第5章植物基因工程課件

1、第5章植物基因工程課件第一節(jié) 高等植物的遺傳學(xué)特征一、植物的基本特征二、遺傳操作的簡易性大多數(shù)高等植物具有自我受精的遺傳特征，通常能產(chǎn)生大量的后代；而且借助于如風(fēng)、重力、昆蟲傳播等自然條件，受精范圍廣、速度快、速率高。因此，即便是頻率極低的基因突變和重組實(shí)際，其遺傳后果也易被觀察。三、整株植物的再生性植物損傷后，會(huì)在傷口長出一塊軟組織，稱為愈傷組織。如果將一小片鮮嫩的愈傷組織取下，則這些細(xì)胞便會(huì)持續(xù)生長并分裂成懸浮液。將這些細(xì)胞涂在特定的固體培養(yǎng)基上，就會(huì)長成新的幼芽，并且這些愈傷組織重新分化成葉、根、莖，最終成為整株開花植物。愈傷組織的細(xì)胞分化取決于植物生長素和分裂素的相對(duì)濃度。生長素與分裂

2、素之比高，則根部發(fā)育；植物細(xì)胞通常不能有效地吸收外源DNA，因?yàn)樗鼈兙哂欣w維素構(gòu)成的細(xì)胞壁?？捎美w維素酶處理植物細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，待吸收DNA分子后，經(jīng)過再生，再通過愈傷組織形成培育出整株植物。這項(xiàng)技術(shù)有一定的局限性，即大多數(shù)單子葉農(nóng)作物（如谷類作物）很難從原生質(zhì)再生出完整細(xì)胞。如粳稻只有少數(shù)品種如臺(tái)北309等，可由原生質(zhì)體再生植株，大多數(shù)優(yōu)良的粳稻品種和絕大多數(shù)秈稻品種都難以由原生質(zhì)體再生?？捎迷|(zhì)體再生植株的秈稻品種至今沒有獲得轉(zhuǎn)基因植株。四 、染色體的多倍型很多高等植物擁有比人類更大的基因組，并以多倍體的形式存在。大約三分之二的禾本科植物呈多倍體型，其染色體數(shù)目范圍從24到144不

3、等。這種多倍體植物在組織培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出較高的遺傳不穩(wěn)定性，導(dǎo)致體細(xì)胞變異。第二節(jié)高等植物基因工程的基本概念1.植物基因工程的定義： 利用基因工程技術(shù)，在離體條件下對(duì)生物的DNA進(jìn)行加工，并按照人們的意愿和適當(dāng)?shù)妮d體重新組合，再將重組DNA轉(zhuǎn)入植物體或細(xì)胞內(nèi)，并使其在植物細(xì)胞中表達(dá)，從而生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向創(chuàng)造生物的新性狀，并能穩(wěn)定的遺傳給下代。2.轉(zhuǎn)基因植物的特點(diǎn)： 高產(chǎn)優(yōu)質(zhì) 抗逆性：抗病蟲、抗嚴(yán)寒、抗高溫、抗鹽堿、抗倒伏、抗除草劑植物基因工程的基本路線（1）目的基因的分離（2）將目的基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體（表達(dá)載體）形成重組DNA，載體上有啟動(dòng)子和終止子，還連接一個(gè)編碼特殊蛋白質(zhì)（如熒光蛋白

4、）的標(biāo)記基因（3）利用細(xì)菌繁殖擴(kuò)增重組DNA（4）利用基因槍、農(nóng)桿菌等方法將重組DNA導(dǎo)入目標(biāo)植物的細(xì)胞中。（5）篩選含有外源基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。（6）大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因植物。3.植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型及其特性植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件高效穩(wěn)定的再生能力較高的遺傳穩(wěn)定性具有穩(wěn)定的外植體來源對(duì)選擇抗生素敏感對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性3.1愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)是指外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，并通過分化培養(yǎng)獲得再生植株的受體系統(tǒng)用葉片、幼莖、子葉、胚軸等為外植體。特點(diǎn)： 外植體細(xì)胞經(jīng)歷脫分化和再分化兩個(gè)過程 擴(kuò)繁量大 外植體試材廣泛 該再生系統(tǒng)獲得的再生植株無性系變異較大，

5、轉(zhuǎn)化的外源基因遺傳穩(wěn)定性較差 該再生系統(tǒng)幾乎適用于每一種通過離體培養(yǎng)途徑能再生植株的植物 嵌合體多3.2 直接分化再生系統(tǒng)所謂直接分化再生系統(tǒng)是指外植體細(xì)胞越過脫分化產(chǎn)生愈傷組織階段而直接分化出不定芽獲得再生植株。用葉片、幼莖、子葉、胚軸等為外植體。特點(diǎn)： 獲得再生植株的周期短，操作簡單。體細(xì)胞無性系變異小。較多的嵌合體轉(zhuǎn)化頻率低于愈傷組織再生系統(tǒng)3.3 原生質(zhì)體再生系統(tǒng)特點(diǎn)：原生質(zhì)體被除去了細(xì)胞壁這一天然屏障，能夠直接高效的攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，甚至細(xì)胞核。通過原生質(zhì)體培養(yǎng)，細(xì)胞分裂可形成基因型一致的細(xì)胞克隆，嵌合體少。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)易于在相對(duì)均勻和穩(wěn)定的同等控制條件下進(jìn)行準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)

6、化和鑒定。原生質(zhì)體培養(yǎng)用期長、難度大、再生頻率低。遺傳變異大，遺傳穩(wěn)定性更差。3.4 胚狀體再生系統(tǒng)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指二倍體或單倍體細(xì)胞在未經(jīng)性細(xì)胞融合的情況下，模擬有性合子胚胎發(fā)生的各個(gè)階段而發(fā)育形成的一個(gè)新的個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過程。經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生而形成的在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)，稱之為體細(xì)胞胚或胚狀體。特點(diǎn)： 胚狀體是由具有卵細(xì)胞特性的胚性細(xì)胞發(fā)育而來，這些胚性細(xì)胞具有很強(qiáng)的接受外源DNA的功能轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率均高。 多數(shù)單細(xì)胞起源，嵌合體少。 胚狀體具有兩極性，即在發(fā)育過程中同時(shí)可分化出芽和根形成完整植株，這樣減少了不定芽發(fā)育途徑中比較困難的一個(gè)環(huán)節(jié)生根培養(yǎng)。 利用轉(zhuǎn)基因的胚

7、狀體可以生產(chǎn)人工種子。 體細(xì)胞胚成苗快、數(shù)量大有利于生產(chǎn)和推廣。3.5 生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)利用植物自身的生殖過程，以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱之為生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)，也稱之為種質(zhì)系統(tǒng)。兩個(gè)途徑利用生殖細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化：一、利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞或愈傷組織，進(jìn)一步分化發(fā)育成單倍體植株，以此為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。二、直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。特點(diǎn)： 有更強(qiáng)的接收外源DNA的能力。 能使轉(zhuǎn)基因充分表達(dá)，而且通過加倍后即可成為純合二倍體，加速純化過程。 利用植物自身的授粉過程操作方便。利用該受體系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化受到季節(jié)的限制。無性繁

8、殖的植物不宜采用。4 植物表達(dá)載體的組成特點(diǎn)植物基因表達(dá)載體的主要功能是在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因（大多數(shù)是以Ti質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的）：啟動(dòng)子、終止子、T-DNA序列、內(nèi)含子序列、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因啟動(dòng)子：按其功能分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子：外源基因在其調(diào)控下，表達(dá)大體恒定在一定水平，在不同組織部位沒有明顯差異，沒有時(shí)空特異性。如：Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因（nos）啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，可大幅度提高外源基因的表達(dá)水平。如：光、熱和創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。組織特異性啟動(dòng)子：該啟動(dòng)子控制的基因只發(fā)生在特定器官或組織部位，并表現(xiàn)出受發(fā)

9、育過程調(diào)控的特性。典型例子如：馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動(dòng)子，只在塊莖中表達(dá)。終止子：TGA和TAA不同來源的終止子對(duì)外源基因的表達(dá)有很大的影響，它不僅決定外源基因的轉(zhuǎn)錄活性，也決定mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性，從而影響mRNA的翻譯。T-DNA序列：構(gòu)建表達(dá)載體的一個(gè)關(guān)鍵元件T-DNA序列進(jìn)入受體植物細(xì)胞后有兩種命運(yùn)：內(nèi)含子序列真核基因常被一個(gè)或數(shù)個(gè)內(nèi)含子分隔，轉(zhuǎn)錄后的前提mRNA經(jīng)剪切后變?yōu)槌墒斓膍RNA.研究表明內(nèi)含子與基因表達(dá)有很大關(guān)系，它促進(jìn)基因的表達(dá)是通過增強(qiáng)活性mRNA含量，從而有利于基因的表達(dá)。所以構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可根據(jù)不同基因類型，有選擇的插入內(nèi)含子序列。選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因選擇

10、標(biāo)記基因：是在選擇壓力下將轉(zhuǎn)化體篩選出來，因此它實(shí)際上是一種未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抑制劑，但它對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長和分化不影響。報(bào)告基因：報(bào)告和識(shí)別作用，它的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)植物無毒性，它反映外源基因在植物細(xì)胞中的翻譯水平。如：細(xì)菌和螢火蟲的熒光素酶；綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入熒光素酶的煙草提高外源基因在植物細(xì)胞中表達(dá)效率的策略1.構(gòu)建高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化載體選擇合適的啟動(dòng)子（如組織特異性啟動(dòng)子、強(qiáng)啟動(dòng)子）構(gòu)建完整的基因表達(dá)調(diào)控序列-轉(zhuǎn)錄和翻譯合理插入內(nèi)含子-提高外源基因的表達(dá)2.防止外源基因失活在某些情況下外源基因表現(xiàn)為基因沉默。造成沉默的原因很多。它可能與基因的重復(fù)拷貝、DNA甲基化、染色體結(jié)構(gòu)重拍和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不穩(wěn)定等有關(guān)。

11、在基因工程中，分離單拷貝的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，構(gòu)建含有核基質(zhì)支架附著區(qū)的轉(zhuǎn)化載體，根癌農(nóng)桿菌TI質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化1.外植體的選擇選擇具有分裂能力（S期）的細(xì)胞。以葉片、子葉、胚軸為首選外植體材料選擇幼年的外植體以幼胚、體細(xì)胞胚及成熟胚作為外植體時(shí)應(yīng)考慮其轉(zhuǎn)化的最佳感受期?；蜣D(zhuǎn)化外植體和組織培養(yǎng)外植體的選擇基本一致。感受態(tài)細(xì)胞在外植體的部位。2.誘導(dǎo)物的使用方法誘導(dǎo)物（誘導(dǎo)Vir基因）加入的時(shí)間在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)時(shí)加入誘導(dǎo)劑，加入時(shí)間一般在制備工程菌液浸染液使用前4-6小時(shí)加入。誘導(dǎo)物加在農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。3.農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)接種菌體后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽分化的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分裂、生長的同時(shí)，農(nóng)桿菌在外植體切口面也增值生長，該兩者共同培養(yǎng)過程稱之共培養(yǎng)最佳共培養(yǎng)的時(shí)間細(xì)胞調(diào)節(jié)期：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，并不侵入到植物細(xì)胞中去，而是把T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，