jìn)展移植時(shí)，往往選擇發(fā)育較快的胚胎，從而造成了性別比例的失調(diào)。4小結(jié)目前，ivf-et的妊娠率似乎不可能到達(dá)自然受胎率的程度，但是，更好的胚胎挑選技術(shù)的開展仍為到達(dá)自然受孕率帶來了很大希望，在更準(zhǔn)確的判斷和選擇有活力且遺傳正常的胚胎的同時(shí)減少多胎妊娠帶來的生理、心理和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。近20年來，人類輔助生殖技術(shù)的不斷開展，胚胎的體外培養(yǎng)技術(shù)和體外挑選技術(shù)的也不斷完善，這些為進(jìn)步不孕患者的妊娠率和或產(chǎn)率到來了革命性的意義。但在過去的十年中，這些技術(shù)在沒有足夠的動(dòng)物研究做根底的情況下，就被莽撞地用于臨床理論，并試圖獲得妊娠和活產(chǎn)的成功。年齡最大的ivf孩子才二十幾歲，最大的冷凍胚胎

15、和isi孩子也才十幾歲。目前還無法預(yù)知這些新技術(shù)是否會(huì)在將來的時(shí)間內(nèi)對(duì)患者生育才能和人體安康造成不良影響，更無法預(yù)知對(duì)其后代的生育才能和身體安康是否有不良影響。因此，探究一系列完好便捷準(zhǔn)確的胚胎挑選技術(shù)是值得我們輔助生殖工作者所關(guān)注和努力的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1steptep，edardsrg.birthafterthere-iplantatinfahuanebry.lanet，1978，2:366.2hardyk，spanss，bekerd，etal.frelldeathtebryarrest:atheatialdelsfhuanpre-iplantatinebrydevelpent.preedi

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